يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة معممة لتحديد تكوين حمض الفينوليك القابل للذوبان الحر والقدرة المضادة للأكسدة للحبوب والبقوليات

7.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62467

⸱

يونيو 10, 2022

 ,  , 
1Department of Food and Human Nutritional Sciences, University of Manitoba, 2Richardson Centre for Functional Foods and Nutraceuticals, University of Manitoba

في هذه المقالة

ملخص

الأحماض الفينولية هي مواد كيميائية نباتية مهمة موجودة في الحبوب الكاملة. أنها تمتلك خصائص نشطة بيولوجيا مثل وظائف الحماية المضادة للأكسدة. يهدف هذا العمل إلى الإبلاغ عن طريقة معممة لتحديد HPLC ، وتقدير إجمالي محتوى الفينول ، وتحديد القدرة المضادة للأكسدة للأحماض الفينولية في الحبوب والبقوليات.

الملخص

الأحماض الفينولية هي فئة من المركبات العضوية التي تحمل كلا من مجموعة الفينول ومجموعة كربوكسيلية. توجد في الحبوب وتتركز في نخالة الحبوب أو معطف بذور البقوليات. لديهم خصائص مضادة للأكسدة التي ولدت الكثير من الاهتمام البحثي في السنوات الأخيرة ، حول وظائفهم الصحية الوقائية المضادة للأكسدة المحتملة. يقدم هذا العمل طريقة معممة لاستخراج الأحماض الفينولية القابلة للذوبان الحرة من الحبوب الكاملة وتحليل قدرتها المضادة للأكسدة. تم استخدام خمس عينات من الحبوب الكاملة تتكون من حبوبين (القمح والذرة الصفراء) وثلاث بقوليات (حبوب اللوبيا والفاصوليا الكلوية وفول الصويا). تم طحن الحبوب إلى دقيق واستخراج الأحماض الفينولية القابلة للذوبان الحرة باستخدام الميثانول المائي. ثم تم تحديد المركبات باستخدام كروماتوغراف سائل عالي الضغط (HPLC). تم استخدام طريقة Folin-Ciocalteu لتحديد محتواها الفينولي الكلي بينما تم تحديد قدراتها المضادة للأكسدة باستخدام قدرة الكسح الجذري DPPH ، وقدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox (TEAC) وقدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC). وشملت الأحماض الفينولية التي تم تحديدها أحماض الفانيليك والكافيين والكوماريك والفيروليك. تم تحديد حمض الفانيليك فقط في اللوبيا بينما تم تحديد حمض الكافيين فقط في حبوب الكلى. تم تحديد حمض p-Coumaric في الذرة الصفراء واللوبيا وفول الصويا ، في حين تم تحديد حمض الفيروليك في جميع العينات. كان حمض الفيروليك هو حمض الفينوليك السائد الذي تم تحديده. انخفض التركيز الكلي للأحماض الفينولية في العينات بالترتيب التالي: فول الصويا > اللوبيا > الذرة الصفراء = الفاصوليا الكلوية > القمح. انخفضت القدرة الكلية المضادة للأكسدة (مجموع قيم اختبارات DPPH و TEAC و ORAC) على النحو التالي: فول الصويا > والفاصوليا > الذرة الصفراء = حبة اللوبيا > القمح. خلصت هذه الدراسة إلى أن تحليل HPLC بالإضافة إلى اختبارات DPPH و TEAC و ORAC توفر معلومات مفيدة حول تكوين حمض الفينول والخصائص المضادة للأكسدة للحبوب الكاملة.

المقدمة

الأحماض الفينولية هي من بين أهم المواد الكيميائية النباتية التي تمت دراستها في النباتات بسبب الدور الحيوي الذي تلعبه في الدفاع عن النبات ضد العدوى العاشبة والفطرية ، وكذلك الحفاظ على الدعم الهيكلي والسلامة في الأنسجة النباتية 1,2. فهي وفيرة في نخالة الحبوب ومعطف البذور من البقوليات3. من الناحية الهيكلية ، يتم تقسيمها إلى مجموعتين: أحماض هيدروكسي بنزويك (الشكل 1) وأحماض الهيدروكسي سيناميك (الشكل 2). تشمل أحماض الهيدروكسي بنزويك الشائعة في الحبوب والبقوليات أحماض الجاليك و p-hydroxybenzoic و 2,4-dihydroxybenzoic و protocatechuic و vanillic و syringic ، في حين أن أحماض الهيدروكسي سيناميك الشائعة تشمل أحماض الكافيك و p-coumaric و ferulic و sinapic3. تمتلك الأحماض الفينولية أيضا خصائص مضادة للأكسدة لأنها قادرة على مسح الجذور الحرة ، والتي تسبب التزنخ التأكسدي في الدهون ، وبدء ونشر الإجهاد التأكسدي الناجم عن الجذور في الأنظمة الفسيولوجية 4,5. بسبب هذا الدور الفسيولوجي الحيوي كمضادات للأكسدة ، فهي موضوع بحث حديث. هذا لأنه عند استهلاكها كمكونات للأطعمة النباتية ، يمكنها ممارسة حماية مضادة للأكسدة.

الحبوب ومنتجات الحبوب هي مصادر غذائية رئيسية للكربوهيدرات للبشر والحيوانات في جميع أنحاء العالم6. وتشمل الحبوب القمح والأرز والذرة (الذرة) والشعير والتريتيكال والدخن والذرة الرفيعة. ومن بين هذه الذرة، الذرة هي الأكثر استخداما، حيث يقدر الاستخدام العالمي بنحو 1,135.7 مليون طن في 2019/2020، يليها القمح مع استخدام عالمي يقدر بنحو 757.5 مليون طن خلال نفس الفترة7. تعد أطعمة الحبوب مصادر رائعة للطاقة للمستهلكين لأنها مصادر غنية بالكربوهيدرات. كما أنها توفر بعض البروتين والدهون والألياف والفيتامينات والمعادن6. بالإضافة إلى قيمتها الغذائية ، تعد الحبوب مصادر جيدة لمضادات الأكسدة الكيميائية النباتية ، وخاصة الأحماض الفينولية ، والتي لديها القدرة على حماية النظام الفسيولوجي من الأضرار التأكسدية الناجمة عن الجذور3. البقوليات هي أيضا مصادر جيدة للمغذيات وهي عموما أعلى في البروتين من الحبوب. كما أنها تحتوي على الفيتامينات والمعادن وتستخدم في إعداد الأطعمة المختلفة8. بالإضافة إلى ذلك ، البقوليات هي مصادر جيدة لمجموعة متنوعة من مضادات الأكسدة الكيميائية النباتية ، بما في ذلك الأحماض الفينولية ، والفلافونويد ، والأنثوسيانين ، والبروانثوسيانيدينات9،10. قد يكون لأنواع مختلفة من الحبوب والبقوليات تركيبة حمض فينولية مختلفة. لذلك هناك حاجة لدراسة تكوين حمض الفينوليك للحبوب والبقوليات وأصنافها ، من أجل معرفة فوائدها الصحية المحتملة فيما يتعلق بمضادات الأكسدة الفينولية.

تم الإبلاغ عن عدد من الفحوصات لقياس كمية الأحماض الفينولية في الحبوب والبقوليات ، وتحديد أنشطتها المضادة للأكسدة. الطرق الأكثر شيوعا لتحليل الأحماض الفينولية للحبوب الكاملة هي قياس الطيف الضوئي والكروماتوغرافيا السائلة11. كان الهدف من هذا العمل هو إظهار طريقة كروماتوغرافية سائلة معممة عالية الضغط لتحديد تكوين حمض الفينول القابل للذوبان الحر ، وطرق الطيف الضوئي لتحديد المحتوى الفينولي الكلي والقدرة المضادة للأكسدة لبعض الحبوب الكاملة والبقوليات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. نوع العينات

  1. استخدم خمس عينات من الحبوب الكاملة ، تتكون من حبوبين (على سبيل المثال ، القمح القاسي والذرة الصفراء) وثلاث بقوليات (على سبيل المثال ، حبوب اللوبيا Blackeye وفول الصويا والفاصوليا الحمراء الكلوية) لهذه الدراسة.
  2. طحن 50 غرام من كل حبة في ثلاثة أضعاف في الدقيق ، وذلك باستخدام مطحنة القهوة ، وتمريرها من خلال غربال 500 ميكرومتر.
  3. تخزينها في -20 درجة مئوية.

2. إعداد العينات

  1. تحديد محتوى المادة الجافة والتعبير عن أساس الوزن الجاف
    ملاحظة: حدد محتوى المادة الجافة لكل عينة مسحوقة وفقا لطريقة AOAC (2000)12.
    1. قم بتشغيل فرن حراري قسري واضبط درجة الحرارة على 130 درجة مئوية.
    2. مجفف جاف (هلام السيليكا) في الفرن لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ونقل هلام السيليكا المجفف إلى مجفف.
    3. وزن 2 غرام من كل عينة بدقة في علبة ألومنيوم نظيفة ومجففة مسبقا وموزونة.
    4. جفف العينات الموزونة عند 130 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في فرن حراري قسري.
    5. انقل العينة المجففة إلى المجفف واتركها تبرد إلى درجة الحرارة المحيطة.
    6. وزن العينة المجففة والمبردة وتسجيل وزنها.
    7. احسب محتوى المادة الجافة لكل عينة على النحو التالي:
      figure-protocol-1
    8. عبر عن كل معلمة تم قياسها على أساس الوزن الجاف باستخدام الصيغة التالية:
      figure-protocol-2
  2. استخراج حمض الفينوليك
    ملاحظة: استخراج المركبات الفينولية الحرة القابلة للذوبان في عينات الحبوب باستخدام تعديل طريقة Y. Qiu et al.5 التي تمكن من استخراج الفينول من كميات ملليغرام من الحبوب الكاملة.
    1. يزن بدقة 100 ملغ من عينة دقيق الحبوب الكاملة مباشرة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 2 مل بلون العنبر. يساعد اللون الداكن للأنبوب على منع تعرض الخليط للضوء.
    2. أضف 1 مل من الميثانول المائي من الدرجة HPLC بنسبة 80٪ إلى كل من الأنابيب التي تحتوي على العينات.
    3. دوامة لفترة وجيزة لخلط محلول الميثانول والعينات.
    4. سونيك العينات لمدة 60 دقيقة لاستخراج المركبات الفينولية القابلة للذوبان الحرة. ضع غطاء فوق العينات طوال مدة الصوتنة لمزيد من الحماية من الضوء.
    5. بعد الصوتنة ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 20000 × جم لمدة 5 دقائق لترسيب المخلفات الصلبة تاركا السوبرناتانت في الأعلى. ستكون المركبات الفينولية الحرة موجودة في supernatant بعد الطرد المركزي.
    6. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف.
      ملاحظة: يجب تصفية المادة الفائقة قبل حقنها في جهاز HPLC. لتصفية supernatant ، قم بإزالة مكبس حقنة 3 مل وإرفاق مرشح حقنة. يجب ألا يزيد حجم المسام عن 0.22 ميكرومتر.
    7. ماصة حوالي 0.4 مل من supernatant في الجزء العلوي من حقنة. أعد إدخال المكبس وادفع السائل عبر الفلتر إلى قارورة HPLC تحتوي على إدخال قارورة.
    8. بمجرد إعداد الأداة لتشغيل الطريقة الموضحة في المخطوطة لتحليل HPLC ، قم بتحميل القوارير في الدوار لتتوافق مع قائمة العينات.
    9. احصل على كروماتوغرام HPLC عند 320 نانومتر و 280 نانومتر تظهر قمم متميزة تمثل مركبات فينولية مختلفة.
    10. باستخدام منحنيات قياسية مناسبة ، قم بقياس أحماض الهيدروكسي سيناميك عند 320 نانومتر نظرا لأن لديها أقصى امتصاص عند هذا الطول الموجي. وفقا لنفس المبدأ ، حدد كمية أحماض الهيدروكسي بنزويك عند 280 نانومتر.
    11. تخزين المستخلصات المتبقية في -20 درجة مئوية للتحليلات الأخرى.

3. تكوين الفينول

  1. استخدم كروماتوغراف سائل عالي الضغط (جدول المواد) لتحديد المركبات الفينولية المستخرجة في العينات وقياسها كميا ، استنادا إلى طريقة J. Xiang و F.B. Apea-Bah و V. U. Ndolo و M.C. Katundu و T. Beta 4.
  2. إعداد معايير حمض الفينوليك (حمض الفانيليك ، حمض الكافيين ، حمض p-coumaric ، حمض الفيروليك ، وحمض sinapic) لتحديد وقياس المركبات الفينولية المكونة في المستخلصات.
  3. للقيام بذلك ، يزن 1 ملغ من كل معيار ويذوب في 1 مل من الميثانول المائي بنسبة 50٪ لإنتاج 1000 ميكروغرام / مل من كل معيار.
  4. امزج كميات متساوية من جميع المعايير الخمسة في أنبوب طرد مركزي كهرماني سعة 2 مل لإنتاج مزيج من المعايير ، كل منها بتركيز 200 ميكروغرام / مل.
  5. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية للكوكتيل القياسي عن طريق أخذ حجم في أنبوب جديد وتخفيفه بحجم متساو من مذيب الميثانول المائي.
  6. كرر التخفيفات التسلسلية وصولا إلى تركيز 3.125 ميكروغرام / مل.
  7. أيضا ، قم بتخفيف كل معيار بشكل منفصل 40 مرة باستخدام المذيب للحصول على تركيز 25 ميكروغرام / مل لكل معيار.
  8. اضبط درجة حرارة العمود على 35 درجة مئوية ودرجة حرارة فرن العينة على 15 درجة مئوية.
  9. لإعداد المرحلة المتنقلة A (0.1٪ من حمض الفورميك المائي) ، انقل 1 مل من حمض الفورميك إلى قارورة حجمية بسعة 1 لتر وأضف ماء من فئة HPLC إلى علامة 1 لتر. يرج جيدا حتى يمتزج.
  10. لإعداد المرحلة المتنقلة B (0.1٪ من حمض الفورميك في الميثانول) ، انقل 1 مل من حمض الفورميك إلى قارورة حجمية بسعة 1 لتر وأضف الميثانول من فئة HPLC إلى علامة 1 لتر. يرج جيدا حتى يمتزج.
  11. اضبط وحدات التخزين على علامة 1 لتر إذا لزم الأمر.
  12. قم بتصفية كلتا المرحلتين المتنقلتين من خلال ورق ترشيح محب للماء بسعة 0.45 ميكرومتر.
  13. للتحليل ، قم بحقن 10 ميكرولتر من كل مستخلص أو معيار (معايير 25 ميكروغرام / مل والكوكتيلات القياسية) في عمود الطور العكسي.
  14. Elute مع المراحل المتنقلة وفقا لبرنامج التدرج الخطي لمدة 25 دقيقة على النحو التالي: 0-3.81 دقيقة ، 9٪ -14٪ B ؛ 3.81-4.85 دقيقة ، 14٪ -15٪ ب ؛ 4.85-5.89 دقيقة ، 15٪ -15٪ B ، 5.89-8.32 دقيقة ، 15٪ -17٪ B ؛ 8.32-9.71 دقيقة ، 17٪ -19٪ ب ؛ 9.71-10.40 دقيقة ، 19٪ -19٪ ب ؛ 10.40-12.48 دقيقة ، 19٪ -26٪ ب ؛ 12.48-13.17 دقيقة ، 16٪ -28٪ ب ؛ 13.17-14.21 دقيقة ، 28٪ -35٪ ب ؛ 14.21-15.95 دقيقة ، 35٪ -40٪ ب ؛ 15.95-16.64 دقيقة ، 40٪ -48٪ ب ؛ 16.64-18.37 دقيقة ، 48٪ -53٪ ب ؛ 18.37-22.53 دقيقة ، 53٪ -70٪ ب ؛ 22.53-22.88 دقيقة ، 70٪ -90٪ ب ؛ 22.88-25.00 دقيقة، 90٪ ب.
  15. قارن أوقات الاحتفاظ بالقمم الكروماتوغرافية التي تم الحصول عليها للمعايير الأصيلة للتركيزات 25 ميكروغرام / مل ، عند 280 نانومتر و 320 نانومتر ، مع أوقات المستخلصات ، من أجل تحديد المركبات الفينولية المكونة في العينات.
  16. منحنيات معايرة المؤامرة للكوكتيلات القياسية للحمض الفينولي ، مع تركيز المعايير على المحور الأفقي ، ومنطقة الذروة على المحور الرأسي
  17. استخدم منحنيات المعايرة لتقدير تركيزات المركبات الفينولية المحددة ، من خلال مقارنة مناطق الذروة على قطعة الأرض مع مناطق المركبات المحددة عند 280 نانومتر و 320 نانومتر كما هو مذكور في القسم السابق.

4. إجمالي المحتوى الفينولي

ملاحظة: حدد إجمالي المحتوى الفينولي للمستخلصات باستخدام طريقة فولين-سيوكالتيو التي وصفها F.B. Apea-Bah et al.13.

  1. إعداد معايير حمض الفيروليك وحمض الغال ضمن نطاق تركيز من 0.025 إلى 0.150 ملغم / مل لرسم منحنيات المعايرة بالمقارنة ، لتقدير إجمالي المحتوى الفينولي.
  2. للقيام بذلك ، يزن بدقة 1 ملغ لكل من معايير حمض الفيروليك وحمض الغال في أنابيب طرد مركزي بسعة 2 مل.
  3. أضف 1 مل من الميثانول المائي بنسبة 50٪ إلى كل معيار ودوامة تذوب ، مما ينتج عنه مخزون 1 مجم / مل من كل معيار.
  4. إعداد سلسلة من التخفيفات من كل محلول مخزون في ما مجموعه 500 ميكرولتر.
  5. ماصة 18.2 ميكرولتر من كل مستخلص أو قياسي في بئر منفصل على صفيحة صغيرة من 96 بئرا.
  6. أضف 36.4 ميكرولتر من كاشف Folin-Ciocalteu المائي بنسبة 10٪ (v / v) إلى كل مستخلص أو معيار.
  7. ثم أضف 145.4 ميكرولتر من كربونات الصوديوم 700 مللي متر إلى كل خليط تفاعل.
  8. احتضن مخاليط التفاعل في الظلام في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة.
  9. اقرأ الامتصاص على قارئ microplate عند 750 نانومتر.
  10. رسم منحنيات معايرة التغير في الامتصاص مقابل تركيز معايير حمض الفينوليك واستخدامها لتقدير إجمالي محتويات الفينول.
  11. عبر عن النتائج على أنها مكافئات حمض الفيروليك الملليغرام لكل غرام من العينة المطحونة (mg FAE / g) ومعادلات حمض الغاليك الملليغرام لكل غرام من العينة المطحونة (mg GAE / g) على أساس الوزن الجاف.

5. مقايسات مضادات الأكسدة

ملاحظة: تحديد القدرة المضادة للأكسدة لمستخلصات الحبوب باستخدام الفحوصات الثلاثة التالية: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) قدرة الكسح الجذرية. 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) قدرة الكسح الجذري ، والتي تسمى أيضا قدرة مضادات الأكسدة المكافئة Trolox (TEAC) ؛ وقدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC).

  1. إعداد معايير ترولوكس للمنحنيات القياسية
    1. استخدم Trolox ، وهو تناظرية قابلة للذوبان في الماء من فيتامين E ، كمعيار لتقدير قدرة مضادات الأكسدة في المختبر لمستخلصات الحبوب الكاملة.
    2. يزن بدقة 1 ملغ من Trolox في أنبوب 15 مل. يذوب في 4 مل من الميثانول المائي 50٪. دوامة تذوب لإعداد محلول مخزون من 1 mM (1000 μM).
    3. قم بإعداد ستة تركيزات من Trolox ، أي 50 و 100 و 200 و 400 و 600 و 800 ميكرومتر لرسم منحنيات قياسية لتقدير قدرة الكسح الجذري DPPH وقدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox (TEAC). وبالمثل ، قم بإعداد تركيزات 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكرومتر من Trolox لتقدير قدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC). تشكل الحجم الإجمالي لكل تركيز إلى 500 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول 1.
  2. تخفيف مستخلصات العينات
    1. تمييع مقتطفات العينة مع الميثانول قبل التحليل. هنا ، تم تخفيف مستخلصات الذرة الصفراء واللوبيا مرتين ، وتم تخفيف القمح والفاصوليا الكلوية خمس مرات بينما تم تخفيف مستخلص فول الصويا 10 مرات بالميثانول.
  3. ترولوكس ما يعادل قدرة مضادات الأكسدة (TEAC) فحص
    1. قم بقياس قدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox (TEAC) للعينات باستخدام الطريقة الموضحة سابقا بواسطة F.B. Apea-Bah et al.14.
    2. يزن 8.23 ملغ من ABTS في أنبوب طرد مركزي كهرماني نظيف بسعة 2 مل.
    3. بعد ذلك ، يزن 1.62 ملغ من كبريتات البوتاسيوم في أنبوب طرد مركزي كهرمان آخر بسعة 2 مل.
    4. أضف 1 مل من الماء المقطر إلى كل منها ودوامة لإذابتها.
      ملاحظة: ينتج عن ذلك محلول مخزون ABTS 16 mM مع محلول بيرسلفات البوتاسيوم المائي 6 mM.
    5. تحضير محلول مخزون ABTS عن طريق خلط محاليل ABTS وبيرسلفات البوتاسيوم بكميات متساوية. سوف يتغير الحل على الفور إلى لون داكن.
    6. احتضن خليط الكاشف في الظلام لمدة 12-16 ساعة.
    7. قم بتخفيف محلول مخزون ABTS 30 مرة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سعة 200 ملليمتر ، لتشكيل حل عمل ABTS. للقيام بذلك ، أضف 58 مل من 200 mM PBS إلى 2 مل من حل مخزون ABTS. سيحتوي حل العمل على 0.27 mM ABTS و 0.1 mM بيرسلفات البوتاسيوم.
    8. للتحليل ، ضع 10 ميكرولتر من كل مستخلص مخفف أو Trolox في صفيحة صغيرة من 96 بئرا.
    9. أضف 190 ميكرولتر من محلول عمل ABTS إلى كل بئر واحتضن مخاليط التفاعل لمدة 60 دقيقة.
    10. قياس امتصاص مخاليط التفاعل عند 750 نانومتر في قارئ الصفائح الدقيقة.
    11. استخدم معايير Trolox بتركيز يتراوح من 100 إلى 800 ميكرومول / لتر لرسم منحنى المعايرة.
    12. تقدير قدرة الكسح الجذري ABTS من منحنى المعايرة.
    13. عبر عن النتائج على أنها مكافئات ميكرومول ترولوكس لكل عينة غرام (ميكرومول TE / g) على أساس الوزن الجاف.
  4. فحص DPPH
    ملاحظة: تحديد قدرة الكسح الجذري DPPH للعينات باستخدام الطريقة الموصوفة سابقا من قبل F.B. Apea-Bah et al.13. يتطلب فحص DPPH المضاد للأكسدة مركبا مولدا للجذور ، DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).
    1. يزن بدقة 1.2 ملغ من DPPH في أنبوب طرد مركزي فارغ بسعة 50 مل. قم بإذابة DPPH في 30 مل من الميثانول لإعداد محلول ميثانول 60 ميكرومول / لتر.
      ملاحظة: يختبر فحص DPPH قدرة مستخلصات العينة على مسح الجذور الحرة التي تنتجها DPPH.
    2. للتحليل ، أضف 5 ميكرولتر من مستخلصات العينة أو محلول Trolox في آبار الصفائح الدقيقة.
    3. بعد ذلك ، أضف 195 ميكرولتر من محلول الميثانول DPPH 60 ميكرومول / لتر واحتضنه لمدة 60 دقيقة.
    4. قياس امتصاص خليط التفاعل عند 515 نانومتر.
    5. استخدم معايير Trolox (50-800 ميكرومول / لتر) لرسم منحنى المعايرة ، مع التغير في الامتصاص على المحور الرأسي وتركيزات Trolox على المحور الأفقي.
    6. تقدير قدرة الكسح DPPH من منحنى المعايرة.
    7. عبر عن النتائج على أنها مكافئات ميكرومول ترولوكس لكل عينة غرام (ميكرومول TE / g) على أساس الوزن الجاف.
  5. قدرة امتصاص الأكسجين الجذرية
    1. تحديد قدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC) للعينات استنادا إلى طريقة F.B. Apea-Bah et al.13.
    2. للبدء ، قم بإعداد معايير Trolox للتركيزات 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكرومتر من محلول مخزون قياسي 1000 ميكرومتر Trolox في المخزن المؤقت 75 mM فوسفات البوتاسيوم (K 2 HPO4 / KH2PO4).
    3. للقيام بذلك ، يزن 1 ملغ من مسحوق Trolox ويذوب في 4 مل من محلول المخزن المؤقت تحت الصوتنة لإعداد محلول مخزون 1000 ميكرومتر.
    4. بعد ذلك ، خذ 50 ميكرولتر من محلول المخزون في أنبوب طرد مركزي بسعة 2 مل وقم بتخفيفه باستخدام 950 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت للحصول على 1000 ميكرولتر من محلول Trolox 50 ميكرومتر.
    5. ماصة 500 ميكرولتر من محلول 50 ميكرومتر في أنبوب جديد وتمييع مع حجم متساو من المخزن المؤقت للحصول على محلول Trolox 25 ميكرومتر.
    6. كرر التخفيف التسلسلي ل 25 ميكرومتر للحصول على 12.5 ميكرومتر ، ثم كرر بالمثل تخفيف 12.5 ميكرومتر للحصول على 6.25 ميكرومتر.
    7. إعداد التخفيفات المناسبة لمقتطفات العينة.
    8. قم بتخفيف مستخلصات الذرة الصفراء واللوبيا 20 مرة ، ومستخلصات القمح والفاصوليا 50 مرة ، ومستخلص فول الصويا 100 مرة باستخدام المحلول العازل.
    9. انقل 200 ميكرولتر من كل عينة أو معيار Trolox إلى آبار صفيحة سوداء ذات 96 بئرا للسحب التلقائي.
    10. ثم املأ خزانات الكاشف الثلاثة المزودة بمعدات ORAC ، بما يلي: (1) الحل العازل. (2) 0.816 نانومتر فلوريسين في المخزن المؤقت ؛ و (3) 153 mM من 2,2′-azobis (2-amidinopropane) ثنائي هيدروكلوريد (AAPH) في المخزن المؤقت.
    11. ضعها في أوعية السحب التلقائي.
    12. قم بإعداد آلة ORAC ونظام السحب التلقائي للتحليل ، استنادا إلى إجراء التشغيل القياسي.
    13. للتحليل ، قم بإعداد نظام السحب الآلي لنقل 25 ميكرولتر من كل مستخلص مخفف أو قياسي إلى آبار صفيحة سوداء شفافة ذات 96 بئرا.
    14. ثم ، أضف تلقائيا 150 ميكرولتر من 0.816 نانومتر فلوريسين في المخزن المؤقت.
    15. احتضن خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في آلة ORAC.
    16. بعد ذلك ، أضف تلقائيا 25 ميكرولتر من AAPH إلى كل خليط تفاعل.
    17. احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة في جهاز ORAC.
    18. قم بإعداد آلة ORAC لقياس اضمحلال التألق ، خلال فترة الحضانة ، عند الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات من 485 نانومتر و 520 نانومتر ، على التوالي.
    19. بعد القياسات ، ارسم منحنى Trolox القياسي ، مع Trolox (6.25-50 μM) على المحور الأفقي واضمحلال التألق على المحور الرأسي.
    20. تقدير قدرة امتصاص الأكسجين الجذري للمستخلصات من منحنى Trolox القياسي.
    21. عبر عن النتائج كعينة ميكرومول TE / g على أساس الوزن الجاف.
  6. التحليل الإحصائي
    1. تقديم جميع النتائج كوسيلة ± الانحراف المعياري لثلاثة أضعاف على الأقل.
    2. إجراء تحليل التباين (ANOVA) لتحديد تأثير نوع الحبوب على متغيرات الاستجابة.
    3. في حالة وجود فروق ذات دلالة إحصائية عند p < 0.05 ، استخدم أقل فرق ذي دلالة (LSD) لمقارنة الوسائل.
    4. قم بإجراء تحليل ارتباط بيرسون لتقدير العلاقة بين المحتوى الفينولي والقدرات المضادة للأكسدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الجدول 2 الأحماض الفينولية التي تم تحديدها في الحبوب والبقوليات. استنادا إلى المعايير الأصيلة المتاحة ، تم تحديد أربعة أحماض فينولية في العينات وهي: الفانيليا ، والكافيين ، والأحماض الكومارية ، والفيروليك. حمض الفانيليك هو حمض هيدروكسي بنزويك في حين أن الثلاثة الأخرى هي أحماض هيدروكسي سيناميك. تم تحديد حمض الفانيليك فقط في حبوب اللوبيا Blackeye بينما تم تحديد حمض الكافيين فقط في حبوب الكلى. تم تحديد حمض p-Coumaric في الذرة الصفراء وحبوب اللوبيا وفول الصويا. تراوح تركيزه بين 7.57 و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم اختيار الحبوب الكاملة كحبوب وبقوليات تمثيلية للحبوب التي تجد تطبيقات غذائية واسعة في جميع أنحاء العالم. في حين قد توجد اختلافات بين أصناف كل حبة ، كان تركيز هذه الدراسة هو إظهار طريقة معممة لاستخراج وتحليل حمض الفينول الحر للحبوب الكاملة. تم تعديل طريقة الاستخراج عن طريق تقليل كميات العينات والمذيبات بشكل كبير ، من أجل تقليل كمية المواد الكيميائية التي سيتم إطلاقها في البيئة عند إجراء مثل هذه التجارب. كما يتيح التعديل استخراج الفينول من كميات ملليغرام من الحبوب الكاملة.

ينتج تحليل HPLC كروم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ويعرب صاحبا البلاغ عن امتنانهما للدعم التقني الذي قدمته السيدة أليسون سير والسيدة هانا أودورو - أوبينغ، فضلا عن الدعم الذي قدمته السيدة جانيس فاجاردو والسيد ميغيل ديل روزاريو لتحرير الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل Falcon أنابيب الطرد المركزي المخروطيةفيشر Scientific05-527-90
2 مل زجاج العنبر معرف قارورةSurestop Thermo ScientificC5000-2W
2 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الكهرمانيةVWR20170-084
2،2 & -Azobis (2-amidinopropane) ثنائي هيدروكلوريد (AAPH)سيجما ألدريتش440914-100G
2,2'-أزينو-مكر(3-إيثيل بنزوثيازولين-6-سلفونيك الحمض (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥ 98٪ ،سيجما ألدريتشA1888-2G
2،2-ثنائي الفينيل-1بيكريل هيدرازيل (DPPH) (C18< / sub>H12< / sub>N5< / sub>O6< / sub>)سيجما ألدريتشD913-2
6-هيدروكسي-2،5،7،8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14< / sub>H18< / sub>O4< / sub>) ، & جي ؛ 98٪Fluka Chemika56510
9 مم أغطية الخيط اللولبية قارورة أخذ العيناتالأوتوماتيكية Thermo Scientific60180-670
96 ألواح سفلية مسطحةجيدا Fisher Scientific12565501
Agilent BioTek ELx800 قارئ صفيحة صغيرةفيشر ScientificBT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 نظام ماصات العينات الدقيقة الآليفيشر ScientificN / A
Agilent BioTek FLx800 Microplate FluorescenceReader فيشر ScientificN / A
الميزان التحليلي SI-114Denver InstrumentSI-114.1
Autosampler ، Waters 717 PlusWatersWAT078900
3 مل حقنة Luer-Lok TipBD309657
Bransonic منظف بالموجات فوق الصوتية ، برانسون 5510Millipore SigmaZ245143
Corning LSE Vortex MixerCorning6775
Durapore Filter (0.45 & micro; م غشاء PVDF)Merck Millipore LtdHVLP04700 
مرشحات غشاء Durapore (0.45 & micro; م HV)شركة Merck Millipore LtdHVHP04700
Eppendorf Research   ؛ زائد ، 0.5-10 & مايكرو ؛ LEppendorf3123000020
Eppendorf Research  بالإضافة إلى 0.5-5 ملEppendorf3123000071
Eppendorf Research   ؛ زائد ، 100-1000 ومايكرو ؛ LEppendorf3123000063
Eppendorf Research  زائد ، 10-100 وميكرو ؛ LEppendorf3123000047
أسيتات الإيثيل ، HPLC الصففيشر الكيميائيةE195-4
حمض الفيروليك القياسيSigma Aldrich128708-5G
FluoresceinFisher ScientificAC119245000
Folin & amp كاشف الفينول CiocalteuSigma AldrichF9252
حمض الفورميك ، 99٪Acros Organics ، Janssen Pharmaceuticalaan 3a27048-0010
معيار حمض الغاليكSigmaG7384
كروماتوجراف سائل عالي الأداء (HPLC) ، Waters 2695Waters960402
الميثانول ، HPLC الصففيشر كيميائيA452-4
أطراف ماصة صغيرة ، 0.5-10 وميكرو ؛ Lفيشربراند21-197-2F
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة Sorvall Legend Micro 21 جهاز طردمركزي Thermo Scientific75002435
ماصة دقيقة متعددة القنوات ، Proline Plus ، 30-300 & micro ؛ LSartorius728240
كاشف صفيف الثنائي الضوئي ، ووتر 2996ووتر720000350EN
نصائح ماصة ، 1000 ومايكرو ؛ LVWR83007-382
أطراف Pipet ، 1-5 ملVWR82018-840
بيرسلفات البوتاسيوم (K2< / sub>S 2< / sub>O8< / sub>) ، & ge ؛ 99.0٪سيجما ألدريتش216224-100 جم
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة اللامائي (K2< / sub>HPO4< / sub>) فيشرScientificP288-500
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2< / sub>PO4< / sub>)فيشر ScientificP285-500
PYREX 250 مل قارورة غليان قصيرة العنق ، كورنينجالمستدير 4321-250
التحليلي المعكوس C18 المرحلة (100 × 3 مم) Accucore aQThermo Scientific17326-103030
المبخر روتو ، IKA RV 10IKA& nbsp ؛ 0010005185
كربونات الصوديوم (NaCO3) اللامائيةفيشر الكيميائيةS263-1
كلوريد الصوديوم (NaCl)Mallinckrodt AR & reg ؛7581
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي (Na 2< / sub >HPO 4< / sub>) فيشرScientificBP332-500
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة اللامائي (NaH 2 < / sub >PO < sub > 4 < / sub >)الكواشف الحيوية فيشرBP329-500
نصائح ماصة التوحيد القياسي 0-200 & micro ؛ LFisherbrand02-681-134
وحدة تصفية مدفوعة بالحقنة (0.22 وميكرو ؛ م)  Millex & reg ؛ -GVSLGVR04NL
الهدف micro-serts إدراج قارورة (400 & micro ; L)Thermo ScientificC4011-631
ماء عالي النقاء (نظام الأشعة فوق البنفسجية Q-3 المباشر مع مضخة)MilliporeZRQSVP030
القاع العمود

المراجع

  1. Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478(2014).
  2. Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
  3. Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
  4. Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
  5. Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
  6. Beverly, R. L. Encyclopedia of Food Safety. Motarjemi, Y. 3, Academic Press. 309-314 (2014).
  7. FAO. Food Outlook - Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , Rome, Italy. (2020).
  8. Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
  9. Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
  10. Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27(2016).
  11. Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
  12. AOAC. Official Methods of Analysis. 17th edn. , Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, MD, USA. (2000).
  13. Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158(2020).
  14. Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, Pt A 307-315 (2016).
  15. Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
  16. Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  17. Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
  18. Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
  19. Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
  20. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
  21. Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
  22. Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
  23. Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الحبوب الكاملةالحبوب والبقولياتتحليل HPLCمقايسة DPPHمكافئ ترولوكسمقايسة ORACالفينولات الحرة القابلة للذوبانالمحتوى الفينولي الكلي
طريقة معممة لتحديد تكوين حمض الفينوليك القابل للذوبان الحر والقدرة المضادة للأكسدة للحبوب والبقوليات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.