يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد الحمض النووي الريبي المنخرط في التفاعل المباشر بين الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي مع الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر

1.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62475

⸱

يوليو 9, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculté des Sciences Médicales et Paramédicales, Aix Marseille Univ, CNRS, INP

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تم تصميم بروتوكول سحب الحمض النووي الريبي سهل الاستخدام لتحديد الحمض النووي الريبي المنخرط في تفاعل مباشر مع RNA طويل غير مشفر. يستخدم البروتوكول السورالين كمثبت لربط تفاعلات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي فقط ويوفر تفاعل الحمض النووي الريبي المباشر بالكامل لشبكة الحمض النووي الريبي الطويلة غير المشفرة عند اقترانها بتسلسل الحمض النووي الريبي.

الملخص

إن الدور المتزايد الذي يعزى في الوقت الحاضر إلى الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNA) في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية يجعل من الضروري توصيف تفاعلها من خلال تحديد شركائها الجزيئيين والحمض النووي والبروتينات و / أو الحمض النووي الريبي. يمكن أن يتفاعل الأخير مع lncRNA من خلال الشبكات التي تتضمن البروتينات ، ولكن يمكن أيضا أن يشارك في تفاعلات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي المباشرة. لذلك ، قمنا بتطوير إجراء سحب الحمض النووي الريبي سهل الاستخدام يسمح بتحديد الحمض النووي الريبي المنخرط في تفاعل مباشر مع الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي مع الحمض النووي الريبي باستخدام السورالين ، وهو جزيء يربط تفاعلات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي فقط. سمحت نمذجة المعلوماتية الحيوية للهيكل الثانوي lncRNA باختيار العديد من مجسات قليل النوكليوتيدات الحمض النووي المضادة للمعنى مع تقارب قوي للمناطق التي تظهر احتمالية منخفضة لإقران القاعدة الداخلية. نظرا لأن المجسات المحددة التي تم تصميمها تستهدف المناطق التي يمكن الوصول إليها على طول lncRNA ، يمكن تحديد مناطق تفاعل الحمض النووي الريبي في تسلسل lncRNA. عندما يقترن بتسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسات تفاعل الحمض النووي الريبي المباشر بالكامل ل lncRNA ذي الأهمية.

المقدمة

الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) عبارة عن نسخ غير مشفرة للبروتين أطول من 200 نيوكليوتيد. عددهم يتزايد باستمرار ، أكثر من 58,000 في البشر. علاوة على ذلك ، فإن دورها الحاسم في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية يجعل من الضروري توصيف شركائهم الجزيئيين الذين يسمحون لهم بتنفيذ وظائفهم التنظيمية. في الواقع ، أحد الأساليب لفهم وظائف lncRNAs هو الكشف عن الشركاء الجزيئيين المتفاعلين لكل lncRNA.

يمكن أن تكون الأهداف الجزيئية ل lncRNAs هي الحمض النووي أو البروتينات أو الحمض النووي الريبي ، وقد تم تطوير تقنيات مختلفة للتعرف عليها. في هذا الصدد ، فإن تحديد البروتينات التي تتفاعل مع lncRNAs هو الهدف من البروتوكولات المختلفة ، بما في ذلك إجراءات مختلفة للترسيب المناعي للحمض النووي الريبي (RIP) حيث يتم استخدام جسم مضاد ضد البروتين محل الاهتمام لسحب lncRNAs على وجه التحديد (للمراجعة1). تسمح التقنيات الأخرى مثل تحليل تهجين الالتقاط لأهداف الحمض النووي الريبي2 (CHART) أو عزل الكروماتين عن طريق تنقية الحمض النووي الريبي3 (ChIRP) بسحب lncRNAs جنبا إلى جنب مع مجمعات البروتين المرتبطة بها. في هذه التقنيات الأخيرة ، يتم استخدام lncRNA كطعم. CHART و ChIRP هي أيضا تقنيات قوية لتحديد الخرائط الجينومية التي تظهر إشغال lncRNA2،3. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح طرق سحب الحمض النووي الريبي هذه تحديد شركاء الحمض النووي الريبي ل lncRNA. تم وصف إجراء يسمح بالتقاط الحمض النووي الريبي المستهدف بواسطة lncRNA. تم تصميم مجسات قليل النوكليوتيدات المضادة للحساسية في الحمض النووي ضد المناطق ذات الاحتمال المنخفض لإقران القاعدة الداخلية على النحو الذي تحدده نمذجة المعلوماتية الحيوية للهيكل الثانوي lncRNA4. ومع ذلك ، فإن هذا الإجراء لا يميز ما إذا كان شركاء الحمض النووي الريبي يتفاعلون بشكل غير مباشر عبر شبكة بروتين أو مباشرة عبر تفاعلات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي المباشر مع lncRNA. لقد ثبت أن الربط المتبادل مع مشتقات السورالين هو الطريقة المفضلة لتحديد تفاعلات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي المباشرة بوساطة الاقتران الأساسي5. مشتقات Psoralen قادرة بالفعل على الإقحام في الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة وربط البيريميدين تساهميا بعد التشعيع بضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر)6. يعد اقتران الحمض النووي الريبي المنسدل باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات الحيوية مع الارتباط المتبادل مع السورالين إجراء سهل الاستخدام مقترح هنا لتحديد الحمض النووي الريبي المنخرط في تفاعلات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي المباشرة مع lncRNA. علاوة على ذلك ، يمكن أن يسمح هذا الإجراء بتحديد مناطق تفاعل الحمض النووي الريبي في تسلسل lncRNA إذا تم استخدام مجسات قليلة النوكليوتيدات المختلفة المصممة على طول lncRNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصميم المسبار

  1. قم بإنشاء الهيكل الثانوي ل lncRNA باستخدام برنامج خادم ويب مجاني متخصص: برنامج RNAstructure7 أو مجموعة الويب Vienna RNA8. حدد المناطق التي تعرض احتمالية منخفضة لإقران القاعدة الداخلية وتصميم 25 قاعدة مجسات قليلة النوكليوتيدات الطويلة المضادة للمعنى لمناطق مختلفة من هذا lncRNA.
  2. تحقق من جميع قليل النوكليوتيدات المصممة باستخدام البرنامج الأكاديمي المجاني ، AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr) ، من أجل الحصول على معلومات مختلفة عن هذه المجسات واختيار تلك التي تحتوي على أفضل المعلمات.
    ملاحظة: تحقق من المعلمات المثلى على البرنامج على النحو التالي. النسبة المئوية ل GC: بين 40 و 60٪ ، 3 'الاستقرار ، التعقيد ، ديمر الذات: "جيد". درجة حرارة الانصهار (TM) ليست مهمة لأن التقارب يتم في درجة حرارة الغرفة.
  3. باستخدام أداة البحث عن المحاذاة (على سبيل المثال ، Blast ، وما إلى ذلك) ، تأكد من أن مجسات قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المحددة لا تتعرف على تسلسل النيوكليوتيدات في أي RNA آخر يتم التعبير عنه في الخلايا المختارة.
    1. صمم مسبارا من 25 قاعدة طويلة غير محددة من قليل النوكليوتيد الحمض النووي. تأكد من أن هذا المسبار لا يظهر تقاربا مع lncRNA محل الاهتمام ولا أي تسلسلات أخرى من الحمض النووي الريبي في الجينوم محل الاهتمام.
  4. اطلب جميع المجسات مع تعديل البيوتين المضاف إلى نهايتها 3 بوصات جنبا إلى جنب مع فاصل ثلاثي إيثيلين جلسرين (TEG). يزيد هذا الفاصل من مسافة oligo-biotin لتجنب العوائق الفراغية.
    ملاحظة: للحصول على النتيجة المثلى وتقييم خصوصية نتائج المنسدلة ، صمم ما لا يقل عن مجسين مختلفين من قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى في نفس المنطقة ثم قارن كفاءتهما تجريبيا.

2. الربط المتقاطع

  1. تنمو الخلايا (على سبيل المثال ، خلايا GH4C1 المستخدمة في هذه التجربة) حتى التقاء في أطباق ثقافة الخلايا 78.5 سم2 . بعد إزالة وسط زراعة الخلية ، اشطف طبقة الخلية ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد المخصب ب Ca2+ و Mg2+ (PBS +) وأضف 3 مل من محلول الجزيء المشتق من السورالين (4′Aminomethyltrioxsalen hydrochloride) المحضر في PBS + بتركيز 0.1 مجم / مل.
  2. ضع لوحة الاستزراع لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة خلايا الثدييات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الغطاء ، ضع أطباق الاستزراع على الثلج على بعد 2.5 سم من أنابيب الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر في الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. حرك الأطباق برفق واستعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق إضافية.
  3. تخلص من الوسائط عن طريق الشفط ، وأضف 1 مل من PBS + لجمع الخلايا باستخدام مكشطة خلية ، ونقلها إلى أنبوب صغير. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 400 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطفية وقم بتخزين الكريات عند -80 درجة مئوية.

3. تحلل الخلايا

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للبروتيناز K عن طريق إضافة 100 ملي كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.0 ، و 1 ملي مولار EDTA ، و 0.5٪ SDS و 5 ميكرولتر / مل مثبط RNase.
  2. أعد تعليق كريات الخلية في هذا المخزن المؤقت (حوالي 200 ميكرولتر لكل 1 × 107 خلايا). أضف البروتيناز K إلى التركيز النهائي البالغ 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر واحتضانه لمدة 45 دقيقة عند 50 درجة مئوية. ثم احتضن لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية ، لتعطيل البروتيناز K.

4. صوتنة

  1. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من هذا المحللة (المقابلة ل 5.106 خلايا) في أنبوبين دقيقين وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين (700 ملي كلوريد الصوديوم ، 70 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.0 ، 1 ملي مولار EDTA ، 1.25٪ SDS ، 5 ميكرولتر / مل محلول مثبط RNase و 15٪ فورماميد) في كل أنبوب.
  2. ضع الأنابيب في حمام مائي 4 °C من سونيكاتير وبدء الصوتنة مع سلسلتين من 30 ثانية نبضات (كثافة عالية) مفصولة ب 30 ثانية قبالة.
  3. اجمع 20 ميكرولتر من العينات لتكون بمثابة عينات للتحكم في المدخلات وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تم تحسين إجراء الصوتنة هذا سابقا لخط خلية GH4C1 من أجل الحصول على شظايا الحمض النووي الريبي التي تتراوح في 2,000 نيوكليوتيد9. بالنسبة لخطوط الخلايا الأخرى ، يجب تحسين إجراء الصوتنة. عندما يتم تنفيذ هذه التقنية لدراسة شركاء الحمض النووي الريبي لحمض نوبي طويل جدا غير مشفر ، تثبت خطوة الصوتنة أنها لا غنى عنها للحصول على انتعاش مناسب ل lncRNA. في هذه الحالة ، من الضروري تصميم العديد من المجسات مع موقع ربط يقع كل 4,000 نيوكليوتيد كحد أقصى على طول lncRNA. لاستعادة الطول الكامل ل lncRNA ، استخدم مجموعة من العديد من المجسات المحددة. ومع ذلك ، إذا كان الغرض هو تحديد مناطق lncRNA المشاركة في ارتباط الحمض النووي الريبي - الحمض النووي الريبي ، فيجب استخدام المجسات المحددة بشكل منفصل. علاوة على ذلك ، إذا كنت تدرس شركاء الحمض النووي الريبي لأصغر lncRNA ، فيجب إجراء التجارب لتحديد ما إذا كانت خطوة الصوتنة مطلوبة.

5. الحمض النووي الريبي المنسدل

  1. اليوم 1 - خطوة التهجين
    1. أضف 150 ملي مول (1.5 ميكرولتر من محلول مخزون 100 ميكرومتر) من مسبار محدد أو غير محدد بيوتينيل إلى كل أنبوب عينة. احتضان لمدة 4 ساعات تحت التحريض على دوار الأنبوب في درجة حرارة الغرفة (RT) (حوالي 30 دورة في الدقيقة).
    2. خذ الحجم اللازم من الخرزات المغناطيسية (أي 40 ميكرولتر من الخرز لكل 150 ملي مول من تفاعل تهجين المجسات). استخدم دعم المغناطيس لفصل الخرز عن الوسائط التجارية. تخلص من المادة الطافية واغسل الخرزات ب 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين. بمجرد الانتهاء من ذلك ، أعد تعليق الخرزات المغناطيسية في نفس حجم المخزن المؤقت للتهجين.
    3. أضف حبات مغناطيسية في كل أنبوب عينة (40 ميكرولتر من الخرز لكل 150 ملي مول من تفاعل تهجين المجسات). احتضان طوال الليل تحت التحريض على أنبوب دوار عند RT (حوالي 30 دورة في الدقيقة).
  2. اليوم 2 - خطوة عزل الحمض النووي الريبي
    1. افصل الخرزات عن محللة الخلية باستخدام دعم المغناطيس (2-3 دقائق). تخلص من المادة الطافية واغسل الخرزات ب 900 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت (0.5٪ SDS ، 2x SSC) مع حضانة لمدة 5 دقائق تحت التحريك على المدور عند RT. كرر هذا الغسيل 5 مرات.
    2. بعد إزالة الغسيل الأخير ، أضف 95 ميكرولتر من محلول البروتيناز K على الخرز. قم بإذابة عينات الإدخال وأضف 75 ميكرولتر من محلول البروتيناز K. أضف 5 ميكرولتر من البروتيناز K إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكروغرام / ميكرولتر في جميع الأنابيب (العينات وعينات الإدخال). احتضن عند 45 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. احتفظ بالعينة على الجليد. استخدم الدعم المغناطيسي لفصل الخرزات عن الحمض النووي الريبي الموجود في المادة الطافية. قم بتنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي التي تتضمن خطوة هضم DNase. قم بتخزين الحمض النووي الريبي النقي عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن إخضاع الحمض النووي الريبي المغطى ل RT-qPCR أو تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية للكشف عن النصوص المخصبة. بالنسبة لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي ، يمكن بعد ذلك محاذاة القراءات مع الجينوم محل الاهتمام باستخدام برامج مجانية ، مثل STAR10 أو HISAT211 ، ويمكن إجراء القياس الكمي باستخدام FeatureCounts12 أو HTSeq count13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إن توضيح lncRNA interactome ، أي المكونات الخلوية التي تتفاعل مع lncRNAs والبروتينات والحمض النووي الريبي ، له أهمية رئيسية لفهم وظائف lncRNAs. تم تطوير تقنيات مختلفة لتوصيف interactome lncRNA ، بما في ذلك RIP و CHART و ChIRP و RNA المنسدل. في حين أن هذا الأخير قد ثبت أنه قوي في تحديد أهداف الحمض النووي الريبي ل lncRNAs ، فإن هذه الإجراءات لا تشير إلى ما إذا كان شركاء الحمض النووي الريبي يتفاعلون بشكل غير مباشر عبر شبكة بروتين أو مباشرة عبر تفاعلات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي المباشرة. ومع ذلك ، يعتقد الآن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تقوم العديد من lncRNAs بوظيفتها من خلال الاقتران الأساسي التكميلي مع mRNAs. لذلك ، من المهم تطوير الإجراءات التي تسمح بتوصيف تفاعل الحمض النووي الريبي المباشر ل lncRNAs. لذلك ، تم تطوير إجراء يجمع بين استخدام السورالين ككاشف ربط متقاطع مع تقنية سحب الحمض النووي الريبي.

في بروتوكول الحمض النووي الريبي المنسدل الموصوف ، يعتمد تصميم واختيار مجسات قليل النوكليوتيدات المضادة للحساسية على نمذجة المعلوماتية الحيوية للهيكل الثانوي lncRNA والاختيار اللاحق للمجسات التي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل جامعة إيكس مرسيليا والمركز الوطني للبحوث العلمية وبتمويل من منحة من مختبرات ساندوز.

تمويل رسوم الوصول المفتوح: جامعة إيكس مرسيليا والمركز الوطني للبحوث العلمية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4 & رئيس ؛ -Aminomethyltrioxsalen هيدروكلوريدSigmaA4330كاشف Crosslinker
Bioruptor PlusDiagenodeB01020001Sonicator
Biotynilated مجساتIDTOligonucleotide مجسات
CFX96 نظام الوقت الحقيقيBioRad4351107جهاز qPCR
DNA OlignucleotidesIDTبادئات ل qPCR
Dynabeads My OneThermo-Fisher65001حبات الستربتافيدين المغناطيسية
فورماميدثيرمو فيشر15515-026فورماميد
iTaq يونيفرسال SYBR Green SupermixBioRad1725124كاشف qPCR
Proteinase KSigmaP2308Proteinase K
RNA إلى DNAThermo-Fisher4387405طقم النسخ العكسي
طقم تنقية الحمض النووي الريبي XSماكيري ناجل740902طقم تنقية الحمض النووي الريبي
RNAseOUTThermo-Fisher10777-019مثبط RNAse
أنبوب دوارستيوارتSB2أنبوب دوار
للأشعة فوق البنفسجية ستراتالينكر 1800ستراتاجين# 400072الأشعة فوق البنفسجية متشابكة

المراجع

  1. Chen, L. -L., Zhao, J. C. functional analysis of long non-coding RNAs in development and disease. Systems Biology of RNA Binding Proteins. 825, 129-158 (2014).
  2. Simon, M. D. capture hybridization analysis of rna targets (CHART). Current Protocols in Molecular Biology. 101 (1), 2125(2013).
  3. Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). Journal of Visualized Experiments. (61), e3912(2012).
  4. Torres, M., et al. RNA pull-down procedure to identify RNA targets of a long non-coding RNA. Journal of Visualized Experiments. (134), e57379(2018).
  5. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of non-coding RNAs to nascent pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  6. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  7. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129(2010).
  8. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 70-74 (2008).
  9. Jacq, A., et al. Direct RNA-RNA interaction between Neat1 and RNA targets, as a mechanism for RNAs paraspeckle retention. RNA Biology. , 1-12 (2021).
  10. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  11. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  12. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general-purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  13. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
  14. Fox, A. H., et al. Paraspeckles: a novel nuclear domain. Current Biology. 12 (1), 13-25 (2002).
  15. Torres, M., et al. Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. eLife. 5, 14837(2016).
  16. Jacq, A., et al. Direct RNA-RNA interaction between Neat1 and RNA targets, as a mechanism for RNAs paraspeckle retention. BioRxiv. , 354712(2020).
  17. Lu, Z., et al. Psoralen Analysis of RNA Interactions and Structures with High Throughput and Resolution. Methods in Molecular Biology. 1649, 59-84 (2018).
  18. Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA interactions globally using biotinylated psoralen. Journal of Visualized Experiments. (123), e55255(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RNA Pull Down
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.