مقالة منهجية

الكشف عن الأجسام المضادة للمجال الملزمة للمستقبلات من سارس-CoV-2 باستخدام جهاز تقرير حيوي قائم على HiBiT

DOI:

10.3791/62488

⸱

أغسطس 12, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Biotechnology, University of Tehran

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف البروتوكول المحدد إجراءات إنتاج مجمع بروتين المجال الملزم لمستقبلات HiBiT وتطبيقه للكشف السريع والحساس عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أدى ظهور وباء COVID-19 إلى زيادة الحاجة إلى طرق أفضل للكشف المصلي لتحديد الأثر الوبائي للفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (سارس-كوف-2). ويثير العدد المتزايد من الإصابات بالسارس-CoV-2 الحاجة إلى فحوصات أفضل للكشف عن الأجسام المضادة. طرق الكشف عن الأجسام المضادة الحالية تهدد الحساسية للسرعة أو حساسة ولكنها تستغرق وقتا طويلا. وتستهدف نسبة كبيرة من الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 المجال الملزم للمستقبلات، وهو أحد المقصورات المناعية الأولية للسارس-كوف-2. لقد قمنا مؤخرا بتصميم وتطوير نظام RBD شديد الحساسية وموسوم بيومونسنت (NanoLuc HiBiT-RBD) للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2. يصف النص التالي الإجراء لإنتاج مجمع HiBiT-RBD وإجراء تقييم سريع لتقييم وجود الأجسام المضادة المستهدفة RBD باستخدام هذه الأداة. ونظرا لمتانة منتج بروتين HiBiT-RBD على مدى مجموعة واسعة من درجات الحرارة والإجراءات التجريبية الأقصر التي يمكن إكمالها في غضون ساعة واحدة، يمكن اعتبار البروتوكول بديلا أكثر كفاءة للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 في عينات مصل المريض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تسبب ظهور فيروس كورونا الجديد، سارس-CoV21، في وفاة أكثر من 2,800,000 شخص و128 مليون إصابة حتى 30 مارس 2022. ونظرا لعدم وجود إجراءات علاج موثوقة وراسخة للعلاجات السريرية للسارس-CoV-2، بذلت العديد من الجهود لتقييد المزيد من انتقال الفيروس، والأهم من ذلك، تطوير علاج فعال وقوي أو لقاح3. حتى الآن، هناك أكثر من 50 مرشحا للقاح COVID-19 في التجارب التي أبلغت عنها منظمة الصحة العالمية4. يعد اكتشاف الأجسام المضادة ضد السارس - فيروس نقص الفيروس - 2 ذا أهمية قصوى لتحديد الاستقرار طويل الأجل للاستجابة الفكاهية عند إعطاء اللقاح وكذلك في المرضى الذين تم انتشالهم من COVID-195. وقد اثبتت بعض الدراسات ان هناك امكانية ان يفقد المرضى الذين تم انتشالهم من السارس - كو فى - 2 معظم الاجسام المضادة الملزمة للسارب بعد عام واحد ، وهو 6،7، 8،9 . ويلزم إجراء مزيد من التحقيقات من أجل فهم أفضل للمناعة الدائمة، ويمكن لمنصات الكشف عن الأجسام المضادة الأكثر حساسية أن تساعد في زيادة هذا العمل. كما أن التقارير عن استمرار مناعة العدوى الخفيفة بالسارس-CoV-2، والتي تشير إلى استجابات طويلة الأجل للأجسام المضادة، هي أيضا مجال مثير للاهتمام وجدير بالاهتمام للدراسة. طريقة سريعة ودقيقة للكشف أمر ضروري لرصد الأجسام المضادة في سيرا الأفراد لتوفير المزيد من المعلومات حول الحصانة في السكان.

مثل الفيروسات التاجية الأخرى، يستخدم السارس-CoV-2 بروتين الجليكوبروتين البارز لربط الإنزيم-2 المحول لأنجيوتنسين (ACE2) لبدء سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى دمج أغشية الفيروسات والخلايا6,7. وقد أثبتت العديد من الدراسات مؤخرا RBD من بروتين سبايك أن يكون لها دور حاسم في الحصول على استجابة قوية ومحددة للأجسام المضادة ضد السارس-CoV28,9,10,11. وعلى وجه الخصوص، فإن الارتباطات التي لاحظها بريمكومار وآخرون بين تأليه الأجسام المضادة الملزمة لل RBD وفعالية تحييد السارس-CoV-2 في بلازما المرضى تتسق مع كون RBD حجرة مناعية لهيكل الفيروس9. ومع وضع ذلك في الاعتبار، فإن العديد من الاختبارات التشخيصية المتاحة للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 هي اختبارات تستغرق وقتا طويلا وكثيفة التكلفة، وتتطلب إجراء طويلا للحضانة والغسيل (فحص مناعة مرتبط بالإنزيم [ELISA])، أو تفتقر إلى الحساسية والدقة (الفحص المناعي للتدفق الجانبي [LFIA])12. ولذلك، فإن الطريقة الكمية والسريعة التكميلية للكشف عن الأجسام المضادة المشتقة من COVID-19 مع حساسية عالية واستجابة سريعة وتكلفة منخفضة نسبيا من شأنها أن تخدم الحاجة إلى اختبار مصلي موثوق به للمراقبة الوبائية سارس-كوف-2.

وقد أدت القيود المفروضة على المقايسات المصلية الحالية مجتمعة إلى إجراء تحقيق في نظام الإبلاغ عن الإنارة الحيوية كعامل تشخيصي محتمل في عمليات التحري المصلي في المستقبل. الإضاءة الحيوية هي تفاعل إنزيم/ركيزة طبيعي، مع انبعاث الضوء. Nanoluc luciferase هو أصغر (19 كيلودا) ، ومع ذلك ألمع نظام مقارنة رينيلا واليراع لوسيفيراز (36 كدا و 61 كدا ، على التوالي)13،14. علاوة على ذلك ، Nanoluc لديه أعلى نسبة إشارة إلى الضوضاء والاستقرار بين الأنظمة المذكورة سابقا. تدعم كثافة الإشارة العالية ل Nanoluc اكتشاف كميات منخفضة جدا من اندماج المراسلين15. تقنية Nanoluc الثنائية (NanoBiT) هي نسخة مقسمة من نظام Nanoluc ، والتي تتألف من جزأين: BiT الصغيرة (11 حمض أميني؛ ثنائية الأحماض الصغيرة (11 حمض أميني؛ 1998). SmBiT) وBiT كبيرة (LgBiT) مع التفاعلات منخفضة نسبيا تقارب (دينار كويتي = 190 ميكرومتر) لتشكيل مجمع الإنارة16. يستخدم NanoBiT على نطاق واسع في دراسات مختلفة تنطوي على تحديد التفاعلات البروتين البروتين15,17,18,19 ومسارات الإشارات الخلوية11,20,21.

في الآونة الأخيرة ، تم تقديم ببتيد صغير آخر مع تقارب أعلى بشكل واضح إلى LgBiT (KD = 0.7 nM) ، وهو نظام HiBiT Nano-Glo ، بدلا من SmBiT. تقارب عالية وإشارة قوية من نانو غلو "إضافة مزيج قراءة" المقايسة يجعل HiBiT مناسبة، كمية، علامة الببتيد الإنارة. في هذا النهج ، يتم إلحاق علامة HiBiT بالبروتين المستهدف من خلال تطوير بناء يفرض الحد الأدنى من التداخل الهيكلي. ومن شأن اندماج بروتين HiBiT أن يرتبط بنشاط بنظيره LgBiT، وينتج إنزيم لوسيفيراز نشط للغاية لتوليد الإضاءة الحيوية القابلة للكشف في وجود كاشفات الكشف (الشكل 1). وبالمثل، قمنا بتطوير نظام قائم على HiBiT Nano-Glo لقياس تاتر الأجسام المضادة المحايدة بسهولة في سيرا الأفراد المتعافين من السارس-CoV-2 وطورنا مؤخرا جهازا موسوما بالسارس-CoV-2 RBD. تصف هذه الورقة بروتوكول إنتاج التقرير الحيوي HiBiT-RBD باستخدام الإجراءات والمعدات المختبرية القياسية، وتبين كيف يمكن استخدام هذا المبلغ الحيوي في فحص سريع وفعال للكشف عن الأجسام المضادة المستهدفة بالسارس-CoV-2 RBD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: البروتوكول الموضح أدناه يلتزم بكافة إرشادات الأخلاقيات وفقا لمدونة البروتوكول 20200371-01H.

1. إنتاج وتقييم HiBiT-RBD التقرير البيولوجي

  1. إنتاج كمية كافية من HiBiT-RBD المبلغ الحيوي
    1. الاستعداد لثقافة الخلايا
      1. إعداد كامل دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين و 1٪ البنسلين / العقدية. ثم، دافئة وسائل الإعلام في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      2. تشغيل خزانة السلامة البيولوجية (BSC) واستخدام الإيثانول 70٪ v/v لتعقيم سطح الخزانة.
    2. ثقافة خط الخلية.
      1. أخرج خط الخلية من -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل، وذابه في حمام مائي 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: خط الخلية المناسبة من السهل الحفاظ عليها في الثقافة، وكفاءة عالية في العدوى، ومناسبة لإنتاج البروتين الخارجي. الكلى الجنينية البشرية، تم استخدام خلايا HEK293 لهذا البروتوكول.
      2. خلط الخلايا المذابة مع ما لا يقل عن 10 مل من المتوسطة كاملة، ماصة تعليق الخلية إلى طبق بيتري 10 سم، ودوامة لوحة لتوزيع الخلايا في الطبق بشكل موحد. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 ورطوبة 85-95٪.
      3. مراقبة الخلايا تحت المجهر حتى يصل مستوى الالتقاء إلى 80-90٪. عند التقاء عالية، وإزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مع المالحة الدافئة الفوسفات العازلة (PBS)، وإضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين-إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك لفصل الخلايا من السطح.
        ملاحظة: يتم فصل خلايا HEK293 بسهولة إلى حد ما. وبالتالي، ينبغي أن يتم خطوة الغسيل بلطف شديد لمنع انفصال عرضي وفقدان الخلايا.
      4. بعد ما يقرب من 5 دقائق، ننظر في الخلايا تحت المجهر. إذا كانت جميع الخلايا عائمة، أضف ما لا يقل عن 4 مل من المتوسط، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم جديد. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم، وإضافة 1 × 106 خلايا في كل بئر من لوحة 6-جيدا لtransfection.
        ملاحظة: بعد 24 ساعة، يجب أن تكون الخلايا في التقاء 80٪ أو أكثر.
    3. إصابة بلازميد HiBiT-RBD
      1. استخدام 1 ميكروغرام من HiBiT-RBD التعبير البلازميد مع كاشف transfection مناسبة. احتضان لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم إضافة الحجم الإجمالي إلى كل بئر من لوحة، قطرة الحكمة.
        ملاحظة: اتبع بروتوكول العدوى الشركة المصنعة. في هذه الحالة، أضيف خليط (كمية محددة) من كاشف العدوى مع DMEM إلى البلازميد المخفف (1 ميكروغرام) في DMEM (انظر جدول المواد). استخدم علامة تحتوي على (على سبيل المثال، البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) البلازميد كعنصر تحكم لمراقبة كفاءة العدوى.
      2. في اليوم التالي، استبدل الوسط الذي يحتوي على خليط العدوى بمتوسط كامل. مراقبة التحكم في العدوى جيدا 48 ساعة بعد transfection.
        ملاحظة: إذا كان التحويل إيجابيا وفعالا (أكثر من 80٪ من GFP-positive)، فيجب أن تكون الخلايا جاهزة لحصاد المبلغ الحيوي HiBiT-RBD. يحتوي البناء أيضا على علامة له ، والتي يمكن استخدامها للحصول على البروتين النقي بدلا من الناسخ الكلي.
      3. جمع supernatant في 1.5 مل الأنابيب الدقيقة. إضافة 500 ميكرولتر من 1x تحلل السلبي المخزن المؤقت (PLB) إلى الخلايا; احتضان ويهز لوحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحلل الخلية.
        ملاحظة: يمكن الحفاظ على supernatant والحل lysate عند -20 درجة مئوية مع فقدان بسيط للنزاهة لمدة 6 أشهر على الأقل. وفقا ل Azad et al.22، فإن المراسل مستقر في نطاق واسع من درجة الحموضة (4-12) ودرجة الحرارة (4-42 درجة مئوية).
  2. تقييم الإشارة الإنارة من المبلغ البيولوجي بواسطة المقايسة لوسيفيراز
    1. إعداد مكونات التفاعل
      1. استخدام supernatant كمصدر لbioreporter.
        ملاحظة: يحتوي كل من supernatant و lysate على التقرير الحيوي HiBiT-RBD ويمكن استخدامه في الفحص. ومع ذلك ، يوصى بالناسخ الخارق كمصدر لأسباب موضحة في الملاحظات التالية.
      2. تمييع LgBiT والركيزة إلى 1x قبل الاستخدام (تركيز المخزون هو 100x).
        ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول LgBiT.
    2. فحص لوسيفراز
      1. نقل 50 ميكرولتر من supernatant من كل بئر أو أنبوب إلى لوحة 96 جيدا، وإضافة 50 ميكروغرام من LgBiT 1x إلى كل بئر. حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      2. افتح برنامج قياس اللمعان، وأضف 50 ميكرولتر من الركيزة 1x (furimazine) إلى كل بئر، وضع اللوحة في مقياس الإنارة، وتشغيل البرنامج.
        ملاحظة: أضف الركيزة مباشرة قبل قراءة اللوحة لمنع استهلاك الركيزة بواسطة الإنزيمات النشطة قبل قياس الإشارة.

2. الكشف عن الأجسام المضادة RBD مع سريع وحساسة المقايسة

  1. HiBiT-RBD فحص الكشف عن الأجسام المضادة
    1. إعداد التقرير الحيوي HiBiT-RBD كما هو موضح في القسم 1.1 من البروتوكول.
      ملاحظة : من المستحسن استخدام supernatant للمقايسة التالية كما هو أبسط لجمع ويحتوي على نسخة جليكوسيلاتed ناضجة من البروتين. وعلاوة على ذلك، فإن ليسات لديها العديد من البروتينات الأخرى التي يمكن أن تتداخل مع التفاعل HiBiT-RBD-الأجسام المضادة.
    2. الجمع بين 50 ميكرولتر من الناتات المحتوية على HiBiT-RBD مع 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة التجارية سارس-CoV-2-RBD في الأنابيب الدقيقة 1.5 مل. أضف 20 ميكرولتر من البروتين المناعي الملزم للغلوبولين (البروتين G) إلى المحلول. رفع إجمالي حجم إلى 300 ميكرولتر عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يمكن تخفيض الحجم الإجمالي للخليط إلى 150 ميكرولتر. لا يوصى بكميات إجمالية أقل لأنه يمكن أن يؤدي إلى خلط غير كاف للأجسام المضادة مع المبلغ الحيوي.
    3. احتضان أنبوب (ق) على أنبوب شاكر أو الدوار لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي في 12,000 × غرام لمدة 30 s, تجاهل supernatant, ويغسل مع برنامج تلفزيوني. كرر العملية ثلاث مرات لإزالة HiBiT-RBD مجانا. Resuspend في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى لوحة 96 جيدا.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من LgBiT 1x وانتظر لمدة 5 دقائق. ثم، إضافة 50 ميكرولتر من 1x ركيزة نانولوك. اقرأ على الفور إشارة الإنارة مع مقياس الإنارة.

3. الكشف عن الإنتاجية العالية للأجسام المضادة الخاصة بالسارس-CoV-2 من عينات مصل المريض

  1. إعداد كميات أكبر من HiBiT-RBD تقرير حيوي لإجراء فحص الإنتاجية العالية باتباع المقطع 1.1 من البروتوكول.
  2. الجمع بين 20 ميكرولتر من البروتين المغناطيسي G مع 50 ميكرولتر من HiBiT-RBD supernatant في بئر من 96-جيدا لوحة لكل عينة. إضافة 10 ميكرولتر من عينة المصل إلى كل بئر وإحضار الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: استخدم كلا من IgG غير المحدد (التحكم السلبي) وتحييد الأجسام المضادة سارس-CoV-2 (التحكم الإيجابي) بتركيز 1 ميكروغرام/مل كما هو موضح في الخطوة 2.1.2. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تقييم عينات المصل من الفئران الملقحين للأجسام المضادة. في هذا الاختبار، تم الحصول على عينات المصل من الحرم الجامعي العام مستشفى أوتاوا بموجب إجراء معتمد وبموافقة مستنيرة من الأفراد.
  3. احتضان لمدة 30 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة على غسالة مغناطيسية لتسريع مجمع البروتين G-الأجسام المضادة.
    ملاحظة: الهيكل المحدد للغسالة المغناطيسية سوف يعجل المجمع على الجدران الجانبية لكل بئر.
  4. تجاهل الحل في القسم الأوسط من كل بئر، وإضافة برنامج تلفزيوني للغسيل. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات على الأقل لإزالة HiBiT-RBD الزائدة. إضافة 50 ميكرولتر من 1x برنامج تلفزيوني و 50 ميكرولتر من 1x LgBiT. حضانة لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإعداد برنامج قياس اللمعان، ثم أضف 50 ميكرولتر من الركيزة 1x. ضع اللوحة في الجهاز، وتشغيل البرنامج، وتسجيل الإشارات. قارن الإشارات من عينات المصل وعينات التحكم والخلفية (الآبار الفارغة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تسجيل الإشارات من كل من lysate الخلية المحتوية على HiBit-RBD وsupernatant من الخلايا المصابة (الشكل 2) لتقييم مصدر البروتين المناسب. تم استخدام HiBiT-RBD و LgBit بشكل منفصل كعناصر تحكم ، وأظهرت البيانات خلفية منخفضة مقارنة بإشارة قوية عندما تم الجمع بين كلا الجزءين. وبالتالي، فإن تفاعل HiBiT-RBD مع LgBiT ضروري لتوليد إنزيم نشط لهضم الركيزة ونشاط الإضاءة الحيوية (الشكل 1).

إضافة البروتين G سوف تساعد الأجسام المضادة هطول الأمطار (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتطلب العدد المتزايد من المصابين بالسارس-فيروس الكواد-2 والجهود الجارية للتطعيم العالمي إجراء اختبارات مصلية حساسة وسريعة يمكن استخدامها في عمليات مسح المصل على نطاق واسع. وتبين البحوث الحديثة أنه يمكن استخدام التقارير البيولوجية القائمة على النانولوسيفراز لتطوير مثل هذه المقايسات. قمنا مؤخرا بتطوير HiBiT-RBD بيوبورتر لتصميم اختبار يمكن استخدامه للكشف عن الأجسام المضادة الخاصة بالسارس-CoV-2 في مصل المريض بطريقة سريعة وموثوقة (الشكل 4C).

هناك بعض الخطوات الحاسمة ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نقدر ونشكر المساعدة التقنية التي يقدمها شياوهونغ هي، وريكاردو ماريوس، وجوليا بيتريك، وبرادلي أوستن، وكريستيانو تانيزي دي سوزا. نشكر أيضا مينا قريماني على التصميم الجرافيكي. كما نود أن نشكر جميع الأفراد الذين شاركوا وتبرعوا بعينات دمهم لهذه الدراسة. ويدعم DWC جزئيا من قبل كلية uOttawa وقسم الطب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5x عازلة التحلل السلبيPromegaE194A30 مل
Bio-Plex غسالة مغناطيسية محمولةBio-Rad171020100
DMEMSigmaD6429-500ml
نظام فحص ثنائي Glo luciferasePromegaE2940طقم 100 مل
مصل الأبقار الجنين (FBS)SigmaF1051
HiBiT-RBD Plasmidgacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctgctgctgtctagccgcata gttaagccagtatctgctgtgt aggtcgctgaggtcaaaattta agctacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttagggtgtgtttg cgctgctgtgtagggtctc aatcaattatattgt aatcaattacgggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgtacttacggtataa atggcccgcctggctgacccccaacgaccc ccgcccattggtcaataatgacgtgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtggtagggtgtagcgttt ggcagtacatcaatggggtagcggttagcggtcgttg actcacggggggttccaagtctccaccaaatg acgtcaatggttggcaccaaaatgttggcaccaatgtcgtcgtcg ccccattgcaaatgggttaggtaggggta cggtggggtatatagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggacccaa gctggctagcgttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggct agcggcggtct agcggcggtc agggcggtct gggctg GCGGCTGTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcgcGCTAGCGGCGCACACACAGGACC ACGACGGGGGACTACAAGGACCA CGACATCGACACACCAAGA GACGAGGACACACCAGCA GCAGGGGAGGACGCTCTGGAGGA GGTAGCGGCGGCACAACACAATCTGTG CCCATTCGGCGGGTTTAACGCCACCAGAT ttgccagcgtgtatgcctggaaccgga atctctaattgctatagcgtggctctagcgtgtcctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccaaagctgaacc ctgtgcttcaccaacacggtcaccaacgtgctctgt gatcaggggcgatgagtcgtc aactataagctgccaggcacaggcacagattcggactac aactataagctggatttcaccggct gcgtgatccctggaatagcaaaatctgggtc cgggttcagaaagagcaacctgaatctgtac cggctgttcagaaagacaaccatcacagatctaccag gcaggctcccctctcacacgggagg gcttcaattgtttcctggcagagtcggc ttccagcctacaaatggcgtgggtgctatcagcca tacagggtggtgtgtcctttgagctgtctctgacCATC gagggccgccatccatgaccactgatagtagcgctcgagtctagctaggtctcgtgtcgtgtgttaggtctagtgttagtgtgtctgtgtgtccccctcgtg ccttccttgaccttgtccccac tgtcctttctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctctgaggtcattctggcaggcaggggcagga ggattgggagacaatagcaggggggggtctatggcttgtggtggtgtggtgtgttggtgttgtgcttggcttgtgtgttgtgttgtgtctctgtgtctga agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcggcattaagcgcgcggcggcgtggtc acttgccagcggctcgcctctcgccctcttctcgcctctcggccctcttctcatcgggctccctctttägtgtc ccaacttgattagggtgggtggtttcactggtgtcgtgtc ctttgtggtc cttgtgtctggtäaaatägtg gactcttctccaäaccaacc ctatctcggtctattcttgatttaagggatttt gccgatttcggttggttaaaatgaggctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtcagttagggtgggaaagtccc caggctcccccacaggcagaagtatgcaag catgctcaattagtcacaaccaggtgtgg aaagtccccaggctcccccaggcaggcaagggt atgcaaagcatccatcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgccccatcccgtccgtccctcccctccctctcctttattggcagaggc cgaggccgtctgtctgagctttgagttcgaa gtagtttttgtctaggtttg caaagctcccggggtctccatttc ggatctcaagagacaggatgaggttttt cgcatgattgaacaagatgtgg ttctccggtggtc tatgactggggggcacaatcggctggttc ccgaaagtccatcttgtctc cgcctgtggtggtc ccatcggtct gcaggtct tggcaggctggctggtct gcagctggtct ggaagcg ggaggcgtctcg ggaggcgtc ggggcagggatctctcggctgtcgctctc agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgtggt ccgaatatgtggtggt accgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtggttacgg tatcgccggcgtctc ttctatcgccttcttgtctctgaggtc tccaccgccccccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttccgggctgctggctgctggtggtgtgtggagt tcttcgccccacccaacttgttttgtgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcaaagcatttcactgcatcatt ctagttgtggtccaaactcatcaatgtat cttatgtgtataccgtcgtcct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtgtc ctgtgtccacaattccacac aacatacgaggagcatagtgtaaag cctgggggtgtaatgagtgaggtaactcacat taattgcgttgcctcactgcctc gggaaacctgtcgtggccagctgcattaatgaa tcggccaacggcggggggagaggcgggcggggtcgctcctctcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgtctcgtgtcgtcctcaaaggcggtaatacggttc cacagaatcaggggataacggaaagaa catgtgagcaaggccagcaaggccgtggcgttttcatcactcatcgtctc aatcgcatcac aaaatcgctcac aatcgctcacagtcagggaa acccgacacaggataaagataccaggcgtt tccccctggctgtct ggctgtctct ccgtct tttctcccttcgggaagcgtggctctcatcat agctcacgctgtagtaggtatctcagttcgggtgtagtaggttcgctccaagctgggctgtggcgaa ccccccgttcggtctcgctgtc ggtcggtccaacccttactc acacgacttatcggtccagcagcgcccacttagcaggtctTAGgAGgTAGgTAGgTGgTCtGAGTgTGtGGTAGTgGTtGTtGGTACGTACGctgACTAGAGAagATtGGTACtGGAa aagattgTGTcttcTGATCCcaCAAAAAAAAAGAT CTCAAGAAGATCCTTTTTTTTTTCTACGGGGT ctgctcagtggaacgaaaaactcacgttaa gggattgggtgtcatgagattatcaaaggatct tcacctagatccttttaaaattaaatgaagtt ttaaatcaatctaaatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatcagcgatctctcgtcgttcatctctca tagttgactcccccgtcgtgtagactac gatacgggcttaccatctggccagtg ctgcaatgataccgaccacccacccacccacc ggctccatcattcacaataaaccagccag ccggaggccggccaagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagtagttagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgtgtccattgctcctcgtggtcgttgtgtgg cttcatcagctccggtccaacgatcaaggc gagttacatgatcccatgtgttgtggcaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgtcgttgtcgtctcgtgtcGtGTtCATGGT tatggCAGGCACTGCATCATTCTCTCTACTGTGTGTGCATGTGTGTGTCTGGAATAGTGTGTATGCG gcgaccgagtgtgtcctctctccggcgtcaatacg ggataataccggcgcccatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgtgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttttcaccagcgtttctcaccagcgtttc tgggtgagcaaacaggaaaggaaggcaaaatgc cgcaaaggaataagggcgacacgga aatgttgaatcatactctctctttttcaat attattgaagcatttatcagggtc tcatgagcggatacatttgattttt agaaataggttccgcgca catttccccgaaaaagtggccacctgacgtc
LgBiTPromegaN3030
البنسلين ستربتومايسينثيرمو فيشر العلمية15140122
بيرس بروتين G الخرز المغناطيسيThermo Fisher Scientific88848
PolyJet في المختبر الحمض النووي كاشفالإشاراتSL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) الجسم المضاد المحايد للسبايك ، Mouse MabSinoBiological40592-MM57
Synergy Mx Microplate ReaderBioTek96-well لوحة قارئ مقياس الإضاءة
تربسين EDTAثيرمو فيشر العلمي25200560.25٪

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
  2. Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
  3. Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514(2020).
  4. World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
  5. Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
  6. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  7. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215(2020).
  8. Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
  9. Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
  10. Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
  11. Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
  12. Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516(2020).
  13. Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
  14. Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
  15. Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
  16. Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27(2016).
  17. Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596(2019).
  18. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).
  19. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).
  20. Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
  21. Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
  22. Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SARS CoV 2 HiBiT G NanoLuc

مقالات ذات صلة