Method Article

الجزيئية الربيع التحليل المستمر من قبل التحليل الطيفي قوة قوة Biomembrane

DOI:

10.3791/62490

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مسبار قوة الوميمبران الحيوي (BFP) هو تقنية التحليل الطيفي للقوة الديناميكية في الموقع (DFS). يمكن استخدام BFP لقياس ثابت الربيع من التفاعلات الجزيئية على الخلايا الحية. يقدم هذا البروتوكول تحليلا ثابتا لفصل الربيع للروابط الجزيئية التي اكتشفها BFP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد برز مؤخرا مسبار قوة الوميمبران الحيوي (BFP) كسطح الخلية الأصلية أو في الموقع التحليل الطيفي للقوة الديناميكية (DFS) nanotool التي يمكن قياس الحركية ملزمة جزيئية واحدة، وتقييم الخصائص الميكانيكية للتفاعلات مستقبلات ليجاند، تصور التغيرات تشكيلية ديناميكية البروتين ومستقبلات أكثر إثارة توضيح آليات mechanosensing الخلية بوساطة. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام BFP لقياس ثابت الربيع من الروابط الجزيئية. يصف هذا البروتوكول الإجراء خطوة بخطوة لإجراء تحليل DFS ثابت الربيع الجزيئي. على وجه التحديد، يتم مناقشة وضعي تشغيل BFP، وهما أوضاع خلية الخرز والخرز. يركز هذا البروتوكول على اشتقاق ثوابت الربيع للروابط الجزيئية والخلايا من البيانات الخام DFS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما تقنية DFS الخلايا الحية، BFP المهندسين خلية الدم الحمراء البشرية (RBC؛ 1000000000000000000000000000000000000000000 الشكل 1) إلى محول قوة فائق الحساسية وغير قادر مع مجموعة ثابتة ربيعية متوافقة عند 0.1-3 pN/nm1،2،3. للتحقيق في التفاعل بين مستقبلات ليغاند، BFP تمكن قياسات DFS في ~ 1 pN (10-12 N)، ~ 3 نانومتر (10-9 م)، و ~ 0.5 مللي ثانية (10-3 ثانية) في القوة والمكانية، والقرار الزمني4،5. يتكون تكوينه التجريبي من اثنين من micropipettes المتعارضة ، وهي التحقيق والهدف. التحقيق micropipette aspirates RBC ولصق حبة في ذروتها عن طريق التفاعل البيوتين streptavidin. الخرزة مغلفة مع ليغاند من الفائدة (الشكل 1A). الهدف micropipette aspirates إما خلية أو حبة تحمل مستقبلات الاهتمام ، المقابلة لخلية الخرز(الشكل 1B)والخرزة حبة (الشكل 1C) وسائط ، على التوالي5.

وقد وصفت BFP البناء والتجميع والبروتوكولات التجريبية DFS بالتفصيل سابقا1،6. باختصار، دورة لمسة BFP يتكون من 5 مراحل: نهج، Impinge، الاتصال، تراجع وتفكك(الشكل 1D). ويشار إلى موقف قمة RBC الأفقي على أنه ΔxRBC. في البداية، تشوه RBC غير المجهد (قوة الصفر) هو 0 ( الجدول 1). ثم يتم دفع الهدف من قبل piezotranslator إلى impinge على وتراجع من حبة التحقيق(الشكل 1D). يتم ضغط أول مسبار RBC من قبل الهدف مع تشوه RBC السلبي ΔxRBC < 0. في حدث بوند، تنتقل مرحلة التراجع من مرحلة ضغط إلى مرحلة الشد مع تشوه RBC الإيجابي ΔxRBC > 0 (الشكل 2C و D). وفقا لقانون هوك، فإن قوة تحمل BFP قادرة على أن تقاس على أنها F = kRBC × ΔxRBC، حيث KRBC ( الجدول1) هو ثابت الربيع RBC من BFP. عند تمزق السندات والانتهاء من دورة لمسة واحدة، يعود حبة التحقيق إلى موقف قوة الصفر مع ΔxRBC = 0(الشكل 1D).

لتحديدRBC ك، ونحن قياس وتسجيل شعاعي من فتحة التحقيق micropipette الداخلية (ص ر)، وRBC (R0) ومنطقة الاتصال الدائري (Rج) بين RBC والخرزة التحقيق ( الشكل1A). ثم يتمحساب كRBC وفقا لنموذج ايفان (Eq. 1)7،8 باستخدام برنامج LabVIEW الذي يعمل كأداة افتراضية (VI) لتشغيل BFP ( الشكلS1A)8،9.

معادلة التوازن الثابت ل kRBC في ديناميكيات الموائع ، توضح المتغيرات والمصطلحات اللوغاريتمية. (Eq. 1)

مع BFP المنشأة وDFS البيانات الخام التي تم الحصول عليها، وهنا نقدم كيفية تحليل ثابت الربيع من زوج مستقبلات ليجند أو الخلايا. البيانات الخام DFS على التفاعل بين البروتين الجليكوسيلات Thy-1 و K562 خلية تحمل integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; الشكلان 3A و 3B)10 و 10 من الفيبرينوجين والخرز المغلفة integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; الشكل 3C) 11,12 وقد استخدمت لإثبات الخرز الخلية والخرز حبة وسائط التحليل, على التوالي.

BFP التحضير التجريبي
للحصول على تفاصيل إعداد BFP التجريبي والأجهزة، يرجى الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة سابقا3. وباختصار، تم تطين RBC البشري باستخدام البيوتين-PEG3500-NHS في العازلة الكربون/ بيكربونات. وقد اقترنت البروتينات ذات الأهمية بشكل مشترك بالخرز الزجاجي البوروسيليكات باستخدام MAL-PEG3500-NHS في حاجز الفوسفات. لإرفاق RBC البيوتينية ، يتم أيضا طلاء حبة المسبار بالستريبتافيدين (SA) باستخدام MAL-SA. يرجى الاطلاع على جدول المواد والجدول 2.

لتجميع BFP (الشكل 1، إلى اليسار) ، سيتم استخدام micropipette الثالثة التي يطلق عليها "المساعد" لتسليم حبة التحقيق والغراء إلى قمة RBC1،3. التفاعل التساهمي بين حبة التحقيق المغلفة SA وRBC البيوتينية هو أقوى بكثير من رابطة مستقبلات ليغاند من الفائدة. وهكذا، يمكن تفسير المرحلة التفككية على أنها تمزق السندات مستقبلات ليغاند بدلا من مفرزة من حبة التحقيق من RBC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الحصول على أحداث DFS قابلة للتحليل

  1. بدء التجربة في البرنامج (على سبيل المثال، LabVIEW VI) للتحكم BFP وإعداد المعلمة(الشكل S1A).
  2. مراقبة خرزة الهدف التحقيق المتكررة / لمسات الخلية في البرنامج لBFP مونيتور (الشكل S1B).
  3. اختبار وتحقيق تردد التصاق ≤ 20٪ ضمن أول 50 لمسات عن طريق ضبط قوة المساس ووقت الاتصال، والتي تضمن أن ≥ 89٪ من حدث التصاق DFS يتم التوسط من قبل سندات واحدة12،13،14.
    ملاحظة: لكل زوج حبة الخلية/ حبة، ونحن تنفيذ 200 دورات اللمس المتكررة. للحصول على جودة بيانات قابلة للنشر، نقوم عادة بإجراء n ≥ 3 أزواج من الخرز أو الخرز الخلية.
    1. حفظ البيانات، في شكل قوة مقابل الوقت، إلى المجلد الموجه للمستخدم بنهاية كل زوج، التي دفعها البرنامج للتحكم BFP وإعداد المعلمة.
  4. جمع القوة مقابل الوقت البيانات الخام للأحداث بوند، كما يتضح في الشكل 2A،وذلك باستخدام منصة اقتناء BFP(الشكل S1C).
    1. افتح برنامج تحليل بيانات BFP. انقر على رمز المجلد الأصفر وحدد ملف البيانات الخام المقابلة عن طريق النقر المزدوج عليها.
  5. تشغيل البرنامج، ومن ثم انقر فوق الزر لأعلى ول لأسفل للتبديل بين الأحداث. استخدم معايير الاستبعاد المتطرفة (الشكل S2) لحجب الأحداث غير الصالحة. حدد نوع البيانات المصدرة بتنسيق القوة مقابل الوقت وانقر على زر تصدير بيانات المؤامرات.

2. تحويل القوة مقابل منحنى الوقت إلى القوة مقابل منحنى التشريد

  1. تصدير مقطع البيانات المقابل لمرحلة السحب إلى جدول بيانات (الشكل 2A، سرادق مربع) ، وهو ما يرتبط بالتحليل المستمر الربيع.
  2. رسم القوة مقابل منحنى الوقت باستخدام برنامج جدول البيانات. للحصول على منحنى القوة مقابل الإزاحة، قم بتحويل قيم الوقت(الشكل 2A، x-axis)إلى قيم الإزاحة الإجمالية (Δxtot)عن طريق ضرب قيم الوقت بسرعة حركة بيزو (أي 4000 نانومتر / ثانية بواسطة الضبط المسبق).
  3. صفر نقطة البيانات الأولى بطرح أصغر قيمة إزاحة من كل قيمة إزاحة مكتسبة. هذا التحول الأفقي لا يؤثر على المنحدرات الصاعدة لمرحلة التراجع ولا على حساب ثابت الربيع اللاحق.
  4. وتجدر الإشارة إلى أن BFP يعتبر نظام ربيع تسلسلي حيث Δxtot (الجدول 1) مجموع التشوهات في RBC ، ΔxRBC ( الجدول1) ، الرابط الجزيئي ، Δxmol (الجدول 1) ، والخلية المستهدفة ، Δxالخلية (الجدول 1) ، كما Eq. 2:
    معادلة التوازن الثابت Δxtot = ΔxRBC + Δxmol + Δxcell ، الصيغة الرياضية. (Eq. 2)
  5. رسم القوة (F) مقابل الإزاحة (Δxtot) منحنى كما هو موضح في الشكل 2B.

3. الربيع Cnstant تحليل الخرز - وضع الخلية

  1. في منحنى القوة مقابل الإزاحة ، يمكن تحديد اثنين من المنحدرين المتميزين ، حيث يمكن لكل منهما تمثيل المرحلة الضاغطة ومرحلة الشد. احتواء خط انحدار لكل مجموعة بيانات (الشكل 2B)، حيث يمثل الميل الملاءمة الخطية الأكبر ثابت الربيع الكلي في المرحلة الضغطية (الشكل 2B، أحمر)،ويشار إليه ب k1 (الجدول 1)؛ ويمثل المنحدر الأصغر الخطي ثابت الربيع الكلي في مرحلة الشد (الشكل 2B، الأزرق) ، معنوما ك2 (الجدول 1).
  2. بالنسبة للينابيع المتصلة في سلسلة لكل وصف الخطوة 2.2، والتعبير عن المعاملة بالمثل من مجموع ثابت الربيع، كتوت (الجدول 1)،ومجموع من عكس ثابت الربيع من RBC، كRBC ( الجدول1)،الرابط الجزيئي، كمول (الجدول 1)،والخلية المستهدفة، كالخلية (الجدول 1). خلال المرحلة الضاغطة من وضع خلية الخرز ، لا يتم تمديد الرابطة الجزيئية ، وبالتالي لا يؤخذ kmol في الاعتبار. يتم التعبير عن المعاملة بالمثل من كتوت في هذا السيناريو (1 /ك1) كما
    معادلة تمثل حركية الخلية في علم الأحياء. رسم تخطيطي للثوابت الحركية: k1 ، kRBC ، kcell. (Eq. 3).
    في المثال البيانات، يتم تحديدRBC kمسبقا (0.25 pN/nm بشكل افتراضي). يمكن اشتقاق الخلية k من Eq. 3 مع k1 و kRBC المكتسبة ( الشكل3B).
  3. خلال مرحلة الشد ، يتم تشكيل التصاق بين زوج مستقبلات الليغند. التعبير عن المعاملة بالمثل من كتوت في هذا السيناريو (1 /ك2) كما
    معادلة المقاومة في سلسلة ، تظهر 1 / k2 = 1 / kRBC + 1 / kmol + 1 / kcell ، المستخدمة في دراسة الحركية. (Eq. 4)
    حيث k2 (الجدول 1) يمثل ثابت الربيع الإجمالي خلال مرحلة الشد.
  4. اشتقاق kمول من طرح 1/ك1 من 1 /ك2 (مقارنة Eq. 3 مقابل Eq. 4).

4. الربيع التحليل المستمر للخرزة - وضع حبة

  1. احتواء خط انحدار إلى بيانات المرحلة الضغط للحصول على k1 (مشابهة الشكل 2B, أحمر). من الجدير بالذكر، في وضع حبة حبة، يتم استبدال الخلية الهدف من قبل حبة زجاجية المغلفة مع مستقبلات الفائدة(الشكل 1C). منذ تشوه حبة لا يكاد يذكر، يمكن إزالة مصطلحالخلية 1 /كمن Eq. 3 و Eq. 4 وفقا لذلك. يمكن التعبير عن الكميةالمتبادلة ktot للمرحلة الضغطية (1/k1)على النحو التالي:
    المعادلة التي توضح العلاقة: 1 / k1 = 1 / kRBC ؛ مفتاح ثوابت المعدل الحركي في التحليل الكيميائي الحيوي. (Eq. 5)
  2. احتواء خط انحدار إلى بيانات مرحلة الشد للحصول على k2 (مشابهة الشكل 2B، أزرق). يمكن التعبير عن الكمية المتبادلةktot من مرحلة الشد (1/k2)على النحو التالي:
    معادلة معدل التفاعل ، مخطط ثوابت المعدل العكسي ؛ k2 ، kRBC ، مصطلحات kmol لتحليل الحركية. (Eq. 6)
  3. اشتقاق kمول من طرح 1/ك1 من 1 /ك2 (مقارنة مكافئ 5 مقابل مكافئ 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، لقد أظهرنا بروتوكول تحليل الربيع BFP المستمر. لوضع تحليل حبة الخلية، قمنا بتحليل kمول من الرابط الجزيئي بين البروتين الجليكوسيلات Thy-1 المغلفة على حبة التحقيق و integrin α5β1 أعرب عن على الخلية K562 الهدف (Thy-1-integrin α5β1; الشكل 3A) 10.الخلية k مشتقة أيضا من وضع خلية الخرز (K562 الخلية; الشكل 3ب). لوضع حبة حبة، السندات الجزيئية التي تشكل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باختصار ، قدمنا بروتوكول تحليل بيانات مفصل للمعالجة المسبقة للبيانات الخام DFS واشتقاق ثوابت الربيع الجزيئية في أوضاع تحليل BFP Bead-Bead و Bead-Cell. يتم تقديم نماذج ومعادلات الميكانيكا الحيوية اللازمة لتحديد ثوابت الربيع الجزيئية والخلوية. وإن كانت تدرس integrins مختلفة ، وkمول تقاس وضع حبة حبة ووضع الخرز الخلية تمتلك اختلافات كبيرة النطاق(الشكل 3A مقابل الشكل 3C). من الجدير بالذكر ، مع وضع حبة الخرز ، يرتبط المستقبلات بشكل متناقض بالخرز ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفان أنه ليس لديهما مصالح متنافسة لتقديم تقرير بشأن هذه الدراسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر غيوم ترواديك على المناقشة المفيدة، وزيهاو وانغ على استشارة الأجهزة، ومركز سيدني للتصنيع، وجريج سوانينغ وسيمون رينغر لدعمهم شركتنا الناشئة في المختبر. تم دعم هذا العمل من قبل مشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي (DP200101970 - L.A.J.) ، وبرنامج بناء قدرات القلب والأوعية الدموية في نيو ساوث ويلز (منحة الباحث الوظيفي في منتصف مبكر - L.A.J.) ، جائزة مسرع أبحاث سيدني (SOAR - L.A.J.) ، مؤسسات راماسيوتي منحة الاستثمار الصحي (2020HIG76 - L.A.J.) ، ومنحة أفكار المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (APP2003904 - L.A.J.) ، وصندوق جامعة سيدني للشركات الناشئة في كلية الهندسة ومخطط المعدات الرئيسية (L.A.J.). بطانة أرنولد جو هو زميل مجلس البحوث الأسترالي DECRA (DE190100609).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) Uct، Specialties ، llc4420-74-0وظيفة حبة زجاجية
Anhy. ثنائي القاعدة لفوسفات الصوديوم (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907إعداد عازلة الفوسفات
على بيانات BFP VILabVIEWالتحكم في BFP وإعداد المعلمات
بيانات BFP VILabVIEWالبيانات الأولية BFP
Biotin-PEG3500-NHSJenKemA5026-1البيوتينيل
حبات زجاج البورسليكاتDistrilab تكنولوجيا الجسيمات ، هولندا9002حبة زجاجية
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA0336وظيفة الترابط
الكاميرا VILabVIEWمراقبة BFP
D< / sub>-glucoseSigma-AldrichG7021Tyrode ' إعداد العازلة
هيبسسيجما ألدريتشH3375تيرود إعداد العازلة
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1الخرزة الزجاجية
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيجما ألدريتشP9541تيرود إعداد العازلة
ثاني كربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>) إعدادعازلة كربوناتS5761؛ تيرود إعداد العازلة
كربونات الصوديوم (Na 2< / sub>CO3< / sub>)Sigma-AldrichS2127تحضير العازلة الكربونية / البيكربونات
كلوريد الصوديوم (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode ' إعداد العازلة
S أحادي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH2< / sub>PO4< / sub>& bull; H2< / sub>O)Sigma-AldrichS9638تحضير عازلة الفوسفات
Streptavidin-MaleimideSigma-AldrichS9415وظيفة حبة زجاجية
الحصول تحليل تحليل RBC وظيفة وظيفة / بيكربونات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
  2. Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
  3. Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
  4. An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
  5. Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. Receptor-mediated cell mechanosensing. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).
  6. Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
  7. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  8. Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
  9. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580(1995).
  10. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886(2014).
  11. Passam, F., et al. Mechano-redox control of integrin de-adhesion. Elife. 7, (2018).
  12. Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
  13. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
  14. Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
  15. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
  16. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
  17. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biomembrane Force ProbeMolecular Spring ConstantDynamic Force SpectroscopySingle Molecule BindingLigand Receptor InteractionCell MechanosensingBead Cell ModeBead Bead ModeForce Versus DisplacementHooke s Law

Related Articles