السيطرة على هندسة الخلية من خلال الأشعة تحت الحمراء الليزر بمساعدة Micropatterning

ملخص

البروتوكول المعروض هنا يمكن التصنيع الآلي للخلايا الدقيقة التي توحد شكل الخلية لدراسة الهياكل الخلوية داخل خلايا الثدييات. ويمكن إنشاء هذه التقنية سهلة الاستخدام باستخدام نظم التصوير المتاحة تجاريا ولا تتطلب معدات متخصصة لا يمكن الوصول إليها في مختبرات بيولوجيا الخلايا القياسية.

الملخص

Micropatterning هو تقنية راسخة في مجتمع بيولوجيا الخلايا المستخدمة لدراسة الاتصالات بين مورفولوجيا ووظيفة المقصورات الخلوية مع التحايل على المضاعفات الناشئة عن الاختلافات الطبيعية من خلية إلى خلية. لتوحيد شكل الخلية، تقتصر الخلايا إما في قوالب ثلاثية الأبعاد أو يتم التحكم فيها للهندسة اللاصقة من خلال الجزر اللاصقة. ومع ذلك، تعتمد تقنيات التجهم المجهري التقليدية القائمة على التصوير الضوئي وحفر الأشعة فوق البنفسجية العميقة بشكل كبير على الغرف النظيفة أو المعدات المتخصصة. هنا نقدم تقنية micropatterning بمساعدة الليزر بالأشعة تحت الحمراء (microphotopatterning) المعدلة من دويل وآخرون التي يمكن إعدادها بشكل ملائم مع أنظمة التصوير المتاحة تجاريا. في هذا البروتوكول، نستخدم نظام تصوير نيكون A1R MP+ لتوليد أجهزة مجهرية بدقة ميكرون من خلال ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) الذي يهيج المناطق المحددة مسبقا على الأغطية المغلفة بالكحول متعدد الفينيل. نحن نستخدم سيناريو مخصص لتمكين تصنيع نمط الآلي مع كفاءة عالية ودقة في أنظمة غير مجهزة التركيز البؤري التلقائي الأجهزة. نظهر أن هذا الليزر الأشعة تحت الحمراء بمساعدة micropatterning (microphotopatterning) يؤدي البروتوكول في أنماط محددة التي تعلق الخلايا حصرا وتأخذ على الشكل المطلوب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون متوسط البيانات من عدد كبير من الخلايا بسبب توحيد شكل الخلية. يمكن استخدام الأنماط الناتجة عن هذا البروتوكول ، إلى جانب التصوير عالي الدقة والتحليل الكمي ، لشاشات الإنتاجية العالية نسبيا لتحديد اللاعبين الجزيئيين الذين يتوسطون في الصلة بين الشكل والوظيفة.

المقدمة

شكل الخلية هو المحدد الرئيسي للعمليات البيولوجية الأساسية مثل مورفوجينيسيس الأنسجة¹، هجرة الخلايا²، انتشار الخلايا³، والتعبير الجيني⁴. التغيرات في شكل الخلية مدفوعة بتوازن معقد بين إعادة الترتيب الديناميكي للهيكل الخلوي الذي يشوه غشاء البلازما والعوامل الخارجية مثل القوى الخارجية التي تمارس على الخلية وهندسة الالتصاقات الخلوية ومصفوفة الخلية^5. ترحيل الخلايا mesenchymal، على سبيل المثال، بلمرة شبكة أكتين كثيفة في الحافة الرائدة التي تدفع غشاء البلازما إلى الأمام ويخلق lamellipodia واسعة^6،في حين actomyosin انكماش يتراجع حافة الخلية زائدة ضيقة لفصل الخلية من وضعها الحالي^7،8. تعطيل الأحداث الإشارات التي تؤدي إلى مثل هذه الهياكل الهيكلية الخلوية المتخصصة الاضطرابات الشكل والقطبية ويبطئ هجرة الخلايا⁹. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب الانحناء الظهاري للصفائح أثناء الاختراق انقباضا apical قائما على الأكتوميوسين الذي يتسبب في أن تصبح الخلايا وجيرانها على شكل إسفين^10. على الرغم من أن هذه الدراسات تسلط الضوء على أهمية شكل الخلية، إلا أن التغايرية المتأصلة في شكل الخلية قد قيدت الجهود الرامية إلى تحديد الآليات التي تربط مورفولوجيا بالعمل.

وتحقيقا لهذه الغاية، تم تطوير العديد من النهج للتلاعب بشكل الخلية على مدى العقود الثلاثة الماضية. هذه النهج تحقيق هدفهم إما عن طريق تقييد الخلية مع قالب ثلاثي الأبعاد أو السيطرة على هندسة الالتصاق الخلوي من خلال ترسب منقوشة من البروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) على سطح مضاد للضروب، وهي تقنية يطلق عليها micropatterning¹¹. هنا سوف نستعرض عددا من التقنيات التي اكتسبت شعبية على مر السنين.

رائدة أصلا كنهج لتطبيقات الإلكترونيات الدقيقة، لينة الطباعة microcontact الطباعة المطبوعة الحجرية على أساس أصبح بشكل لا لبس فيه عبادة المفضلة¹². يتم تصنيع رقاقة رئيسية لأول مرة من خلال تعريض مناطق من ركيزة السيليكون المغلفة بطبقة مضادة للريضة الضوئية بشكل انتقائي ، تاركة وراءها سطحا منقوشا¹³. ثم يتم سكب الاستومر ، مثل PDMS ، على الرقاقة الرئيسية لتوليد "ختم" ناعم ينقل بروتينات ECM إلى الركيزة المطلوبة^11،14. مرة واحدة ملفقة، ويمكن استخدام رقاقة رئيسية ليلقي العديد من الطوابع PDMS التي تؤدي إلى micropatterns استنساخها للغاية¹². ومع ذلك، لا يمكن تعديل الأنماط بسهولة بسبب عملية التصوير الضوئي الطويلة. تتطلب هذه العملية أيضا معدات عالية التخصص وغرف تنظيف لا تتوفر عادة في أقسام البيولوجيا.

وفي الآونة الأخيرة، أبلغ عن الطباعة المباشرة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية العميقة للتحايل على القيود التي تفرضها النهج التقليدية القائمة على الطباعة الحجرية. يتم توجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية العميق من خلال قناع ضوئي إلى مناطق انتقائيةمن غطاء زجاجي مغلف ببولي-L-lysine-المطعم-البولي إيثيلين غليكول. المجموعات الكيميائية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية العميقة يتم تحويلها ضوئيا دون استخدام وصلات حساسة للضوء لتمكين ربط بروتينات ECM¹⁵. عدم وجود وصلات حساسة للضوء تمكن coverlips منقوشة لتبقى مستقرة في درجة حرارة الغرفة لأكثر من سبعة أشهر¹⁵. وتتجنب هذه الطريقة استخدام غرف التنظيف ومعدات التصوير الضوئي وتتطلب تدريبا أقل تخصصا. ومع ذلك، فإن الحاجة إلى الكتل الضوئية لا تزال تشكل عقبة كبيرة أمام التجارب التي تتطلب تغييرات متاحة بسهولة في الأنماط.

بالإضافة إلى الأساليب التي تعالج هندسة الخلايا من خلال الترسب المراقب لبروتينات ECM على سطح 2D ، تسعى أخرى إلى التحكم في شكل الخلية عن طريق حصر الخلايا في الهياكل الدقيقة ثلاثية الأبعاد. وقد تكيفت العديد من الدراسات النهج اللين القائم على الطباعة الحجرية المذكورة أعلاه لتوليد 3D، بدلا من 2D، غرف PDMS للتحقيق في العمليات البيولوجية التي تعتمد على الشكل في الأجنة والبكتيريا والخميرة والنباتات^{16و17و18و19}. وقد اتخذت البلمرة اثنين الفوتون (2PP) أيضا زمام المبادرة كبقنية microfabrication التي يمكن أن تخلق معقدة 3D هيدروجيل السقالات مع قرار نانومتر²⁰. يعتمد 2PP على مبادئ الامتزاز ثنائي الفوتون ، حيث يتم امتصاص فوتونين يتم تسليمهما في نبضات femtosecond في وقت واحد بواسطة جزيء - فوتونيتيتور في هذه الحالة - يمكن من البلمرة المحلية للبوليمرات الضوئية^21. وقد استخدمت هذه التقنية بشكل كبير لطباعة السقالات 3D التي تحاكي هياكل ECM الأصلية من الأنسجة البشرية، وقد ثبت للحث على الضرر الضوئي منخفضة للخلايا²².

أعطى ظهور microphotopatterning لأول مرة قبل 10 سنوات الباحثين الفرصة لتصنيع الأجهزة الدقيقة مع تجنب المعدات المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها. Microphotopatterning يخلق أنماط على مقياس ميكرون عن طريق إزالة المناطق الانتقائية حراريا من الكحول بولي الفينيل (PVA) المغلفة على الأسطح الزجاجية المنشطة باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء^23،24. بروتينات ECM التي تعلق فقط سطح الزجاج الأساسي وليس PVA ثم بمثابة إشارات بيوكيميائية لتمكين ديناميات الانتشار التي تسيطر عليها وشكل الخلية. كما توفر هذه الطريقة مرونة فائقة حيث يمكن تغيير الأنماط بسهولة في الوقت الحقيقي. هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من microphotopatterning باستخدام نظام التصوير متعدد الفوتونات التجارية. تم تصميم البروتوكول الموصوف للتصنيع السريع والآلي للأنماط الكبيرة. لقد أثبتنا أن هذه الأنماط تتحكم بكفاءة في شكل الخلية من خلال تقييد هندسة الالتصاقات بين الخلية و ECM. وأخيرا، فإننا نثبت أن تقنية النقش الموصوفة تعدل تنظيم وديناميات الهيكل الخلوي actin.

البروتوكول

1. معالجة ما قبل المعالجة في الغطاء

1. إعداد صرير نظيفة coverlips كما هو موضح في واترمان ستورر، 1998²⁵.
2. إعداد 1٪ (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) الحل واحتضان الأغطية في الحل لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف. تأكد من أن الأغطية تتحرك بحرية في الحل.
3. يغسل الأغطية مرتين مع DH₂O لمدة 5 دقائق لكل منهما.
4. إعداد 0.5٪ حل الغلوتارالدهيدي (GA) واحتضان الأغطية في الحل لمدة 30 دقيقة على شاكر. ل 25 غطاء، استخدم 50 مل من محلول الجلوتارالدهيد. تأكد من أن الأغطية تتحرك بحرية في الحل.
5. يغسل الأغطية ثلاث مرات مع DH₂O لمدة 10 دقائق لكل منهما.
6. تدور الأغطية الجافة لمدة 30 ق باستخدام الدوار coverlip بنيت خصيصا. وقد نشر وصف مفصل للغزل coverslip²⁶ ومتاح على الانترنت (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). يمكن تخزين الأغطية المنشطة لمدة تصل إلى شهر واحد عند +4 درجة مئوية في مربع مع فواصل بحيث تقف بعيدا عن بعضها البعض.

2. PVA طلاء

1. مزيج PVA (98٪ PVA المتحللة، ميغاواط 98000) مع DH₂O لجعل حل 5.6٪.
2. Solubilize الخليط في حمام الماء 90 درجة مئوية وعلى الفور من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر في خزانة السلامة الحيوية في حين الساخنة. تصفية حل المخزون مرة أخرى إذا كان يعجل. يمكن تخزين محلول PVA في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 أشهر.
3. في أنبوب 15 مل، إضافة جزء واحد HCl إلى ثمانية أجزاء PVA. عكس الأنبوب بعناية عدة مرات لخلط.
4. صب 2 مل من محلول مختلط في طبق بيتري 35 ملم وغمر نظيفة، وأغطية المعالجة مسبقا في السائل، مع الحرص على أن coverlips لا التمسك القاع. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على شاكر.
5. إزالة بعناية coverlips من الحل. استخدام الدوار coverslip لتدور معطف لمدة 40 ق. في هذه الأثناء، نظف الملاقط. نقل غطاء إلى مربع والجافة في +4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. يمكن تخزين الأغطية المغلفة ب PVA عند +4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

3. تكوين المجهر متعددةفوتون

ملاحظة: يتم ضبط البروتوكول الموصوف لإنشاء أجهزة مجهرية لاصقة للخلايا ذات الشكل والحجم المطلوبين على أنظمة التصوير متعدد الفوتونات المستقيمة أو المقلوبة ، خاصة تلك التي لم تكن مجهزة بالتصوير التلقائي للأجهزة. وهكذا ، لكل مجال من مجالات الرؤية (FOV) ، فإن سيناريو النقش يجلد مساحة صغيرة لإنشاء علامة ائتمانية على الغطاء ، ويستخدم التركيز التلقائي للبرامج لتركيز المجهر على سطح الغطاء ، ويعبد النمط المطلوب. تشغيل هذا البرنامج النصي في حلقة لFOVs المجاورة يخلق بقوة مجموعة كبيرة من micropatterns (5 × 5 ملم أو أكبر) التي تقيد شكل الخلية وتعديل نشاط العمليات البيولوجية داخل الخلايا. تم تطوير البروتوكول الموصوف لنظام التصوير Nikon A1R MP + الذي تتحكم فيه برامج NIS-Elements. إذا تم استخدام نظام تصوير من بائع آخر للنقش، يجب تعديل التكوينات البصرية وسيناريو النقش وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

1. قم بتشغيل برنامج المجهر. تأكد من أن الهدف "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" مثبت على المجهر.
   ملاحظة: البروتوكول الموضح هنا هو الأمثل لهدف غمر المياه NA 25x/1.1، ولكن يمكن أيضا استخدام أهداف أخرى للنقش. يجب أن يدرك القراء أن التربيت بهدف تكبير عالي(على سبيل المثال، 40x و 60x) يستغرق وقتا أطول لأنه يقلل بشكل كبير من عدد الأنماط التي يتم اجتثاثها في كل FOV. يمكن استخدام أهداف التكبير المنخفضة للنقش طالما أنها توفر إضاءة موحدة عبر FOV وطاقة ليزر كافية لترطيب طبقة PVA.
2. في إطار A1plus MP GUI، قم بتعيين خط الليزر إلى 750 نانومتر.
3. إعداد التكوين البصري "Image"
   ملاحظة: يوفر NIS-Elements للمستخدمين عدة أدوات (واجهة رسومية، منشئ سير عمل اكتساب وظائف، تكوينات بصرية، ووحدات الماكرو) للتحكم في الأجهزة المجهر. في هذا البروتوكول، يتم تحقيق معظم التحكم في الأجهزة من خلال تكوينات بصرية مختلفة وكذلك وحدات ND Acquisition وND Stimulation.
   1. في علامة التبويب معايرة، انقر على التكوين البصري الجديد. اسم التكوين البصري "صورة". هذا هو التكوين البصري الأساسي الذي يسمح بتصوير الغطاء من خلال العاكسة. اترك كافة الخيارات الأخرى كخيار افتراضي وحدد الهدف المناسب.
   2. في إطار واجهة المستخدم الرسومية MP A1plus، انقر فوق الزر إعدادات لتكوين إعدادات الأجهزة ضمن هذا التكوين البصري. تعيين التحفيز ليزر إلى IR stim، ضع مقسم شعاع (BS 20/80) في مسار الضوء ، تعيين وحدة الماسح الضوئي إلى غالفانو وحدد كاشف descanned المناسبة.
   3. في إطار واجهة المستخدم الرسومية A1plus Compact، حدد حجم المسح الضوئي ووقت الإسهاب الكافي لالتقاط الميزات الصغيرة على غطاء الشاشة coverslip (1.1 مللي ثانية و1024 بكسل على نظامنا على التوالي). انقر فوق الزر Normal بحيث لا يتم تنفيذ متوسط الخط أو تكامل الخط. تأكد من تحديد المربع استخدام الليزر الأشعة تحت الحمراء. إعداد المسح أحادي الاتجاه للبساطة.
      ملاحظة: إذا كانت سرعة المسح الضوئي مثيرة للقلق، يمكن استخدام المسح ثنائي الاتجاه.
   4. في نفس النافذة، قم بضبط قوة الليزر وحساسية الكاشف للحصول على صورة ساطعة ولكن غير مشبعة لسطح الغطاء. يعد ضبط طاقة الليزر على 3 - 5٪ من أقصى طاقة وحساسية للكشف (شريط تمرير "HV") إلى 15 فولت نقطة انطلاق جيدة.
   5. في إطار منطقة المسح الضوئي A1plus، قم بتعيين التكبير/التصغير إلى 1 لالتقاط FOV بالكامل.
   6. حفظ التكوين البصري.
4. إعداد التكوين البصري "Print_Fudiciary_Marker"
   1. تكرار "صورة" التكوين البصري وإعادة تسميته "Print_Fudiciary_Marker".
   2. في إطار واجهة المستخدم الرسومية A1plus Compact، حدد أصغر حجم مسح ضوئي ووقت الإسهاب (64 بكسل و80.2 مللي ثانية على نظامنا على التوالي).
   3. نظرا لهذه الخطوة، لا يلزم التصوير، قم بتعيين حساسية الكاشف إلى 0 وزيادة طاقة الليزر إلى 30٪. سوف أعلى طاقة الليزر إزالة حراريا طبقة PVA على غطاء في المناطق المطلوبة.
   4. في إطار منطقة المسح الضوئي A1plus، قم بتعيين Zoom إلى الحد الأقصى (15.87 لنظامنا) وضع منطقة المسح الضوئي في منتصف FOV.
   5. في إطار اكتساب ND إعداد تجربة مكدس Z. تعيين الحركة في الموضع Z إلى نسبي وحدد الجهاز Z المناسب. تعيين حجم الخطوة إلى 2 ميكرومتر وعمق المكدس إلى 10 ميكرومتر فوق وتحت لحساب أي تفاوت في مرحلة المجهر أو سطح PVA بين FOVs المجاورة.
5. إعداد التكوين البصري "التركيز البؤري التلقائي"
   1. تكرار التكوين البصري "صورة" وإعادة تسميته "التركيز البؤري التلقائي".
   2. في إطار منطقة المسح الضوئي A1plus، إنقاص عامل التكبير بحيث FOV أكبر قليلا من علامة ائتمانية. وهذا يضمن أن الميزات الصغيرة الأخرى على غطاء لن تتداخل مع التركيز التلقائي.
   3. في القائمة الأجهزة، حدد ضبط تلقائي للصورة إعداد. تعيين سمك المسح الضوئي إلى أن من Z-المكدس في التجربة Z-المكدس (انظر الخطوة 3.5.5). المجهر سوف تفحص من خلال هذا النطاق والعثور على أفضل طائرة محورية باستخدام علامة ائتمانية. اترك حجم الخطوة كإعداد افتراضي.
6. إعداد التكوين البصري "Load_ROI"
   1. تكرار التكوين البصري "صورة" وإعادة تسميته "Load_ROI".
   2. في إطار واجهة المستخدم الرسومية A1plus Compact، قم بتعيين حجم المسح الضوئي المطابق لحجم قناع ROI. سيتم استخدام هذا التكوين البصري لالتقاط صورة سيتم تحميل قناع عائد الاستثمار عليها. استخدمنا 2048 بكسل لتحقيق التوازن الأمثل بين الدقة والسرعة.
      ملاحظة: من الضروري أن تكون هذه الصورة الملتقطة متطابقة في الحجم مع قناع عائد الاستثمار.
7. إعداد التكوين البصري "Micropattern"
   1. تكرار "Print_Fiduciary_Marker" التكوين البصري وإعادة تسميته "Micropattern".
   2. تعيين عامل تكبير/تصغير إلى واحد.
   3. في نافذة واجهة المستخدم الرسومية MP A1plus، قم بزيادة طاقة الليزر التحفيزية لتلغي PVA وحدد سرعة مسح مناسبة (40٪ و 32 ثانية / إطار في تجاربنا، على التوالي).
   4. في إطار التحفيز ND، إعداد تجربة التحفيز ND. إضافة بعض المراحل إلى الجدول الزمني وتعيين كل التحفيز. تأكد من صحة منطقة التحفيز ومدته.
      ملاحظة: يمكن تعديل عدد المراحل وفقا لسمك ونعومة طبقة PVA بالإضافة إلى قوة الليزر المستخدمة في هذا التكوين البصري.
   5. في نفس الإطار، تمكين الدالة StgMoveMainZ(-1.000,1) قبل كل مرحلة. وهذا يمثل مرة أخرى أي انحرافات في الاتجاه Z.
      ملاحظة: المسافة والاتجاه الذي يتحرك الهدف يمكن تعديلها وفقا لسمك ونعومة طبقة PVA.
8. إعداد التكوين البصري "Label_Surface"
   1. تكرار التكوين البصري "Print_Fudiciary_Marker" وإعادة تسميته "Label_Surface".
   2. في إطار واجهة المستخدم الرسومية A1plus Compact، قم بزيادة طاقة الليزر بشكل ملحوظ وتعيين Zoom إلى واحد. قوة الليزر العالية المستخدمة هنا سوف تلحق الضرر جسديا coverlip الزجاج وإنتاج تسمية مرئية للعين المجردة. وهذا يساعد في تحديد الأنماط في مزيد من التجارب.

4. إنشاء قناع عائد الاستثمار وإعداد الماكرو

1. إنشاء قناع عائد الاستثمار
   1. استخدم برنامج Adobe Photoshop أو أي برنامج آخر متاح لإنشاء صورة RGB × 2048 × 2048. الصورة يتوافق مع FOV تحت المجهر(أي، 532.48 × 532.48 ميكرومتر، 0.26 ميكرومتر لكل بكسل). يجب أن تحتوي الصورة على خلفية سوداء (0، 0، 0).
      ملاحظة: يمكن استخدام عدد من محرري الصور التجارية والمجانية لإنشاء أقنعة ROI للترخيصة بمساعدة الليزر. على الرغم من أننا نستخدم أدوبي فوتوشوب لتوليد الأقنعة ، GIMP و ImageJ / فيجي وتتوفر أيضا كخيارات حرة بديلة.
   2. رسم 8 - 12 أبيض (255،255،255) أنماط على خلفية سوداء. يختلف حجم النمط حسب نوع الخلية (يبلغ قطره ~ 200 بكسل). اترك مساحة فارغة 500 × 500 في وسط الصورة لتكفير البؤرة التلقائية. اترك مساحة كافية بين الأنماط المجاورة (>200 بكسل) وعند الحدود الخارجية ل FOV للحصول على الاجتثاث الأمثل ومرفق الخلية. تتوفر الأنماط المعروضة في هذا البروتوكول على Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
2. إعداد الماكرو
   1. انقر فوق القائمة ماكرو وحدد ماكرو جديد.
   2. استيراد رمز "Pattern_Stimulation" المتوفرة على Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) في إطار ماكرو جديد. حفظ هذا الجزء من التعليمات البرمجية إلى مجلد مناسب.
   3. افتح نافذة ماكرو جديدة أخرى واستورد رمز "Stage_Movement" المتوفر على Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). تأكد من أن "Stage_Movement" دليل العمل في هذا الرمز متطابقة مع ذلك في الخطوة 4.2.2. حفظ "Stage_Movement" التعليمات البرمجية إلى نفس المجلد في الخطوة 4.2.2.

5. توليد micropatterns باستخدام صورة الاستئصال

1. تشغيل المجهر وملحقاتها. تأكد من أن الليزر الأشعة تحت الحمراء قد ارتفعت درجة حرارتها بما فيه الكفاية قبل هذا.
2. نقل غطاء المغلفة PVA على حامل. للحصول على مجهر مستقيم، تأكد من أن سطح PVA مائل إلى الأسفل.
3. إضافة الماء إلى زوايا لتحقيق الاستقرار في coverlip وجبل حامل على مرحلة المجهر.
4. خفض الهدف وإضافة الماء على غطاء.
   ملاحظة: البروتوكول الموضح هنا هو الأمثل لهدف غمر المياه NA 25x/1.1. إذا تم استخدام هدف الغمر الجاف أو الزيت ، يجب استبدال الماء بوسيط غمر مناسب. عندما يتم استخدام هدف الغمر المياه لتوليد مجموعة micropattern كبيرة، قد يصبح التبخر قضية. إذا كان هذا هو الحال، ينبغي استبدال المياه مع GenTeal، ومواد تشحيم العين دون وصفة طبية المتاحة من الصيدليات.
5. في برنامج المجهر، قم بتشغيل مصراع ليزر الأشعة تحت الحمراء في نافذة واجهة المستخدم الرسومية MP A1plus. انقر على زر المحاذاة التلقائية لمحاذاة الليزر قبل النقش.
   ملاحظة: من الضروري إجراء المحاذاة التلقائية بالليزر في بداية كل جلسة النقش كما الانحرافات الصغيرة في مسار الليزر سيؤثر بشكل كبير على جودة الأنماط.
6. التبديل إلى التكوين البصري "صورة". في إطار واجهة المستخدم الرسومية A1plus Compact، انقر فوق المسح الضوئي لمسح FOV أثناء تحريك الهدف ببطء أقرب إلى غطاء الغطاء.
7. مراقبة الصورة بعناية. في البداية، ستظهر الصورة باهتة للغاية. حرك الهدف أقرب إلى غطاء الغطاء حتى تزداد سطوع الصورة. هذا هو سطح الغطاء الذي يواجه الهدف. الاستمرار في تحريك الهدف حتى ينخفض السطوع ويزيد مرة أخرى. هذا هو سطح PVA لتكون منقوشة. التركيز على أي ميزة صغيرة (عيوب coverlip، الغبار، الخ)على هذا السطح وتعيين صفر على محرك Z. تعيين الصفر دائما بعد التركيز.
   ملاحظة: على الرغم من أن كلا السطحين من غطاء المغلفة مع PVA، لا يتم تغيير الخصائص البصرية للزجاج بشكل كبير من قبل طلاء PVA. نحن صورة روتينية مثل هذه الأغطية مع الجافة والماء والنفط الغمر الأهداف ولم تجد سطح PVA غير منقوشة تتداخل مع التصوير.
8. التبديل إلى التكوين البصري "Label_Surface". انقر على التقاط. العودة إلى "التصوير" التكوين البصري والمسح الضوئي. يجب أن يتلف السطح الزجاجي ويبدو غير متبلور. المنطقة المتضررة مرئية بالعين المجردة، مما يشير إلى موقع الأنماط في تجارب أخرى.
   ملاحظة: لزيادة حجم التسمية المرئية كرر الخطوة 5.8 في عدة FOVs المجاورة.
9. تحقق مرة أخرى أن الهدف هو تقريبا في وسط coverslip. تأكد من وجود مياه كافية بين الهدف و غطاء الغطاء. نقل المرحلة من 1 إلى 2 FOVs لتجنب جزيئات الزجاج ومسح للتأكد.
10. في القائمة الأجهزة، افتح الماكرو Stage_Movement. تحقق من صحة دليل العمل Pattern_Stimulation; إذا لم يكن كذلك، لن يحدث التحفيز. تعيين المتغيرات "PatternLength" و "PatternHeight" إلى العدد المطلوب من FOVs التي سيتم نقش. حفظ الماكرو وتشغيله.
11. بعد اكتمال النقش، انتقل إلى التكوين البصري "التصوير". مرة أخرى، تحقق من أن مصراع ليزر الأشعة تحت الحمراء مفتوح في نافذة واجهة المستخدم الرسومية MP A1plus.
12. حرك المرحلة لعرض الأنماط. مسح من خلال أنماط للتحقق من جودتها.
13. نقل غطاء إلى مربع الشبكة، مع أنماط تواجه ما يصل.
14. أغطية منقوشة مخزن في +4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الاستخدام.

6. فيبروكتين الامتزاز

1. جعل جديدة 1 M NaBH₄ في 1 M NaOH الحل. إضافة في نسبة 1:100 إلى الحموضة 8.0 العازلة الفوسفات التي تحتوي على 0.2 الميثانولامين M.
2. نقل الأغطية المنقوشة إلى طبق زراعة الأنسجة 35 ملم. احتضان كل coverslip مع 1 مل من الحل أعلاه لمدة 8 دقائق لإرواء autofluorescence، ومن ثم شطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
3. تمييع فيبروكتين (FN) في برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل. احتضان الغطاء في FN لمدة ساعة واحدة عند +37 درجة مئوية.
   ملاحظة: إذا لوحظ ربط كبير غير محدد من بروتين ECM إلى الركيزة، يمكن تخفيف FN في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ Pluronic F-127²⁴.
4. غسل غطاء 2 مرات مع برنامج تلفزيوني. إذا لم تستخدم على الفور، وتخزينها في برنامج تلفزيوني في +4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

7. مرفق الخلية

ملاحظة: البروتوكول التالي هو الأمثل للخلايا الليفية gingival الإنسان الأساسي.

1. ثقافة طبق 10 سم من الخلايا إلى التقاء 70٪.
2. الاحماء وسائل الإعلام ثقافة الخلية، برنامج تلفزيوني و0.05٪ تريبسين في حمام مائي +37 درجة مئوية.
   ملاحظة: بالنسبة للخلايا التي تلتزم بشكل ضعيف بالركيزة، قد يزيد التفكك غير البروتيوليكي مع الآيات (0.48 mM EDTA) أو المخزن المؤقت الخالي من الإنزيم من ارتباط الخلية بالأنماط ويجب النظر فيه.
3. قبل بذر الخلايا، نقل غطاء منقوشة إلى طبق نظيف زراعة الأنسجة 35 ملم تحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني دافئ.
4. يستنشق وسائط ثقافة الخلية من طبق زراعة الأنسجة 10 سم ويغسل مرة واحدة مع PBS.
5. أضف 700 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين/ EDTA إلى الطبق واحتضن الخلايا في حاضنة +37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ لمدة دقيقة واحدة.
6. في غضون ذلك ، يستنشق برنامج تلفزيوني تغطي coverlip منقوشة وإضافة 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
7. تأكد من انفصال الخلايا. ثم إعادة إنفاق الخلايا المثقبة مع 10 مل من وسائط ثقافة الخلية وإضافة 1 مل إلى غطاء المنقوشة.
8. خلايا الثقافة في الحاضنة لمدة 2-3 ساعة وتحقق مما إذا كان عدد كاف من الخلايا قد تعلق على أنماط. إذا كان الأمر كذلك، قم بتغيير الوسائط مرة واحدة لإزالة الخلايا غير المرفقة. وهذا يقلل من فرصة هبوط خلايا متعددة على نفس النمط.
   ملاحظة: قد يختلف وقت المرفقات حسب نوع الخلية.
9. بعد آخر 3-4 ساعة، أو عندما يكون عدد كاف من الخلايا قد انتشرت على أنماط، والخلايا على استعداد لمزيد من التجارب. لا تنتظر طويلا لتجنب انقسام الخلية.

8. الحصول على البيانات

1. إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA في الهيكل الخلوي العازلة²⁷ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. اتبع بروتوكولات الفلورة المناعية المنشأة للبروتينات ذات الاهتمام. تعمل الأغطية المغلفة ب PVA بشكل جيد مع أي بروتوكول للفلوراسة المناعية.
3. الحصول على صور الخلايا باستخدام المجهر المناسب. اعتمادا على الهدف من التجربة، صورة إما واحدة أو خلايا متعددة لكل FOV.

9. تحليل الصور

ملاحظة: يسمح البروتوكول التالي للمستخدمين بالحصول على متوسط إشارة الفلورسينس للبروتين الذي يهم على عدد كبير من الخلايا من Z-stacks من صور المجهر.

1. افتح الصور المكتسبة في عناصر NIS واقص الصور. تأكد من أن كل صورة تحتوي على خلية واحدة فقط منتشرة بشكل جيد. يمكن العثور على إرشادات مفصلة حول معالجة الصور في البرنامج النصي أدناه.
2. تثبيت أناكوندا وإطلاق سبايدر من خلال أناكوندا نافيجيتور.
   ملاحظة: يمكن تشغيل البرامج النصية .py في أي بيئة مع الحزم المناسبة المعرفة في المتطلبات.txt. نوصي أناكوندا لأنه يحتوي على معظم الحزم المطلوبة للرموز أدناه.
3. تحميل البرنامج النصي من Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) ومفتوحة في سبايدر ("Pattern_Averaging_3Channels.py" أو "Pattern_Averaging_4Channels.py" للصور مع 3 قنوات أو 4 قنوات، على التوالي).
4. تعيين المعلمات استنادا إلى الصور المكتسبة. راجع البرنامج النصي للحصول على أوصاف مفصلة.
5. اضغط F5 لتشغيل البرنامج النصي. يمكن تعقب التقدم في لوحة وحدة التحكم.
6. استرداد ملفات الإخراج المحفوظة في نفس المجلد. صور الإخراج هي متوسط كل قناة لجميع العينات. تظهر ورقة excel متوسط كثافة كل قناة داخل خلية عينة، مما يتيح المزيد من التحليل الكمي.

النتائج

وتعتمد جودة البيانات التجريبية التي يتم الحصول عليها من خلال الترنيم الدقيق إلى حد كبير على جودة الأنماط. لتحديد نوعية الأنماط المتولدة مع الطريقة المذكورة أعلاه ، استخدمنا أولا المجهر العاكس لتقييم شكل وحجم المناطق المائلة للصور من الغطاء. وجدنا أن كل نمط فردي يشبه إلى حد كبير قناع الاستئصال وعرض الحدود واضحة وسطح التي تعكس الضوء بشكل موحد(الشكل 2B). يمكن طباعة مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام اعتمادا على بنية الهيكل الخلوي المطلوبة ، لكننا استخدمنا شكل القوس والنشاب الذي يناسب أغراضنا. وك...

المناقشة

تظهر النتائج أعلاه أن بروتوكول التجزئ المصغر بمساعدة IR الموصوف بالليزر (microphotopatterning) يوفر أنماطا قابلة للاستنساخ من مختلف الأشكال التي تمكن من التلاعب في شكل الخلية والهندسة الهيكلية الخلوية. على الرغم من أن العديد من أساليب micropatterning قد وضعت قبل وبعد ظهورها لأول مرة من microphotopatterning، هذه الطريقة تمتلك العديد من المزايا. أولا، لا يتطلب معدات متخصصة وغرف تنظيف التي عادة ما توجد فقط داخل الإدارات الهندسية. في الواقع ، كما المجاهر متعددةفوتون أصبحت مشهدا أكثر شيوعا في أقسام البيولوجيا ، microphotopatt...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
(3-أمينوبروبيل) تريميثوكسيسيلان	ألدريتش	281778
10 سم طبق زراعة الخلايا	VWR	10062-880	البوليسترين ، TC المعالج ، تنفيس
25X Apo LWD الماء غمس الهدف	نيكون	MRD77225
3.5 سم طبق زراعة الخلايا	VWR	10861-586	البوليسترين ، TC المعالج ، تنفيس
4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	محلول حراري	62248	1 مجم / مل ثنائي هيدروكلوريد
الأبقار سيرين ألبومين	BioShop	ALB005
Dulbecco's Dulbecco's Boupped Phosphate-Spice	Saline Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg / mL في درجة الحموضة 7.5 عازلة
Fibronectin الأجسام المضادة	BD	610077	ماوس
فيجي	ImageJ		الإصدار 1.53c
الفلورسنت الفالودين	Invitrogen	A12380	568nm
غطاء زجاجي	VWR	16004-302	22 & 22 مم
المجهر	الإلكتروني الجلوتارالديهايد	16220	مائي 25٪
حمض الهيدروكلوريك	كاليدون	6025-1-29	37٪ محلول مائي
الأشعة تحت الحمراء ليزر	متماسك	الحرباء رؤية
الحد الأدنى الأساسي المتوسط &	Gibco	12561-056
تصاعد متوسط	Sigma	F4680
الماوس الثانوية خلية الأجسام المضادة	تقنية	إشارات 4408S	الماعز ، 488 نانومتر
مجهر متعدد الفوتون	نيكون	A1R MP +
Myosin تقنية إشارات الخلايا المضادة ذات السلسلة الخفيفة		3672S	أرنب
NIS عناصر	نيكون		الإصدار 5.21.03
حمض النيتريك	كاليدون	7525-1-29	محلول مائي 70٪
فوتوشوب	أدوبي		الإصدار 21.2.1
بلورونيك F-127	سيجما	P2443	مسحوق
بولي (فينيل ألكهول)	ألدريتش	341584	ميجاوات 89000-98000 ، 98٪
إشارات خلايا	الأجسام المضادة الثانوية للأرانب	المتحللة بنسبة 98٪ 4412S	ماعز ، 488 نانومتر
شاكر	VWR	10127-876	المعروف أيضا باسم الروك التناظري
الصوديوم بوروهيدريد	ألدريتش	452882	مسحوق
هيدروكسيد الصوديوم	سيجما ألدريتش	S8045
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة	سيجما	S5136	مسحوق
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة	سيجما	S5011	مسحوق
سبايدر	أناكوندا	4.1.4
محلول مائي Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05٪ مع 0.53 ملي مولار EDTA