تلطيخ السيتوبلازمية Ca2+ مع فلوو-4/AM في لب التفاح

ملخص

تم تحميل البروتوبلاستات المعزولة لخلايا لب التفاح بكاشف فلوري للكالسيوم للكشف عن تركيز Ca²⁺ السيتوبلازمي.

الملخص

Cytosolic Ca^{2 +} يلعب دورا رئيسيا في تطوير النبات. تصوير الكالسيوم هو الأسلوب الأكثر تنوعا للكشف عن التغيرات الديناميكية في Ca^{2 +} في السيتوبلازم. في هذه الدراسة، حصلنا على بروتوبلاستس قابلة للحياة من خلايا اللب عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. تم احتضان البروتوبلاست المعزول مع كاشف الفلورسنت صغير الجزيء (Fluo-4/AM) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. المسابير الفلورية ملطخة بنجاح cytosolic Ca^{2 +} ولكن لم تتراكم في vacuoles. La³⁺، مانع قناة Ca^{2 +} ، انخفض كثافة الفلورية السيتوبلازمية. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام Fluo-4/AM للكشف عن التغيرات في السيتوسوليك Ca²⁺ في لحم الفاكهة. باختصار، نقدم طريقة لعزل البروتوبلاست بشكل فعال من خلايا اللحم في الفاكهة والكشف عن Ca²⁺ عن طريق تحميل كاشف فلوري الكالسيوم صغير الجزيء في السيتوبلازم لخلايا اللب.

المقدمة

Ca^{2 +} يلعب دورا هاما في نقل إشارة النبات والتمثيل الغذائي^1،2. علاوة على ذلك ، فإنه ينظم سمات جودة الفاكهة^3،4، بما في ذلك صلابة ، محتوى السكر ، والتعرض للاضطرابات الفسيولوجية أثناء التخزين^5،6. السيتوبلازمية Ca^{2 +} يلعب دورا هاما في نقل الإشارات وينظم نمو النبات والتنمية⁷. اضطراب التوازن الكالسيوم الخلوي يمكن أن تحفز حفرة مريرة في التفاح⁸، مرض بقعة بنية اللون في الكمثرى⁹، وتعفن السرة في الطماطم

البروتوكول

1. استخراج بروتوبلاست

1. إعداد الحل الأساسي: 20 م م كل₂، 5 م 2 -(N-morpholino) حمض الإيثانسولفونيك، و 0.4 M D-sorbitol.
   ملاحظة: تم ضبط درجة الحموضة للمحلول الأساسي إلى 5.8 مع 0.1 متر تريس العازلة، وتصفيتها من خلال 0.22 ميكرومتر مرشحات للذوبان في الماء، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
2. إعداد الحل الأنزيمي: مزيج 0.3٪ (ث / v) Macerozyme R-10 و 0.5٪ (ث / v) cellulase R-10 مع الحل الأساسي.
3. أضف 0.5 مل من المحلول الأنزيمي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. اختيار تفاحة صحية وناضجة. ثم شريحة اللب إلى 10 × 5 × 1 مم³ حجم (الشكل 1A-1C).
4. ضع قطع لب فاكهة التفاح في أن....

النتائج

بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، استخدمنا الأسلوب الأنزيمي للحصول على بروتوبلاست قابلة للحياة من اللب(الشكل 1). وكان بعض protoplasts vacuoles ، في حين أن البعض الآخر لا. في حين أن protoplasts أظهرت أي مضان عندما لم يتم تحميل مؤشر Ca^{2 +} الفلورسنت فيها. عندما تم تحميل Fluo-4/AM في protoplasts ، أصبح السيتوبلازم ، ولكن ليس الفسكول ، فلوريا(الشكل 2). وأشارت هذه النتيجة إلى أن فلوو-4/AM ملطخة بنجاح Ca²⁺ في السيتوبلازم وأنه لم يلاحظ أي تقسيم

المناقشة

في هذه الدراسة ، تم الحصول على protoplasts قابلة للحياة عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. لاحظ أن هذا الأسلوب يتطلب التفاح الطازج. ويسمح هذا البروتوكول بالعزل السريع لعدد كبير من المواد الأولية عن لب الفاكهة لاستخدامها في الدراسات البحثية. ولا يقتصر تطبيق هذه الطريقة على 'فوجي'؛ بل إن المسألة هي أن المسألة لا تقتصر على 'فوجي'؛ بل هي مسألة لا يمكن أن تكون كذلك. ويمكن أيضا أن تستخرج من خلال بروتوكول واحد(الشكل التكميلي S4)البروتوبلاستس من لب التفاح من 'دونان' و 'العسل كريسب'). يحتوي محلول البروتوبلاست بعد ان.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10 & مرات ؛ محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Solarbio	P1022	PBS (محلول مخزن للفوسفات) هو محلول عازل للفوسفات ، والذي يمكن أن يوفر بيئة أيونية مستقرة نسبيا وقدرة تخزين مؤقت للأس الهيدروجيني. إنه محلول ملح عازل يستخدم غالبا في علم الأحياء للاستنساخ الجزيئي وزراعة الخلايا. الرقم الهيدروجيني هو 7.4.
2- (N-morpholino) حمض الإيثان سلفونيك	Solarbio	M8010	العازلة البيولوجية
CaCl 2< / sub> & middot ؛ 2H2< / sub>O	Solarbio	C8370	ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم مادة كيميائية بيضاء أو رمادية ، معظمها في شكل حبيبي.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	تدهور جدران الخلايا النباتية.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	له خصائص ترطيب جيدة ، ويمنع الجفاف ، ويمنع السكر والملح وما إلى ذلك من التبلور.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 عبارة عن بوليول خافض للتوتر السطحي غير أيوني (الوزن الجزيئي حوالي 12500 دالتون) ، والذي وجد أنه مفيد لتعزيز إذابة الأصباغ غير القابلة للذوبان في الماء والمواد الأخرى في الوسائط الفسيولوجية.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA عبارة عن ركيزة إستيراز خلوية يمكن أن تكون بمثابة مسبار للجدوى يقيس كلا من النشاط الأنزيمي ، وهو أمر مطلوب لتنشيط التألق ، وسلامة غشاء الخلية ، وهو أمر مطلوب للاحتفاظ داخل الخلايا بمنتجها الفلوري.
Fluo-4 / AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	مؤشر الكالسيوم الفلوري الأخضر Fluo-4 / AM هو نسخة محسنة من مؤشر الكالسيوم Fluo-3 / AM. يتم تحميل Fluo-4 / AM بشكل أسرع ويكون أكثر إشراقا بنفس التركيز. يمكن أن يكون متحمسا جيدا مع ليزر أيون الأرجون 488 نانومتر.
مجهر مضان	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	راقب الصورة الفلورية.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	تحلل الأنسجة النباتية لفصل الخلايا المفردة.
تريس	سولاربيو	T8060	يستخدم على نطاق واسع في تحضير المخازن المؤقتة في تجارب الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.