مقالة منهجية

تلطيخ السيتوبلازمية Ca2+ مع فلوو-4/AM في لب التفاح

4.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62526

⸱

نوفمبر 6, 2021

 ,  ,  , 
1College of Horticulture, Qingdao Agricultural University

في هذه المقالة

ملخص

تم تحميل البروتوبلاستات المعزولة لخلايا لب التفاح بكاشف فلوري للكالسيوم للكشف عن تركيز Ca2+ السيتوبلازمي.

الملخص

Cytosolic Ca2 + يلعب دورا رئيسيا في تطوير النبات. تصوير الكالسيوم هو الأسلوب الأكثر تنوعا للكشف عن التغيرات الديناميكية في Ca2 + في السيتوبلازم. في هذه الدراسة، حصلنا على بروتوبلاستس قابلة للحياة من خلايا اللب عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. تم احتضان البروتوبلاست المعزول مع كاشف الفلورسنت صغير الجزيء (Fluo-4/AM) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. المسابير الفلورية ملطخة بنجاح cytosolic Ca2 + ولكن لم تتراكم في vacuoles. La3+، مانع قناة Ca2 + ، انخفض كثافة الفلورية السيتوبلازمية. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام Fluo-4/AM للكشف عن التغيرات في السيتوسوليك Ca2+ في لحم الفاكهة. باختصار، نقدم طريقة لعزل البروتوبلاست بشكل فعال من خلايا اللحم في الفاكهة والكشف عن Ca2+ عن طريق تحميل كاشف فلوري الكالسيوم صغير الجزيء في السيتوبلازم لخلايا اللب.

المقدمة

Ca2 + يلعب دورا هاما في نقل إشارة النبات والتمثيل الغذائي1،2. علاوة على ذلك ، فإنه ينظم سمات جودة الفاكهة3،4، بما في ذلك صلابة ، محتوى السكر ، والتعرض للاضطرابات الفسيولوجية أثناء التخزين5،6. السيتوبلازمية Ca2 + يلعب دورا هاما في نقل الإشارات وينظم نمو النبات والتنمية7. اضطراب التوازن الكالسيوم الخلوي يمكن أن تحفز حفرة مريرة في التفاح8، مرض بقعة بنية اللون في الكمثرى9، وتعفن السرة في الطماطم10، مما يؤثر على جودة الفاكهة ويسبب خسائر اقتصادية شديدة3،11. التصوير بالكالسيوم لديه ما يكفي من الدقة المكانية والزمنية وهو وسيلة هامةلمراقبة ديناميات Ca 2 + في الخلايا الحية12،13.

في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان رئيسيتان لتصوير الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الحية: واحدة تستخدم مسابير فلورية كيميائية صغيرة جزيئية14، والأخرى هي مستشعر ترميز الجينات (GECI)15،16. نظرا لصعوبة إنشاء نظام معدل وراثيا مستقر في أشجار الفاكهة وتطوير الفاكهة لفترة أطول ، فإن GECIS غير مناسب لتصوير الفاكهة Ca2 + fluorescence.

مسابير الفلورسنت جزيء صغير مثل فلوو-4/AM لها ميزة خاصة: شكلها إستر AM (الخلية نفاذية أستوكسي ميثيل استر مشتق) يمكن بسهولة الجزء الأكبر تحميلها في الخلايا الحية دون الحاجة إلى الترافيكتيون، مما يجعلها مرنة وسريعة وغير سامة للخلايا17. فلوو-4/AM يمكن تحميلها بنجاح في أنبوب حبوب اللقاح من Pyrus pyrifolia18 وبيتونيا،19 وكذلك في خلايا الحراسة20 والشعر الجذر من Arabidopsis21.

في الوقت الحاضر، وهناك تقارير قليلة عن تلطيخ مضان الكالسيوم من خلايا اللب22. كعنصر معدني مهم، يلعب الكالسيوم دورا رئيسيا في نمو ومراقبة جودة ثمار الأشجار مثل التفاح. ومن المسلم به عالميا أشجار التفاح كنوع اقتصادي مهم، والتفاح تعتبر الغذاء الصحي23. في هذه الدراسة، حصلنا على protoplasts قابلة للحياة من لب فاكهة التفاح من خلال التحلل المائي الأنزيمي ومن ثم تحميل الكواشف الفلورية جزيء صغير في السيتوبلازم للكشف عن Ca2 +.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. استخراج بروتوبلاست

  1. إعداد الحل الأساسي: 20 م م كل2، 5 م 2 -(N-morpholino) حمض الإيثانسولفونيك، و 0.4 M D-sorbitol.
    ملاحظة: تم ضبط درجة الحموضة للمحلول الأساسي إلى 5.8 مع 0.1 متر تريس العازلة، وتصفيتها من خلال 0.22 ميكرومتر مرشحات للذوبان في الماء، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. إعداد الحل الأنزيمي: مزيج 0.3٪ (ث / v) Macerozyme R-10 و 0.5٪ (ث / v) cellulase R-10 مع الحل الأساسي.
  3. أضف 0.5 مل من المحلول الأنزيمي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. اختيار تفاحة صحية وناضجة. ثم شريحة اللب إلى 10 × 5 × 1 مم3 حجم (الشكل 1A-1C).
  4. ضع قطع لب فاكهة التفاح في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل يحتوي على محلول إنزيمي ثم أغلق الأنبوب(الشكل 1D).
  5. احتضان أنبوب في 28 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ويهتز في 70 دورة في الدقيقة في شاكر في الظلام.
  6. غسل قطع اللب. أسبيرات جميع الحل الأنزيمي ومن ثم إضافة 0.5 مل من الحل الأساسي.
  7. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
  8. للحصول على تعليق بروتوبلاست، يستنشق الحل من أسفل أنبوب الطرد المركزي(الشكل 1E).

2. جزيء صغير الكالسيوم أيون تلطيخ مضان

  1. إعداد حل تحميل Fluo-4/AM مع 2 mM Fluo-4/AM و 20٪ F-127 و 10x فوسفات عازلة المالحة (PBS:80 mM Na2HPO4, 1.36 M NaCI, 20 mM KH2PO4, و 26 mM KCI) بنسبة 1:1:2.
  2. أضف 1 ميكرولتر من محلول التحميل Fluo-4/AM إلى 99 ميكرولتر من التعليق الأولي الموجود في أنابيب الطرد المركزي التي يبلغ 1.5 مل. تأكد من أن التركيز النهائي للصبغة الفلورية هو 5 ميكرومتر.
  3. La3+ العلاج: إعداد 100 ميكرومتر La3+ حل مع 98 ميكرولتر من تعليق بروتوبلاست, 1 ميكرولتر من 10 م لا3+ ,و 1 ميكرولتر من Fluo-4/AM حل التحميل. خلط الحل وإغلاق الأنبوب.
  4. حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في الظلام.
  5. غسل البروتوبلاستات عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أسبيرات 70 ميكرولتر من الحل وإضافة 70 ميكرولتر من الحل الأساسي.
  6. احتضان تعليق بروتوبلست في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى إزالة استريفي تماما.
  7. أسبيرات 15 ميكرولتر من تعليق بروتوبلاست والتنقيط على الشريحة.
  8. مراقبة تحت المجهر مضان (الشكل التكميلي S1).
    ملاحظة: استخدم كاميرا ملونة ذات حساسية عالية، أي مستشعر CMOS بدقة 3.45 ميكرومتر (2048 × 1536).
  9. حدد قناة GFP للتصوير (20x). تعيين السطوع إلى 0.5.
    ملاحظة: الإضاءة هي مكعبات ضوء LED قابلة للتعديل مع مجموعة فلتر متكاملة مغلفة بقوة. الطول الموجي للإثارة فلوو-4/AM هو 490 نانومتر.

3. اختبار قابلية البقاء Protoplast

  1. إعداد محلول الأسهم فلورسسين دياسيتين (ادارة الاغذية والعقاقير): حل ادارة الاغذية والعقاقير في الأسيتون حتى التركيز النهائي هو 1 ملغ / مل.
  2. إعداد حل عمل ادارة الاغذية والعقاقير مع 1 ميكرولتر من محلول المخزون و 99 ميكرولتر من الأسيتون.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من حل عمل ادارة الاغذية والعقاقير إلى 99 ميكرولتر من تعليق بروتوبلاست. خلط الحل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا ومن ثم إغلاق الأنبوب.
    ملاحظة: التركيز النهائي للادارة الاغذية والعقاقير هو 100 ميكروغرام / لتر.
  4. وصمة عار في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام.
  5. إعداد الشرائح ومراقبة تحت المجهر مضان.
  6. حدد قناة GFP للتصوير (الشكل 1F).

4. تحليل الصور

  1. تحليل الصور المكتسبة باستخدام تحليل الصور وبرامج جداول البيانات (على سبيل المثال، Image-Pro Plus وExcel 2010).
  2. حدد قطرين عموديين من الأسطح الأولية لحساب كثافة الفلورسينس(الشكل التكميلي S2). قياس كثافة الفلورية من جميع protoplasts تحت علاجات مختلفة تم قياسها. للمعالجة النهائية، استخدم برنامج تحرير الصور.

5. التحليل الإحصائي

  1. إجراء تحليل إحصائي باستخدام البرامجالإحصائية (الشكل التكميلي S3). يتم تقديم البيانات في متوسط ± SD. تم استخدام اختبار الطالب لتحليلالاختلافات بين المجموعات التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، استخدمنا الأسلوب الأنزيمي للحصول على بروتوبلاست قابلة للحياة من اللب(الشكل 1). وكان بعض protoplasts vacuoles ، في حين أن البعض الآخر لا. في حين أن protoplasts أظهرت أي مضان عندما لم يتم تحميل مؤشر Ca2 + الفلورسنت فيها. عندما تم تحميل Fluo-4/AM في protoplasts ، أصبح السيتوبلازم ، ولكن ليس الفسكول ، فلوريا(الشكل 2). وأشارت هذه النتيجة إلى أن فلوو-4/AM ملطخة بنجاح Ca2+ في السيتوبلازم وأنه لم يلاحظ أي تقسيم

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، تم الحصول على protoplasts قابلة للحياة عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. لاحظ أن هذا الأسلوب يتطلب التفاح الطازج. ويسمح هذا البروتوكول بالعزل السريع لعدد كبير من المواد الأولية عن لب الفاكهة لاستخدامها في الدراسات البحثية. ولا يقتصر تطبيق هذه الطريقة على 'فوجي'؛ بل إن المسألة هي أن المسألة لا تقتصر على 'فوجي'؛ بل هي مسألة لا يمكن أن تكون كذلك. ويمكن أيضا أن تستخرج من خلال بروتوكول واحد(الشكل التكميلي S4)البروتوبلاستس من لب التفاح من 'دونان' و 'العسل كريسب'). يحتوي محلول البروتوبلاست بعد ان...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال مشروع تحسين التنوع الزراعي في مقاطعة شاندونغ (2019LZGC007) وفريق ابتكار شجرة الفاكهة التابع لنظام شاندونغ الحديث لتكنولوجيا الصناعة الزراعية (SDAIT-06-05).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 & مرات ؛ محلول ملحي مخزن بالفوسفاتSolarbioP1022PBS (محلول مخزن للفوسفات) هو محلول عازل للفوسفات ، والذي يمكن أن يوفر بيئة أيونية مستقرة نسبيا وقدرة تخزين مؤقت للأس الهيدروجيني. إنه محلول ملح عازل يستخدم غالبا في علم الأحياء للاستنساخ الجزيئي وزراعة الخلايا. الرقم الهيدروجيني هو 7.4. 
2- (N-morpholino) حمض الإيثان سلفونيكSolarbioM8010العازلة البيولوجية
CaCl 2< / sub> & middot ؛ 2H2< / sub>OSolarbioC8370ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم مادة كيميائية بيضاء أو رمادية ، معظمها في شكل حبيبي.
Cellulase R-10Yakult HonshaMX7352تدهور جدران الخلايا النباتية.
D-sorbitolSolarbioS8090له خصائص ترطيب جيدة ، ويمنع الجفاف ، ويمنع السكر والملح وما إلى ذلك من التبلور.
F-127Thermo Fisher ScientificP6867Pluronic F-127 عبارة عن بوليول خافض للتوتر السطحي غير أيوني (الوزن الجزيئي حوالي 12500 دالتون) ، والذي وجد أنه مفيد لتعزيز إذابة الأصباغ غير القابلة للذوبان في الماء والمواد الأخرى في الوسائط الفسيولوجية.
FDAThermo Fisher ScientificF1303FDA عبارة عن ركيزة إستيراز خلوية يمكن أن تكون بمثابة مسبار للجدوى يقيس كلا من النشاط الأنزيمي ، وهو أمر مطلوب لتنشيط التألق ، وسلامة غشاء الخلية ، وهو أمر مطلوب للاحتفاظ داخل الخلايا بمنتجها الفلوري.
Fluo-4 / AMThermo Fisher ScientificF14201مؤشر الكالسيوم الفلوري الأخضر Fluo-4 / AM هو نسخة محسنة من مؤشر الكالسيوم Fluo-3 / AM. يتم تحميل Fluo-4 / AM بشكل أسرع ويكون أكثر إشراقا بنفس التركيز. يمكن أن يكون متحمسا جيدا مع ليزر أيون الأرجون 488 نانومتر.
مجهر مضانThermo FisherEVOS Auto 2راقب الصورة الفلورية.
Macerozyme R-10Yakult HonshaMX7351تحلل الأنسجة النباتية لفصل الخلايا المفردة.
تريسسولاربيوT8060يستخدم على نطاق واسع في تحضير المخازن المؤقتة في تجارب الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.

المراجع

  1. Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. Fruit calcium: Transport and physiology. Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).
  2. Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling. Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).
  3. Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening. Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).
  4. Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).
  5. Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. Factors affecting apple fruit firmness--a review. Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).
  6. Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review. New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).
  7. Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions. New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).
  8. Miqueloto, A., et al. Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple. Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).
  9. Kou, X., et al. Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage. Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).
  10. Vinh, T. D., et al. Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth. The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).
  11. Yamane, T. Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees. Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).
  12. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  13. Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).
  14. Hirabayashi, K., et al. Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability. Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).
  15. Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics. Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
  16. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
  17. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  18. Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs. PLoS One. 11, 0152320(2016).
  19. Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia. Planta. 245 (5), 909-926 (2017).
  20. Sun, L., et al. NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells. Plant Science. 262, 81-90 (2017).
  21. Niu, Y. F., et al. Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).
  22. Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica. Horticulture Research. 7, 91(2020).
  23. Boyer, J., Liu, R. H. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).
  24. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
  25. Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia. New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).
  26. Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling. PLoS One. 3 (6), 2511(2008).
  27. DeSimone, J. A., et al. Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli. Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).
  28. Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).
  29. Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2. Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).
  30. Li, W., et al. A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium. Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).
  31. Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature. Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).
  32. Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia. Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).
  33. Wang, Y., et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs. BMC Plant Biology. 10, 53(2010).
  34. Fujimori, T., Jencks, W. P. Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion. Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fluo 4 AM

مقالات ذات صلة