تطوير أنسجة القلب البشرية المنظمة ثلاثية الأبعاد ضمن منصة ميكروفلويديك

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو شرح وإظهار تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للفلوريد الدقيق لأنسجة القلب البشرية المنحازة للغاية ، والمكونة من خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي تشارك في استزراعها مع الخلايا الليفية القلبية (CFs) داخل هيدروجيل حيوي قائم على الكولاجين ، للتطبيقات في هندسة أنسجة القلب ، وفحص الأدوية ، ونمذجة الأمراض.

Abstract

السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم لا يزال كما أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD). ومع ذلك ، فإن نمذجة التعقيد الفسيولوجي والبيولوجي لعضلات القلب ، عضلة القلب ، من الصعب تحقيقها في المختبر. أساسا، تكمن العقبات في الحاجة إلى خلايا القلب البشرية (CMs) التي هي إما الكبار أو تظهر الأنماط الظاهرية مثل الكبار ويمكن تكرار بنجاح تعقيد عضلة القلب الخلوية والهندسة المعمارية المعقدة 3D. لسوء الحظ ، بسبب المخاوف الأخلاقية وعدم وجود أنسجة القلب البشرية الأولية المشتقة من المريض ، إلى جانب الحد الأدنى من انتشار CMs ، كان الحصول على CMs البشرية القابلة للحياة خطوة محدودة لهندسة أنسجة القلب. وتحقيقا لهذه الغاية، تحولت معظم البحوث نحو التمايز القلبي للخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (hiPSCs) كمصدر رئيسي ل CMs البشرية، مما أدى إلى دمج hiPSC-CMs على نطاق واسع ضمن المقايسات المختبرية لنمذجة الأنسجة القلبية.

هنا في هذا العمل، ونحن نثبت بروتوكول لتطوير 3D ناضجة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة القلبية البشرية داخل جهاز microfluidic. نحن نشرح ونوضح بصريا إنتاج نموذج أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد في المختبر على رقاقة من CMs المشتقة من hiPSC. نحن نصف في المقام الأول بروتوكول تنقية لتحديد ل CMs، والثقافة المشتركة للخلايا مع نسبة محددة عن طريق خلط CMs مع CFs الإنسان (hCFs)، وتعليق هذه الثقافة المشتركة داخل الهيدروجيل القائم على الكولاجين. كما أننا نثبت حقن الهيدروجيل المحمل بالخلايا داخل جهازنا الدقيق الدقيق المحدد جيدا ، المضمن مع الأعمدة البيضاوية المتداخلة التي تعمل كتدبير سطحي للحث على درجة عالية من محاذاة الخلايا المحيطة ومصفوفة الهيدروجيل ، تحاكي بنية عضلة القلب الأصلية. ونحن نتصور أن النموذج المقترح 3D الأنسجة القلبية غير المثيلة على رقاقة مناسبة لدراسات البيولوجيا الأساسية, نمذجة الأمراض, ومن خلال استخدامه كأداة فحص, اختبار الأدوية.

Introduction

وقد تم استكشاف نهج هندسة الأنسجة على نطاق واسع، في السنوات الأخيرة، لمرافقة في النتائج السريرية في الجسم الحي في الطب التجديدي والنمذجة المرض^1،2. وقد تم التركيز بشكل خاص على نمذجة الأنسجة القلبية في المختبر بسبب الصعوبات الكامنة في مصادر الأنسجة القلبية الأولية البشرية وإنتاج بدائل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر ، مما يحد من الفهم الأساسي للآليات المعقدة لأمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs)^1،3. وقد شملت النماذج التقليدية في كثير من الأحيان 2D مقايسات ثقافة أحادية الطبقة. ومع ذلك ، فإن أهمية زراعة خلايا القلب داخل بيئة ثلاثية الأبعاد لمحاكاة كل من المناظر الطبيعية الأصلية للقلب والتفاعلات الخلوية المعقدة قد تميزت على نطاق واسع^4،5. بالإضافة إلى ذلك، شملت معظم النماذج المنتجة حتى الآن ثقافة أحادية من CMs تختلف عن الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، يتكون القلب من أنواع خلايا متعددة⁶ داخل بنية ثلاثية الأبعاد معقدة⁷، مما يبرر الحاجة الماسة لتحسين تعقيد تكوين الأنسجة داخل نماذج المختبر ثلاثية الأبعاد لمحاكاة المكونات الخلوية للقلب العضلي الأصلي بشكل أفضل.

حتى الآن، تم استكشاف العديد من النهج المختلفة لإنتاج نماذج 3D المحاكاة الحيوية من عضلة القلب⁸. وتتراوح هذه النهج من الاجهزة التجريبية التي تسمح لحساب في الوقت الحقيقي من القوة المتولدة، من CMs أحادية الثقافة المصنفة على أفلام رقيقة (تعتبر الأفلام رقيقة العضلات (MTFs))^9،إلى الخلايا القلبية المشاركة في الثقافة 3D المصفوفات هيدروجيل علقت بين cantilevers قائمة بذاتها (تعتبر أنسجة القلب المهندسة (EHTs))¹⁰. وقد ركزت نهج أخرى على تنفيذ تقنيات micromolding لتقليد أنيسوتروبي عضلة القلب, من CMs أحادية الثقافة في هيدروجيل 3D علقت بين microposts جاحظ في التصحيح الأنسجة¹¹, إلى CMs أحادية الثقافة المصنفة بين microgrooves البادئة^12,13. ولذلك، فإن من المناسب استخدام هذه التقنية التي تتماشى مع التطبيق المقصود والمسألة البيولوجية المقابلة له، هناك مزايا وعيوب متأصلة لكل من هذه الأساليب.

القدرة على تعزيز نضوج CMs المستمدة من الخلايا الجذعية أمر ضروري للهندسة المختبرية الناجحة للأنسجة عضلة القلب الشبيهة بالبالغين وترجمة النتائج اللاحقة إلى التفسيرات السريرية. وتحقيقا لهذه الغاية، تم استكشاف أساليب لنضوج CMs على نطاق واسع، سواء في 2D و^{3D 14،15،16}. على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي المدمج في EHTs، المحاذاة القسرية لل CMs مع تضاريس السطح، إشارات الإشارات، عوامل النمو من الثقافة المشتركة، و / أو ظروف الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد، وما إلى ذلك، كلها تؤدي إلى تغيير لصالح نضوج CM في واحد على الأقل من ما يلي: مورفولوجيا الخلايا، مناولة الكالسيوم، بنية الساركوميري، التعبير الجيني، أو القوة الانقباشية.

ومن بين هذه النماذج، تحتفظ النهج التي تستخدم منصات microfluidic بمزايا معينة في الطبيعة، مثل التحكم في التدرجات، ومحدودية إدخال الخلايا، والحد الأدنى من الكواشف اللازمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتولد العديد من التكرارات البيولوجية في وقت واحد باستخدام منصات microfluidic، مما يخدم لتشريح أفضل الآلية البيولوجية من الفائدة وزيادة حجم العينة التجريبية لصالح السلطة الإحصائية^17،18،19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام التصوير الضوئي في عملية تصنيع الجهاز microfluidic يمكن من إنشاء ميزات دقيقة (مثل الطبوغرافيات) على مستوى الدقيقة والنانو ، والتي تعمل كعظة تلسكوبية لتعزيز البنية الخلوية المحيطة وهندسة الأنسجة على المستوىالكلي^18و20و²¹و²² للتطبيقات المختلفة في تجديد الأنسجة ونمذجة الأمراض.

أظهرنا سابقا تطوير نموذج جديد للأنسجة القلبية ثلاثية الأبعاد على الشريحة يتضمن تضاريس سطحية ، في شكل أعمدة بيضاوية فطرية ، لمحاذاة خلايا القلب المشاركة في زراعة الهيدروجيل في نسيج متداخل وغير متماثل^20. بعد 14 يوما من الثقافة ، تكون الأنسجة التي تشكلت داخل الجهاز microfluidic أكثر نضجا في النمط الظاهري ، وملف التعبير الجيني ، وخصائص التعامل مع الكالسيوم ، والاستجابة الصيدلانية بالمقارنة مع الضوابط أحادية الطبقة و3D isotropic²³. يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقة إنشاء هذا النسق ثلاثي الأبعاد المشترك، والمنسق (أي anisotropic) أنسجة القلب البشرية داخل الجهاز microfluidic باستخدام CMs المشتقة من hiPSC. على وجه التحديد، ونحن نشرح أساليب لتمييز وتنقية hiPSCs نحو CMs، ومكملات hCFs مع CMs لإنتاج السكان الثقافة المشتركة المنشأة، وإدراج السكان الخلية مغلفة داخل هيدروجيل الكولاجين في الأجهزة microfluidic، والتحليل اللاحق للأنسجة 3D شيدت من خلال المقايسات الإنقباعي والمناعة. الأنسجة الدقيقة المهندسة ثلاثية الأبعاد الناتجة مناسبة لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسات البيولوجيا الأساسية ، والنمذجة القلبية الوعائية ، والاختبارات الصيدلانية.

Protocol

تنفيذ جميع معالجة الخلية وإعداد الكاشف داخل خزانة السلامة البيولوجية. تأكد من أن جميع الأسطح والمواد والمعدات التي تتلامس مع الخلايا معقمة (أي الرش بالإيثانول بنسبة 70٪). يجب استزراع الخلايا في_حاضنة رطبة تبلغ 37 درجة مئوية، 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. يتم تنفيذ جميع ثقافة hiPSC والتمايز في لوحات 6-well.

1. إنشاء جهاز Microfluidic (المدة التقريبية: 1 أسبوع)

1. التصوير الضوئي
   ملاحظة: القناع، المصمم باستخدام ملف CAD (المتوفر كملف تكميلي 1)،يحتوي على تصميم القناة microfluidic. طباعة التصميم على قناع شفاف. ثم، قم بإجراء التصوير الضوئي القياسي باستخدام جهاز التصوير الضوئي السلبي SU8 2075 على رقاقة سيليكون مقاس 4 بوصات داخل غرفة نظيفة.
   1. تنظيف رقاقة السيليكون مع الكحول isopropyl (IPA) وجافة مع النيتروجين. خبز في 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للجفاف.
      ملاحظة: التعامل مع رقاقة مع ملاقط رقاقة.
   2. ضع الرقاقة في المعطف الدوار. إيداع 3-4 مل من SU8 في وسط رقاقة، ثم تدور لتشكيل طبقة من 200 ميكرومتر (أي، تكثف 15 ثانية إلى 500 دورة في الدقيقة، تدور لمدة 10 ثانية، تكثف 5 ق إلى 1200 دورة في الدقيقة، وتدور لمدة 30 ثانية، ثم downspin لمدة 15 ثانية حتى توقف).
   3. إزالة رقاقة وخبز لينة لمدة 7 دقائق في 65 درجة مئوية، ثم 45 دقيقة في 95 درجة مئوية.
   4. حرك الرقاقة إلى محاذاة قناع وضع القناع الشفاف في حامل القناع مع فلتر الأشعة فوق البنفسجية. يعرض الرقاقة لدورتين من 230 مج/سم^2،مع تأخير 30 ثانية، لتعرض إجمالي قدره 460 م ج/سم^2.
   5. قم بعمل خبز بعد التعرض على الرقاقة المكشوفة في فرن 50 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   6. إيقاف الفرن في صباح اليوم التالي، وبعد رقاقة قد بردت إلى درجة حرارة الغرفة، وغمرها في SU8 المطور. إزالة رقاقة من المطور كل 5 دقائق ويغسل مع وكالة الألعاب الشعبية، ثم وضعه مرة أخرى في المطور.
   7. بعد حوالي 20 دقيقة، أو عندما يعمل IPA واضحة، وتجفيف رقاقة مع النيتروجين الهواء والخبز الثابت في فرن تعيين إلى 150 درجة مئوية. بمجرد أن يصل الفرن إلى 150 درجة مئوية، قم بإيقاف تشغيله ولكن لا تفتح. اترك الرقاقة في الفرن حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم أزيلي الرقائق.
   8. تأكد من ارتفاع SU8 مع مقياس التنميط والميزات البصرية مع المجهر الخفيف. بمجرد التأكد، الشريط رقاقة داخل طبق بيتري البلاستيك 150 ملم.
2. الطباعة الحجرية الناعمة
   ملاحظة: الرقاقة، المسجلة على طبق بيتري، تحتاج إلى أن تكون silanized لمنع الالتزام PDMS إلى ميزات SU8.
   1. عكس رقاقة (استغلالها إلى طبق بيتري البلاستيك) على طبق بيتري الزجاج من نفس الحجم التي تحتوي على 0.4 مل من ميثيلتريكلوروسيلين (MTCS) وتعريض رقاقة للأبخرة لمدة 4 دقائق. بدوره رقاقة تستقيم ووضع الغطاء على طبق بيتري.
   2. مزيج 30 غرام من قاعدة الاستومر السيليكون إلى عامل المعالجة بنسبة 10:1. رفع الغطاء عن طبق بيتري وصب polydimethylsiloxane (PDMS) على رقاقة، ثم ديغا داخل مجفف.
   3. مرة واحدة كل فقاعات ذهب، ضع رقاقة في 80 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة لعلاج PDMS.
   4. قم بتقشير PDMS بعناية، ولكم المداخل ومنافذ منافذ الأنسجة والقنوات الإعلامية مع لكمة خزعة 1 مم و 1.5 ملم، على التوالي.
   5. تنظيف قنوات PDMS مع الشريط لإزالة الغبار. بعد ذلك، نقع الأغطية (18 × 18 ملم، No.1) في الإيثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل. ثم، وتجفيف هذه قبالة مع مناديل الأنسجة.
   6. موضوع كل من coverlips وقنوات PDMS (الجانب ميزة يتعرض) إلى البلازما (الإعداد على ارتفاع) لمدة 1 دقيقة، ثم السندات بسرعة معا ووضعها في فرن 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتأمين السندات.
      ملاحظة: أثناء الترابط، من الضروري ممارسة ضغط خفيف على حواف قنوات PDMS لضمان وجود ختم جيد بين PDMS والزجاج مع تجنب القناة نفسها لمنع انهيار القناة.
3. إعداد الجهاز
   1. غمر أجهزة PDMS المستعبدين في الماء deionized (DI H₂O) وautoclave مع دورة السائل. بعد ذلك، يستنشق السائل من الأجهزة وautclave مرة أخرى مع دورة الجاذبية. ثم، يجفف الأجهزة المعقمة بين عشية وضحاها في 80 درجة مئوية.

2. زراعة الخلايا الجذعية (المدة التقريبية: 1-2 أشهر)

1. hiPSC الثقافة والصيانة
   ملاحظة: يجب أن تكون hiPSCs مثقفة لثلاثة مقاطع متتالية بعد ذوبان الجليد في المختبر قبل حفظ التبريد أو التمايز. هي مثقف hiPSCs في المتوسط إما E8 أو mTeSR1، اعتمادا على خط الخلية، على الغشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة لوحات²⁴.
   1. لمعطف لوحات مع hESC الجودة مصفوفة غشاء الطابق السفلي، إذابة واحد aliquot من المتوسط مصفوفة (حجم تعتمد على الكثير، عموما 200-300 ميكرولتر؛ المخزنة في -80 درجة مئوية) عن طريق إضافته إلى 25 مل من DMEM/F-12K على الجليد. الاستغناء عن 1 مل من هذا التعليق في كل بئر من لوحة 6-جيدا. اترك الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
   2. عند ذوبان الجليد، قم بتعديل وسائط E8 لثقافة hiPSC بإضافة 5 ميكرومتر من Y-27632²⁵ (E8+RI). استخدام هذه الوسائط لمدة 24 ساعة بعد ذلك، ثم تغيير وسائل الإعلام إلى E8 الطازجة.
      ملاحظة: بالنسبة للتغييرات الروتينية في الوسائط، يتم استخدام وسائط E8 غير المعدلة لثقافة hiPSC. للصيانة المنتظمة، يجب تغيير وسائط E8 كل يوم، أي بعد 24 ساعة تقريبا من تغيير الوسائط السابقة.
   3. خلايا المرور في اليوم 3 أو اليوم 4، وسائط يستنشق، ثم يغسل كل بئر مع 1 مل من محلول الفوسفات المخزنة بالفوسفات 1x Dulbecco (DPBS).
      ملاحظة: تأكد من أن الخلايا حول التقاء 70٪. لا تدع لهم تنمو أكثر من 70٪ التقاء.
   4. يستنشق DPBS، ثم إضافة 1 مل من 0.5 mM EDTA إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 6-7 دقائق.
   5. يستنشق بعناية EDTA، إضافة 1 مل من E8 + RI في كل بئر والانفجار ضد السطح مع ماصة 1 مل (~ 5-10 مرات لجمع كل من الخلايا). جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
   6. عد تعليق الخلية والمرور في كثافة الخلية المطلوبة (أي ~ 200 K لكل بئر) في E8 + RI.
   7. تغيير الوسائط إلى E8 (بدون RI) 24 ساعة بعد. لا تترك الخلايا مع RI لأكثر من 24 ساعة.
      ملاحظة: لا ينبغي تسخين E8 إلى 37 درجة مئوية. اتركه دائما في درجة حرارة الغرفة للاحترار قبل ثقافة الخلية.
2. خلية القلب (CM) موجهة التمايز
   ملاحظة: من المهم ملاحظة وجود التغايرية بين أسطر مختلفة من hiPSCs^26,27, لذلك قد تحتاج إلى تحسين الخطوات التالية لكل خط الخلية. اتبع الخطوات التالية لتمايز CM.
   1. إعداد RPMI + B27 - الأنسولين بإضافة 10 مل من B27 ناقص الأنسولين و 5 مل من البنسلين / العقدية (القلم / العقدية) إلى 500 مل من RPMI 1640.
   2. إعداد RPMI + B27 + الأنسولين بإضافة 10 مل من B27 و 5 مل من القلم / العقدية إلى 500 مل من RPMI 1640.
   3. إعداد RPMI ناقص الجلوكوز + B27 + الأنسولين بإضافة 10 مل من B27، 5 مل من القلم / العقدية، و 4 مل من لاكتات الصوديوم إلى 500 مل من RPMI 1640 بدون جلوكوز.
   4. بمجرد أن تصل المركبات المتجانسة إلى 85٪ التقاء، بدء التفريق (اليوم 0) عن طريق استبدال الوسط القديم مع 4 مل من RPMI + B27 - وسيط الأنسولين الذي يحتوي على 10 ميكرومتر CHIR99021 إلى كل بئر من لوحة 6 آبار (أي إضافة 25 ميكرولتر من 10 MM CHIR99021 إلى 25 مل من RPMI + B27 - الأنسولين ثم إضافة 4 مل لكل بئر على الفور).
      ملاحظة: CHIR99021 هو مثبط GSK ويؤدي إلى تنشيط WNT. تركيز الأمثل CHIR99021 والتقاء الأولي يختلف لكل خط الخلية²⁸. تحقق دائما من تدرج تركيز 6-12 ميكرومتر CHIR99021 وسلسلة من كثافات البذر قبل التجربة الفعلية لتحديد الظروف المثلى لبدء التمايز.
   5. بالضبط 24 ساعة في وقت لاحق (اليوم 1)، يستنشق المتوسط واستبدالها مع 5 مل من RPMI prewarmed + B27 - الأنسولين إلى كل بئر.
   6. بالضبط 72 ساعة بعد إضافة CHIR99021 (اليوم 3)، وجمع 2.5 مل من المتوسطة المستهلكة من كل بئر من لوحة 6-جيدا، ويبلغ مجموعها 15 مل من المتوسطة المستهلكة في أنبوب.
   7. لهذا، إضافة 15 مل من RPMI الطازجة + B27 - الأنسولين المتوسطة. أضف IWP2 إلى تركيز 5 ميكرومتر إلى الأنبوب المتوسط المدمج (أي 1 ميكرولتر من IWP2 بمعدل 5 م م لكل 1 مل من المتوسط المجمع أو 30 ميكرولتر من IWP2 إلى 30 وسيطا إجماليا مل).
   8. إزالة ~ 1.5 مل من المتوسط المتبقي لكل بئر من لوحة بحيث يبقى 1 مل من المتوسط. قم بتدافي اللوحة بقوة لضمان إزالة كافية لحطام الخلية. ثم يستنشق بقية الوسط القديم وإضافة 5 مل من المتوسطة المدمجة التي تحتوي على IWP2 لكل بئر من اللوحة.
      ملاحظة: إضافة IWP2 إلى الخلايا يؤدي إلى تثبيط Wnt.
   9. في اليوم 5، يستنشق المتوسط من كل بئر واستبداله مع 5 مل من RPMI prewarmed + B27 - الأنسولين.
   10. CM النضج: في اليوم 7، اليوم 9، واليوم 11، يستنشق المتوسط من كل بئر واستبداله مع 5 مل من RPMI prewarmed + B27 + الأنسولين. وينبغي ملاحظة الضرب التلقائي في هذه الأيام.
   11. CM تنقية: في اليوم 13 واليوم 16، بدء المجاعة الجلوكوز عن طريق استنشق المتوسطة من كل بئر، وغسل كل بئر مع 1 مل من 1x DPBS، ومن ثم إضافة 5 مل من RPMI prewarmed ناقص الجلوكوز + B27 + الأنسولين، تكملها مع 4 مل من لاكتات الصوديوم.
   12. في اليوم 19، يستنشق المتوسطة المستهلكة واستبدالها مع 5 مل من RPMI prewarmed + B27 + الأنسولين إلى كل بئر للسماح لاستعادة الخلية بعد تنقية.
   13. في اليوم 21، إعادة طلاء الخلايا، بعد ما يلي وصف بروتوكول فصافر CM (الخطوة 3.3). تهدف إلى لوحة 1.5-2 × 10⁶ خلايا لكل بئر في لوحة 6-جيدا. على سبيل المثال، إذا كان التمايز عالي الكفاءة، فإن توسيع الآبار ال 6 بشكل عام إلى 9 آبار أمر جيد.
   14. من يوم 21 فصاعدا، يستنشق المتوسط من كل بئر واستبداله مع 4 مل من RPMI + B27 + الأنسولين كل 2-3 أيام.
       ملاحظة: HIPSC-CMs جاهزة للاستخدام التجريبي بعد اليوم 23.

3. إنشاء أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد داخل الجهاز microfluidic: (المدة التقريبية: 2-3 ساعة)

1. ثقافة hCF
   1. ثقافة الخلايا الليفية القلبية البطينية البشرية (hCFs؛ التي تم الحصول عليها تجاريا من لونزوا) في قوارير T75 (بمعدل 250 ألف خلية لكل قارورة) في الخلايا الليفية نمو الوسائط-3 (ختان الإناث3). تغيير وسائل الإعلام كل يومين، والمرور عندما في التقاء 70٪. استخدام hCFs قبل مرور 10، لأنها قد تبدأ في التفريق إلى الخلايا العضلية في الممرات العالية²⁹.
2. hCF التفكك
   1. وننأى بحمى الهيدروكلوريك، أخرج القارورة أولا من الحاضنة. ضع القارورة داخل خزانة السلامة الحيوية وابدأ في قرصنة الوسائط المستهلكة من القارورة. ثم اغسل قارورة T75 ب 3 مل من 1x DPBS. أغلق الغطاء ودوامة القارورة.
   2. يستنشق DPBS. خذ 3 مل من 1x تريبسين-EDTA (0.05٪) وإضافته إلى القارورة. إمالة القارورة ودوامة لمعطف القاع. اتركه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4-6 دقائق ، والتحقق من القارورة تحت المجهر لضمان انفصال الخلايا ، كما يتضح من خلال شكل الخلية المستديرة والخلايا العائمة. إذا لم يكن كذلك، ثم وضع قارورة مرة أخرى في الحاضنة لمدة دقيقة أخرى.
   3. تحييد عمل التريبسين بإضافة 3 مل من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية قبل الحرب3 إلى القارورة. ثم، ماصة الحل صعودا وهبوطا ضد الجزء السفلي من القارورة لطرد CFs.
   4. جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية والاستغناء عنها في مقياس الدم لحساب الخلايا بالمجهر.
   5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 200 × ز لمدة 4 دقائق. يستنشق supernatant الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
   6. Resuspend بيليه في تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية الطازجة3، لجعل المطلوب 75 × 10⁶ خلايا / مل. إما مرور جزء (250K الخلايا لكل قارورة T75) أو اتبع البروتوكول أدناه لتوليد أنسجة القلب 3D.
3. فصافر CM
   ملاحظة: بعد التمايز والتنقية، قم بإعداد CMs للاستخدام في الحقن في أجهزة microfluidic.
   1. أخرج لوحة CMs من الحاضنة وخص وسائل الإعلام. ثم غسل الآبار مع 1 مل من 1x DPBS لكل بئر من لوحة 6-جيدا. خذ 6 مل من DPBS وماصة 1 مل لكل بئر.
   2. يستنشق DPBS الحرص على عدم تعكير صفو الخلايا المرفقة لوحة. ماصة 6 مل من محلول مفرزة الخلايا الدافئة (على سبيل المثال، TrypLE Express) وإضافة 1 مل لكل بئر. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   3. تحييد الانزيم مع حجم متساو من RPMI + B27 + الأنسولين (أي 1 مل لكل بئر) وتفكيك الخلايا ميكانيكيا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ضد وعاء الثقافة مع ماصة 1 مل.
   4. جمع CMs في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 3 دقائق.
   5. يستنشق العملاق. إعادة إنفاق بيليه الخلية في 5 مل من RPMI + B27 + الأنسولين. Pipette الحل صعودا وهبوطا مع ماصة 1 مل لضمان خلط السليم. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية والاستغناء عنها في مقياس الدم لتحديد العدد الإجمالي للخلية.
   6. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 300 × ز لمدة 3 دقائق (لضمان إزالة كاملة من TrypLE)، وتنشق supernatant. ثم، إضافة حجم مناسب من RPMI + B27 + الأنسولين لتحقيق 75 × 10⁶ خلايا / مل.
      ملاحظة: إذا لم ينتج عن التمايز/الاختيار القلبي ارتفاع CM٪ (أي >80٪)، كما يتضح من خلال التخزين المناعي أو قياس التدفق الخلوي للبروتينات الخاصة ب CM مثل cTnT، فلا تعتبر الخلايا مناسبة لتكوين الأنسجة. وينبغي تحسين عملية التمايز عندما يحدث ذلك عن طريق تعديل تركيزات CHIR99021 وكثافة البدء الأولية. إذا كان تنقية CM يحتاج إلى تحسين ، يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل فرز CMs إما مع فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) أو فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS)^30و31و32.
4. إعداد الكولاجين
   ملاحظة: إعداد الكولاجين من تركيز عال من مخزون الكولاجين (تتراوح بين 8-11 ملغ / مل). الكولاجين المستخدمة لإنشاء الخلية: خليط هيدروجيل هو في 6 ملغ / مل، والتركيز النهائي هو 2 ملغم / مل. اعتمادا على عدد الأجهزة التي يجب حقنها ، يجب حساب حجم محلول الكولاجين الذي يجب إجراؤه مرة أخرى.
   1. احتفظ بجميع الكواشف المطلوبة على الجليد داخل غطاء السلامة البيولوجية.
      ملاحظة: الكولاجين هو هيدروجيل للحرارة. لذلك ، يجب أن تظل درجة الحرارة منخفضة لمنع البلمرة المبكرة.
   2. تناول 75 ميكرولتر من الكولاجين (8 ملغم/مل) ووزعه في أنبوب طرد دقيق على الجليد. محلول الكولاجين لزج للغاية ، لذا يستنشقه ببطء مع ماصة.
   3. خذ 13.85 ميكرولتر من الوسائط (أي RPMI + B27 + الأنسولين) والاستغناء عنها في نفس الأنبوب.
   4. ثم تأخذ 10 ميكرولتر من الفينول الأحمر وإضافة إلى الخليط وإعادة الإنفاق.
   5. وأخيرا، تأخذ 1.15 ميكرولتر من 1N NaOH وإضافة إلى تعليق.
   6. باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر، إعادة تعليق التعليق.
      ملاحظة: الكولاجين الأسهم لديه حموضة حمضية، مما يستلزم إضافة NaOH لتحييد قبل استخدامه لتغليف خلايا القلب. فينول الأحمر بمثابة مؤشر درجة الحموضة; لذلك، أضف هذا قبل إضافة NaOH. عند هذه النقطة، فإن محلول الكولاجين يكون أصفر، مما يدل على حموضة له. بعد إضافة NaOH ، يجب أن يتحول الحل البرتقالي إلى اللون الوردي الفاتح ، مما يشير إلى تحييده.
5. خليط هيدروجيل وإعداد الخلية
   ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم تغليف الخلايا داخل هيدروجيل الكولاجين القائم. وينبغي وضع الخلايا، وكذلك جميع السلائف الهيدروجيل، على الجليد خلال الخطوات التالية.
   1. عند هذه النقطة، إذا لم يتم بعد محاولة CFs، تخزين تعليق CM في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، مع غطاء فك للسماح بتدفق الغاز، داخل حاضنة 37 درجة مئوية. بالتوازي، فصل CFs وجمع في كثافة 75 × 10⁶ خلايا / مل لتحميل الجهاز.
   2. امزج CMs المعلقة مع CFs بنسبة 4:1. خذ a aliquot من 8 ميكرولتر من CMs وإضافتها إلى أنبوب الطرد المركزي الطازجة على الجليد. ثم تأخذ 2 ميكرولتر من CFs وإضافة إلى تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي.
   3. إعادة تعليق الخلية، والاستيلاء على 5.6 ميكرولتر من تعليق الخلية، ووضعها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الطازجة.
   4. خذ 4 ميكرولتر من الكولاجين المعد للتو في الخطوات المذكورة أعلاه وأضف إلى خليط 4:1 CM:CF. إضافة 2.4 ميكرولتر من عامل النمو انخفاض (GFR) مصفوفة غشاء الطابق السفلي، مما يجعل كثافة الخلية النهائية كما 35 × 10⁶ خلايا / مل لحقن الجهاز. ماصة الخليط صعودا وهبوطا لضمان أن تعليق الخلية متجانسة.
6. إدراج الجهاز
   ملاحظة: بمجرد إعداد خليط الخلية:هيدروجيل، فإنه يحتاج إلى إدراجها في الأجهزة.
   1. أخرج أجهزة microfluidic المعقمة تلقائيا من الفرن الذي 80 درجة مئوية وقم بتعيينها في خزانة السلامة الحيوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إدخال تعليق الخلية للسماح للأجهزة بالتبريد لدرجة حرارة الغرفة مع الحفاظ على العقم.
   2. ضع الأجهزة في أطباق بيتري مقاس 60 × 15 مم ، بمعدل 3-4 أجهزة لكل طبق. املأ طبق بيتري مقاس 150 × 15 مم بطبقة رقيقة من طبق DI H₂O ليحمل 3 من أطباق بيتري مقاس 60 × 15 مم. هذه الخطوة يخلق بيئة رطبة المحيطة الأجهزة microfluidic.
   3. استخدام طرف جديد وإعادة إنفاق الخلية: خليط هيدروجيل جيدا عن طريق pipetting تعليق في حين أن الأنبوب لا يزال على الجليد.
   4. أدخل الطرف في منفذ الحقن للجهاز وحقن ببطء وثبات 3 ميكرولتر من تعليق الخلية: هيدروجيل في مدخل منطقة الأنسجة لجهاز ميكروفلويديك باستخدام طرف ماصة 20 ميكرولتر. بمجرد ملء المنفذ، أوقف الحقن وأزل الطرف. كرر لجميع الأجهزة، أو كامل تعليق هيدروجيل المعدة.
      ملاحظة: حجم صغير من الخلية: تعليق هيدروجيل يسخن / يبرد بسرعة كبيرة، لذلك فمن المناسب للحفاظ على تعليق على الجليد لأطول فترة ممكنة. عند إدراج، ماصة الحل قبالة الجليد وإدراجها في الأجهزة في أسرع وقت ممكن، كما هيدروجيل قد تبدأ في البلمرة في طرف ماصة. من المهم إنشاء كميات صغيرة من تعليق الخلية: هيدروجيل في وقت واحد، لذلك إذا كان العديد من الأجهزة التي سيتم حقنها، فإن تعليق الخلية:هيدروجيل يجب أن تكون طازجة لكل مجموعة من 4 أجهزة.
   5. الوجه الأجهزة داخل أطباق بيتري مع ملاقط ووضعها داخل طبق بيتري كبيرة مع الماء. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 9 دقائق ل البلمرة الهيدروجيل.
   6. أخرج الأجهزة من الحاضنة، وقلب الأجهزة بشكل مستقيم، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 9 دقائق لإكمال بلمرة الهيدروجيل.
   7. حقن RPMI + B27 + الأنسولين في قنوات الوسائط المحيطة (~ 20 ميكرولتر لكل جهاز). ضع الأجهزة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. تغيير وسائل الإعلام داخل القنوات الإعلامية مع RPMI الطازجة + B27 + الأنسولين كل يوم. وقد ثبت أن الأجهزة التي يتم استزراعها من 14-21 يوما²⁰.
      ملاحظة: نظرا لصغر حجم الوسائط لكل رقاقة، لمنع تبخر الوسائط، من المهم الحفاظ على الأجهزة داخل طبق بيتري كبير مليء ب DI H₂O، والذي يعمل كغرفة مرطبة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم إخراج قطرات صغيرة من RPMI + B27 + الأنسولين الزائد على الجزء العلوي من مداخل القناة / منافذها أثناء التغييرات الروتينية في الوسائط.

4. تحليل الأنسجة

1. تصوير مباشر
   ملاحظة: يجب إجراء جميع التصوير الحي مع حاضنة مرحلة للحفاظ على 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
   1. ضع الأجهزة في حاضنة مرحلة يتم التحكم فيها بيئيا. سجل مقاطع فيديو 30 s من بقع متعددة داخل كل جهاز بمعدل الإطار الأقصى.
   2. لتقييم انقباض الأنسجة بعد استخراج إشارات الضرب، استخدم رمز MATLAB التكميلي المكتوب خصيصا لاستخراج القمم(الملف التكميلي 2)لحساب التباين الفاصل بين الضربات.
   3. تغيير الوسائط في الأجهزة في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، ثم وضع مرة أخرى في حاضنة ثقافة الخلية.
2. تلطيخ مناعة
   1. إعداد برنامج تلفزيوني-الجليسين: حل 100 mM الجليسين في برنامج تلفزيوني وإضافة 0.02٪ NaN₃ للتخزين على المدى الطويل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
   2. إعداد برنامج تلفزيوني توين -20: إضافة 0.05٪ توين-20 لبرنامج تلفزيوني وإضافة 0.02٪ NaN₃ للتخزين على المدى الطويل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
   3. إعداد IF المخزن المؤقت: إضافة 0.2٪ تريتون X-100, 0.1٪ BSA, و 0.05٪ توين-20 إلى PBS, وإضافة 0.02٪ NaN₃ للتخزين طويل الأجل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
   4. إعداد مصل الماعز 10٪: Resuspend مصل الماعز الليوفيلي في 2 مل من برنامج تلفزيوني لجعل مصل الماعز 100٪. ثم، تمييع 2 مل مع 18 مل من برنامج تلفزيوني لجعل مصل الماعز 10٪.
   5. إصلاح العينات بإضافة 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) إلى قنوات الأنسجة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   6. غسل الخلايا عن طريق إضافة PBS-Glycine إلى قنوات الأنسجة 2x لمدة 10 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة.
   7. غسل الخلايا عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني -Tween-20 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   8. Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة IF العازلة إلى قنوات الأنسجة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   9. منع الخلايا عن طريق إضافة 10٪ حل مصل الماعز إلى قنوات الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   10. تمييع الأجسام المضادة الأولية غير المترافقة في مصل الماعز بنسبة 10٪ بتركيزات مرغوبة (راجع الملف التكميلي 3)،إضافة إلى قنوات الأنسجة، واحتضان العينات عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   11. في اليوم التالي، غسل العينات عن طريق إضافة PBS-Tween-20 إلى قنوات الأنسجة 3x لمدة 20 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
       ملاحظة: من الخطوة 4.2.12 على تنفيذ كافة المهام في الظلام، بحيث يتم حماية العينات من الضوء.
   12. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في PBS-Tween-20 بتركيزات مرغوبة، والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة لجمع أي رواسب، ثم إضافة إلى قنوات الأنسجة.
   13. بعد 30 دقيقة-1 ساعة، وغسل العينات مع برنامج تلفزيوني توين-20 3x لمدة 10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
   14. إضافة المضادة للتلاشي أو المتوسطة المتصاعدة المطلوبة إلى قنوات الأنسجة. ثم، يمكن تصوير العينات باستخدام المجهر الفلوري أو مع المجهر confocal، إذا كان التكبير أعلى هو المطلوب. لتصور كامل الأنسجة 3D، يمكن أن تكون مكدسة الصور في مختلف الطائرات ض وإعادة بنائها لتشكيل صور 3D تمثيلية.

Results

للحصول على مجموعة عالية من أجهزة CMs من hiPSCs ، يتم استخدام نسخة معدلة تتضمن مزيجا من بروتوكول تمايز ليان³³ وخطوات تنقية Tohyama³⁴ (راجع الشكل 1A للجدول الزمني التجريبي). وhiPSCs تحتاج إلى أن تكون مستعمرة مثل، ~ 85٪ التقاء، وانتشرت بالتساوي في جميع أنحاء الثقافة جيدا 3-4 أيام بعد مرور، في بداية التمايز CM (الشكل 1B). على وجه التحديد ، في اليوم 0 ، يجب أن يكون لدى مستعمرات hiPSC تعبير عال عن عوامل النسخ متعددة القر...

Discussion

تشكيل نموذج الأنسجة القلبية البشرية في المختبر مع تعزيز التفاعلات الخلية الخلية وهيكل 3D المحاكاة الحيوية أمر حتمي للبحوث الأساسية القلب والأوعية الدموية والتطبيقات السريرية^{المقابلة 1}. يشرح هذا البروتوكول الموجز تطوير أنسجة القلب غير المثيلية البشرية ثلاثية الأبعاد داخل جهاز ميكروفلويديك ، باستخدام الثقافة المشتركة لل CMs المشتقة من الخلايا الجذعية مع CFs الضام المغلف داخل هيدروجيل الكولاجين ، مما يخدم لنمذجة تكوين الخلايا المعقدة وهيكل عضلة القلب الأصلية. هذا البروتوكول المحدد قابل للاست...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.65 مل أنابيب الطرد المركزي	VWR	87003-290
1 مم خزعة لكمة	VWR	95039-090
1.5 مم خزعة لكمة	VWR	95039-088
15 مل أنابيب الصقر	VWR	89039-670
18x18mm أغطية	VWR	16004-308	يجب أن تكون الغطية رقم 1 ، للسماح بتصوير
التكبير العالي4٪ بارافورمالدهايد	ThermoFisher	101176-014
6 آبار مسطحة بوتوم لوحات زراعة الأنسجة VWR		82050-844
B27 ناقص الأنسولين	LifeTech	A1895602
B27 بالإضافة إلى الأنسولين	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
الكولاجين الأول ، ذيل الفئران	Corning	47747-218
A1517001 DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher		في المنزل
EDTA	VWR	45001-122
الإيثانول
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
جلايسين	سيجما	G8898-500G
مصل الماعز	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3< / sub>	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
القلم / البكتيريا العقدية	VWR	15140122
طبق بتري (150x15mm)	VWR	25384-326
طبق بتري (60x15mm)	VWR	25384-092
فينول ريد	سيجما	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 ناقص الجلوكوز	VWR	45001-110
رقائق السيليكون (100 مم)	رقاقة الجامعة	1196
لاكتات الصوديوم	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 مطور		NC9901158
Sylgard Elastomer	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Trypsin-EDTA (0.5٪)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	تقنيات الخلايا الجذعية	72304
EVG620 Aligner	EVG
منظف البلازما PDC-32G	هاريك بلازما
زايس AxioObserver Z1 مجهر	نيكون
لايكا SP8 مجهر متحد البؤر	لايكا