يصف هذا البروتوكول إعداد ثقافات شرائح النمط العضوي (OTSCs). تسهل هذه التقنية الزراعة خارج الجسم الحي للأنسجة متعددة الخلايا السليمة. يمكن استخدام OTSCs على الفور لاختبار استجابة كل منها للأدوية في بيئة متعددة الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مزارع الشرائح العضوية كنماذج قبل السريرية للبيئة المكروية للورم في سرطان البنكرياس الأولي وورم خبيث
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هناك حاجة ماسة إلى نماذج واقعية قبل السريرية لسرطان البنكرياس الأولي وورم خبيث لاختبار استجابة العلاج خارج الجسم الحي وتسهيل العلاج الشخصي للمريض. ومع ذلك ، فإن عدم وجود بيئة دقيقة خاصة بالورم في النماذج المستخدمة حاليا ، على سبيل المثال ، خطوط الخلايا المشتقة من المريض والطعوم الخارجية ، يسمح فقط برؤى تنبؤية محدودة. تشتمل مزارع الشرائح العضوية (OTSCs) على أنسجة سليمة متعددة الخلايا ، والتي يمكن استخدامها بسرعة لاختبار الاستجابة للأدوية التي يتم حلها مكانيا.
يصف هذا البروتوكول توليد وزراعة شرائح الورم القابلة للحياة من سرطان البنكرياس ونقائله. باختصار ، يتم صب الأنسجة في أغاروز منخفض الذوبان وتخزينها في محلول متساوي التوتر بارد. بعد ذلك ، يتم إنشاء شرائح الأنسجة بسمك 300 ميكرومتر باستخدام اهتزاز. بعد التحضير ، يتم استزراع الشرائح في واجهة الهواء السائل باستخدام إدخالات زراعة الخلايا ووسط زراعة مناسب. أثناء الزراعة ، يمكن مراقبة التغيرات في تمايز الخلايا وصلاحيتها. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح هذه التقنية تطبيق العلاج على أنسجة الورم البشري القابلة للحياة خارج الجسم الحي والتحليلات اللاحقة ، مثل التنميط بالنسخ والبروتين.
توفر OTSCs فرصة فريدة لاختبار استجابة العلاج الفردية خارج الجسم الحي وتحديد الملامح النسخية والبروتينية الفردية المرتبطة بالاستجابة المعنية لشرائح مميزة من الورم. يمكن استكشاف OTSCs بشكل أكبر لتحديد الاستراتيجيات العلاجية لتخصيص علاج سرطان البنكرياس الأولي وورم خبيث.
المقدمة
النماذج قبل السريرية الحالية للسرطان الغدي القنوي البنكرياسي (PDAC) والنقائل ذات الصلة هي تنبؤات ضعيفة للاستجابة للعلاج في المرضى وهو عيب كبير في تطوير الأدوية وتحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية1. على الرغم من أن نماذج مثل الكائنات العضوية المشتقة من المريض والطعوم الخارجية المشتقة من المريض واعدة ، إلا أن استخدامها لا يزال محدودا2. القيود الرئيسية لهذه النماذج في المختبر هي عدم وجود البيئة المكروية للورم والتطعيم الأجنبي في الأنواع غير البشرية التي تعاني من نقص المناعة. خاصة في PDAC ونقائله ، اكتسبت البيئة المكروية للورم اهتماما كبيرا على مدى السنوات الماضية بسبب وظائفها الحاسمة في بيولوجيا الورم. وهو يتألف من مك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم جمع عينات الأنسجة ومعالجتها بعد موافقة لجنة الأخلاقيات المحلية بجامعة لوبيك (# 16-281).
1. جمع الأنسجة الطازجة والتعامل معها
ملاحظة: يجب التعامل مع كل عينة أنسجة بشرية غير ثابتة بحذر لمنع خطر العدوى من مسببات الأمراض المنقولة بالدم. يجب اختبار جميع المرضى ليكونوا سلبيين لفيروس نقص المناعة البشرية وفيروس التهاب الكبد B و HCV قبل معالجة الأنسجة. ارتداء معطف واقية والتعامل مع عينات الأنسجة البشرية بالقفازات.
- اجمع عينة أنسجة PDAC الطازجة وغير الثابتة وغير المجمدة بحجم لا يقل عن 0.4 × 0.4 سم مباشرة بعد الجراحة وانقل العينة إلى المختبر في محلول تخزين الأنسجة.
- عندما يكون ذلك ممكنا ، قم بمعالجة الأ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يقدم الشكل 1 نظرة عامة على سير العمل لاستزراع OTSCs من أنسجة الورم الطازجة غير المجمدة. تم جمع عينات من PDACs الأولية والانبثاث مباشرة بعد الاستئصال الجراحي وتخزينها طوال الليل على الثلج الرطب عند 4 درجات مئوية في محلول تخزين الأنسجة. تمت معالجة العينات ، وتم استزراع الشرائح كما هو موضح في البروتوكول. لم يتغير التشكل العياني لكل OTSC بشكل كبير أثناء الزراعة. ومع ذلك ، انخفض حجم مساحة سطح OTSCs بمرور الوقت كما هو موضح في الشكل 2A أثناء الزراعة لمدة 6 أيام. تم تقي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
OTSCs لعينات الورم الطازجة هي تقريب قريب للورم في الموقع. يحافظون على مورفولوجيتهم الأساسية ونشاطهم التكاثري وبيئتهم المكروية أثناء الزراعة لفترة محددة تعتمد على الأنسجة11،12،13. تتيح هذه التقنية التطبيق الفوري للعلاج على أنسجة الورم البشري القابلة للحياة خارج الجسم الحي والتحليلات اللاحقة ، مثل تنميط النسخ والبروتين. من المزايا المحددة ل OTSCs أنه يمكن تطبيق التحليلات النهائية التي تم حلها مكانيا مثل تصوير MAL.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولم يكشف المؤلفان عن أي تضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم R. Braun من قبل مدرسة العلماء السريريين لوبيك (DFG # 413535489) وبرنامج تمويل المبتدئين بجامعة لوبيك.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| متقدم DMEM / F-12 متوسط | جيبكو | 12634028 | |
| أغاروز منخفض الذوبان | روث | 6351.2 | 8٪ في محلول رنجر |
| مخفف الأجسام المضادة ، تقليل الخلفية | Dako | S3022 | |
| AquaTex | Merck | 108562 | |
| الإيثانول الحيوي (99٪ ، مشوه) | CHEMSolute | 2،21،19،010 | |
| حامض الستريك مونوهيدرات | سيجما ألدريتش | C7129 | |
| المشقوق كاسباز -3 (Asp175) (5A1E) | إشارات خلية | mAb 9664 | 1:400 تخفيف |
| ديربي شفرات حلاقة آمنة مزدوجة الحواف | إضافية ديربي توكاي | ||
| تضمين أشرطة | روث | H579.1 | |
| محلول Eosin Y 0.5٪ مائي | ميرك | 10،98،44،100 | |
| Eukitt تصلب سريع تصاعد متوسط | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | 10270106 | |
| محلول الفورمالديهايد 4,5٪ ، مخزن | B ü ؛ fa Chemikalien | B211101000 | |
| حمض محلول الشب Hem acc. إلى ماير | روث | T865 | |
| الإنسان EGF | Milteniy Biotec | 130-097-794 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich (Merck) | H0888 | |
| بيروكسيد الهيدروجين 30٪ | Merck | 1،08،59،71،000 | |
| الأنسولين البشري | سيجما ألدريتش (ميرك) | 12643 | |
| سائل DAB + نظام الركيزة كروموجين | Dako | K3468 | |
| MACS حل تخزين الأنسجة | Milteniy Biotech | 130-100-008 | |
| ميثانول | ميرك | 10.600.092.500 | |
| المجهر Superfrost Plus | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Millicell Cell Cell Culture Insert ، 30 مم ، PTFE محب للماء ، 0.4 & micro ؛ م | ميليبور (ميرك) | PICM0RG50 | |
| فأر أحادي النسيلة مضاد للإنسان السيتوكيراتين 7 (استنساخ OV-TL 12/30) | Dako | M7018 | 1:200 تخفيف |
| فأر أحادي النسيلة مضاد للإنسان Ki67 استنساخ MIB-1 | Dako | M7240 | 1:200 تخفيف |
| الماوس أحادي النسيلة مضاد للفيمنتين (استنساخ V9) | Dako | M0725 | 1:200 التخفيف |
| التحكم السلبي الماوس IgG2a | Dako | X0943 | 1:200 التخفيف |
| التحكم السلبي Mouse IgG1 | Dako | X093101-2 | 1: 200 تخفيف |
| البارافين (درجة حرارة الانصهار 56 درجة ؛ - 58 درجة ؛) | ميرك | 10،73،37،100 | |
| بنسلين ستربتومايسين (10.000 وحدة / مل) | جيبكو | 15140122 | |
| PBS درجة الحموضة 7،4 (1x) قياس التدفق الخلوي الصف | جيبكو | A12860301 | |
| ملح الصوديوم ريزازورين. 10 مجم / مل في PBS | Sigma Aldrich | R7017 | 1: 250 تخفيف |
| محلول Ringer | فريسينيوس كابي | 2610813 | |
| RPMI-1640 متوسط | سيجما ألدريتش (ميرك) | R8758 | |
| لوحة اختبار زراعة الأنسجة 6 | TPP | 92006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
| VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit | مختبرات ناقلات | PK-6200 | |
| الزيلين (نقي للغاية) | JTBaker | 8،11،85،000 | |
| < قوي > المعدات < قوي> | |||
| قارئ كلاريوستار ميكروبليت | BMG Labtech | ||
| مركز تضمين البارافين E61110 | Leica | ||
| الروتاري ميكروتوم ميكروم HM355S | نظام | ||
| الحراري ميكروم STS | الحرارية العلمية | ||
| VT 1200S Vibratom | Leica |
المراجع
- Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).
- Tiriac, H., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
