مقالة منهجية

في المختبر مقايسة تنبت ثلاثية الأبعاد لتكوين الأوعية الدموية باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأر لنمذجة أمراض الأوعية الدموية واختبار الأدوية

DOI:

10.3791/62554

⸱

مايو 11, 2021

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا الفحص الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المتمايزة إلى أجسام جنينية مستزرعة في هلام الكولاجين 3D لتحليل العمليات البيولوجية التي تتحكم في تكوين الأوعية الدموية في المختبر. يمكن تطبيق هذه التقنية لاختبار الأدوية ، ونمذجة الأمراض ، ودراسة جينات معينة في سياق عمليات الحذف القاتلة من الناحية الجنينية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمكن التطورات الحديثة في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) وتقنيات تحرير الجينات من تطوير نماذج جديدة للأمراض القائمة على الخلايا البشرية لبرامج اكتشاف الأدوية المظهرية (PDD). على الرغم من أن هذه الأجهزة الجديدة يمكن أن تتنبأ بسلامة وفعالية الأدوية التجريبية في البشر بشكل أكثر دقة ، إلا أن تطويرها إلى العيادة لا يزال يعتمد بشدة على بيانات الثدييات ، ولا سيما استخدام نماذج أمراض الفئران. بالتوازي مع نماذج الأمراض العضوية البشرية أو الأعضاء على الرقاقة ، فإن تطوير نماذج الفئران ذات الصلة في المختبر هو بالتالي حاجة غير ملباة لتقييم فعالية الدواء المباشر ومقارنات السلامة بين الأنواع وفي الجسم الحي وفي الظروف المختبرية . هنا ، يتم وصف مقايسة تنبت الأوعية الدموية التي تستخدم الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المتمايزة إلى أجسام جنينية (EBs). EBs الوعائية المزروعة على هلام الكولاجين 3D تطوير الأوعية الدموية الجديدة التي تتوسع ، وهي عملية تسمى تنبت تولد الأوعية. يلخص هذا النموذج السمات الرئيسية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي - تكوين الأوعية الدموية من شبكة الأوعية الدموية الموجودة مسبقا - بما في ذلك اختيار خلايا الطرف البطاني ، وهجرة الخلايا البطانية وتكاثرها ، وتوجيه الخلايا ، وتكوين الأنبوب ، وتجنيد الخلايا الجدارية. إنه قابل لفحص الأدوية والجينات التي تعدل تكوين الأوعية ويظهر أوجه التشابه مع فحوصات الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد (3D) الموصوفة مؤخرا بناء على تقنيات iPSC البشرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقود الثلاثة الماضية ، تم استخدام اكتشاف الأدوية القائم على الهدف (TDD) على نطاق واسع في اكتشاف الأدوية من قبل صناعة الأدوية. يتضمن TDD هدفا جزيئيا محددا يلعب دورا مهما في المرض ويعتمد على تطوير أنظمة زراعة الخلايا البسيطة نسبيا والقراءات لفحص الأدوية1. تتضمن معظم نماذج الأمراض النموذجية المستخدمة في برامج TDD طرق زراعة الخلايا التقليدية مثل الخلايا السرطانية أو خطوط الخلايا الخالدة المزروعة داخل بيئات اصطناعية وركائز غير فسيولوجية. وعلى الرغم من أن العديد من هذه النماذج قد وفر أدوات ناجعة لتحديد الأدوية المرشحة الناجحة، فإن استخدام مثل هذه النظم يمكن أن يكون موضع شك بسبب ضعف أهميتها المرضية2.

بالنسبة لمعظم الأمراض ، تكون الآليات الأساسية معقدة بالفعل وغالبا ما توجد أنواع مختلفة من الخلايا ومسارات إشارات مستقلة ومجموعات متعددة من الجينات تساهم في النمط الظاهري لمرض معين. وينطبق هذا أيضا على الأمراض الوراثية حيث يكون السبب الرئيسي هو طفرة في جين واحد. مع ظهور تقنيات الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان وأدوات تحرير الجينات مؤخرا ، أصبح من الممكن الآن إنشاء عضويات ثلاثية الأبعاد ونماذج مرض عضو على رقاقة يمكن أن تلخص بشكل أفضل التعقيد البشري في الجسم الحي 3,4. يرتبط تطوير مثل هذه التقنيات بعودة الاهتمام ببرامج اكتشاف الأدوية ذات النمط الظاهري(PDD) 1. يمكن مقارنة PDD بالفحص التجريبي ، لأنها لا تعتمد على معرفة هوية هدف دواء معين أو فرضية حول دوره في المرض. ومن المسلم به الآن بشكل متزايد أن نهج PDD يساهم بقوة في اكتشاف الأدوية الأولى في فئتها5. نظرا لأن تطوير التقنيات العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة لا يزال في مهده ، فمن المتوقع أن توفر نماذج iPSC (المكملة بأدوات التصوير والتعلم الآليالمبتكرة 6,7) ، في المستقبل القريب ، نماذج جديدة متعددة للأمراض المعقدة القائمة على الخلايا لفحص الأدوية وبرامج PDD المرتبطة للتغلب على الإنتاجية الضعيفة لنهج TDD 8 ، 9.

في حين أن النماذج العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة يمكن أن توفر رؤى مهمة حول تعقيد المرض وتحديد الأدوية الجديدة ، فإن إدخال الأدوية في الممارسة السريرية الجديدة يعتمد أيضا بشدة على البيانات من النماذج الحيوانية لتقييم فعاليتها وسلامتها. من بينها ، الفئران المعدلة وراثيا هي بالتأكيد نماذج الثدييات الأكثر تفضيلا. لديهم العديد من المزايا لأن لديهم وقت جيل قصير نسبيا للثدييات ، ولديهم العديد من الأنماط الظاهرية المماثلة للأمراض البشرية ، ويمكن التلاعب بها وراثيا بسهولة. لذلك يتم استخدامها على نطاق واسع في برامج اكتشاف الأدوية10. ومع ذلك ، لا يزال سد الفجوة بين الفئران والبشر يمثل تحديا مهما11. إن تطوير نماذج الفئران في المختبر المكافئة للنماذج العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة يمكن أن يملأ هذه الفجوة جزئيا على الأقل لأنه سيسمح بإجراء مقارنات مباشرة بين فعالية الأدوية وسلامتها بين البيانات البشرية في الجسم الحي والبيانات البشرية في المختبر.

هنا ، يتم وصف مقايسة تنبت الأوعية الدموية في الأجسام الجنينية للفأر (EBs). تتكون الأوعية الدموية من الخلايا البطانية (البطانة الداخلية لجدران الأوعية) ، والخلايا الجدارية (خلايا العضلات الملساء الوعائية والخلايا المحيطة)12. يعتمد هذا البروتوكول على تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESCs) إلى EBs الوعائية باستخدام قطرات معلقة تلخص تمايز الخلايا البطانية الجديدة وتمايز الخلايا الجدارية13,14. يمكن إنشاء ESCs الفئران بسهولة في الثقافة من اليوم المعزول 3.5 الكيسات الأريمية للفأر ذات الخلفيات الجينيةالمختلفة 15. كما أنها توفر إمكانيات للتحليل النسيلي ، وتتبع النسب ، ويمكن التلاعب بها وراثيا بسهولة لإنشاء نماذج المرض13,16.

نظرا لأن الأوعية الدموية تغذي جميع الأعضاء ، فليس من المستغرب أن ترتبط العديد من الأمراض إن لم يكن كلها بالتغيرات في الأوعية الدموية الدقيقة. في الحالات المرضية ، يمكن أن تتبنى الخلايا البطانية حالة نشطة أو يمكن أن تصبح مختلة وظيفيا مما يؤدي إلى موت الخلايا الجدارية أو الهجرة بعيدا عن الأوعية الدموية. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تكوين الأوعية الدموية المفرط أو في خلخل الأوعية الدموية ، ويمكن أن يؤدي إلى تدفق دم غير طبيعي وحاجز الأوعية الدموية المعيب مما يؤدي إلى تسرب الخلايا المناعية ، والتهاب12،17،18،19. وبالتالي ، فإن الأبحاث الخاصة بتطوير الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية عالية ، وقد تم بالفعل تحديد العديد من اللاعبين والمفاهيم الجزيئية للاستهداف العلاجي. في هذا السياق ، فإن البروتوكول الموصوف مناسب بشكل خاص لبناء نماذج الأمراض واختبار الأدوية لأنه يلخص السمات الرئيسية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي ، بما في ذلك اختيار الطرف البطاني وخلايا الساق ، وهجرة الخلايا البطانية وانتشارها ، وتوجيه الخلايا البطانية ، وتشكيل الأنبوب ، وتجنيد الخلايا الجدارية. كما يظهر أوجه التشابه مع فحوصات الأوعية الدموية 3D الموصوفة مؤخرا بناء على تقنيات iPSC البشرية20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الإعداد الإعلامي وثقافة mESC

  1. تحضير وسط مكيف +/- (CM +/-) باستخدام الملحق 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) متوسط مع 10٪ (حجم / حجم) مصل جنيني بقري معطل بالحرارة (FBS) ، 0.05 مللي متر β-ميركابتوإيثانول ، 1x أحماض أمينية غير أساسية (NEAA 1x) ، 2 mM L-glutamine ، و 1 mM بيروفات الصوديوم.
  2. تحضير وسط مكيف +/+ (CM +/+) باستخدام المكمل CM +/- وسط مع عامل تثبيط سرطان الدم (LIF) (1500 وحدة / مل) و 0.1 مللي مول β-ميركابتوإيثانول.
  3. تحضير وسط مكيف +/+ في وجود مثبطين (CM +/+ 2i) باستخدام الملحق CM +/+ المتوسطة مع 1 ميكرومتر PD0325901 و 3 ميكرومتر CHIR99021.
  4. تحضير محلول الجيلاتين 0.1٪ عن طريق خلط 25 مل من محلول الجيلاتين المسخن مسبقا 2٪ في 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS).
  5. تحضير 10x التربسين فيرسين فوسفات (TVP 10x) العازلة عن طريق خلط التربسين (2.5٪) مع TVP 1x (9.5٪ 10x DPBS ، 1 mM EDTA ، 0.01٪ مصل دجاج ، 0.01٪ تربسين (2.5٪) في H2O) (نسبة 1:10 ، حجم / حجم).
    ملاحظة: قم بتصفية جميع المحاليل من خلال مرشح المسام 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين وسط الاستزراع عند -20 درجة مئوية على المدى الطويل واحتفظ بالكواشف الأخرى عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع (انظر جدول المواد).
  6. قم بتغطية صفيحتين من 12 بئرا بمحلول جيلاتين 0.1٪ (500 ميكرولتر لكل بئر) واحتضانهما لمدة 30 دقيقة في حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، جو رطب).
  7. اغسل الألواح المطلية بالجيلاتين باستخدام PBS وأضف 500 ميكرولتر من CM +/- متوسط.
  8. قم بإذابة قارورة من 1 × 106 من الخلايا الليفية الجنينية للفأر المشع المحفوظة بالتبريد (MEFs) عند 37 درجة مئوية وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي مع 5 مل من CM +/- وسط.
  9. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). نضح الوسط وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 12 مل من CM +/- وسط بتركيز 1.67 × 105 خلايا لكل مل.
  10. بذر 500 ميكرولتر من تعليق MEF في صفيحة استزراع خلية ذات 12 بئرا (2.4 × 105 خلايا لكل سم 2) واحتضان اللوحة طوال الليل (o / n) في حاضنة CO2.
  11. قم بإذابة قارورة واحدة من mESCs المحفوظة بالتبريد (1 × 106) في وسط CM +/+ 2i.
  12. قم بزرع معلق mESC على صفيحة بئر 12 مغسولة مسبقا مع MEFs في 1 مل من وسط CM +/+ 2i وانقل اللوحة إلى حاضنة CO2 . قم بتحديث الوسيط يوميا.
  13. عند التقاء 70٪ ، اغسل مستعمرات mESC باستخدام DPBS. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 10x TVP واحتضانه في RT لمدة 30 ثانية لبدء التفكك الأنزيمي.
  14. قم بإزالة المخزن المؤقت TVP بعناية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط CM +/+ 2i وافصل المستعمرات إلى خلايا مفردة عن طريق السحب اللطيف.
  15. قم بتمرير الخلايا عن طريق نقلها إلى لوحة زراعة خلايا جديدة ذات 12 بئرا مع MEFs (نسبة التقسيم: 1: 3-1: 5). تخلط بلطف لتوزيع الخلايا واحتضانها في حاضنة CO2 .
  16. قم بتحديث وسط الاستزراع (2-3 مل) ولاحظ نمو / مورفولوجيا الخلية يوميا. كرر التمرير التسلسلي عند التقاء 70٪ كل 2 أيام. قم بالتبديل إلى وسيط CM +/+ لمقطعين قبل بدء تمايز الخلايا.

2. تشكيل EB في قطرة معلقة

  1. تحضير وسط تمايز الأديم المتوسط الطازج عن طريق استكمال وسط CM +/- بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) (50 نانوغرام · مل -1) ومع البروتين المورفولوجي للعظام 4 (BMP-4) (5 نانوغرام · مل -1) والاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بتغطية بئر واحد من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار ب 500 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ وضعه في حاضنة CO2 لمدة 30 دقيقة.
  3. اغسل الألواح المطلية بالجيلاتين باستخدام PBS وأضف 500 ميكرولتر من CM +/- متوسط.
  4. للحصول على مجموعة نقية من mESCs ، قم بتثريبسين صفيحة زراعة الخلايا باستخدام مخزن مؤقت 10x TVP لمدة 30 ثانية في RT ، وأعد تعليق الخلايا في وسط تمايز الأديم المتوسط سعة 1 مل ثم انقلها إلى لوحة 6 آبار مغلفة بالجيلاتين لمدة 30 دقيقة مما يسمح ل MEFs بالالتصاق بينما تظل mESCs في حالة تعليق.
  5. اجمع معلق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم Neubauer وصبغة Trypan الزرقاء لاستبعاد الخلايا الحية / الميتة.
  6. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في RT. إزالة المادة الطافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في وسط تمايز الأديم المتوسط للوصول إلى 4.55 × 104 خلايا لكل مل.
  7. املأ قاع أطباق البوليسترين منخفضة المرفق 94 مم ب 15 مل من الماء المعقم.
    ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى أربعة أطباق تحتوي على قطرات معلقة (1.6 × 105 خلايا في 3.52 مل من الوسط) لاختبار حالة معينة باستخدام مقايسة تولد الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد.
  8. انقل تعليق الخلية إلى خزان بلاستيكي معقم وقم بتحميل أربعة مواضع من ماصة متعددة القنوات مع 22 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل قناة (1 × 103 خلايا لكل قطرة 22 ميكرولتر).
  9. ارفع واقلب غطاء الطبق مقاس 94 مم وضعه على السطح النظيف لخزانة التدفق بحيث يكون الجانب الداخلي متجها لأعلى.
  10. إيداع 40 قطرات من تعليق الخلية على السطح الداخلي لكل غطاء. اقلب الغطاء بعناية دون إزعاج وضعه مرة أخرى على الطبق ، بحيث تواجه القطرات الماء.
  11. احتضان الأطباق في حاضنة CO2 . اعتبر هذا يوم التمايز 0. الحفاظ على لوحات لمدة 4 أيام لتشكيل EBs.

3. مقايسة المنافسة لموضع خلية الطرف

  1. استزراع خط واحد من الفلورسنت وخط واحد غير فلوري mESC كما هو موضح سابقا13. على سبيل المثال ، يتم استخدام 7ACS / EYFP mESCs المسمى باللون الأصفر و R1 mESCs.
  2. قم بإعداد EBs الفسيفسائية عن طريق خلط كميات متساوية من خطي mESC (نسبة 1: 1) واحتضان أطباق القطرة المعلقة في حاضنة CO 2 كما هو موضح في الخطوة2 .

4. ثقافة EBs العائمة لتمايز الأوعية الدموية

  1. قبل جمع EBs من القطرات المعلقة ، قم بإعداد ما يلي.
    1. تحضير محلول أجار 5٪ في H2O وتعقيمه عن طريق التعقيم (20 دقيقة عند 120 درجة مئوية).
    2. استخدم محلول أجار 5٪ الدافئ لتحضير وسط G-MEM BHK-21 الذي يحتوي على 1٪ أجار وصب 3 مل بسرعة في أحد أطباق البوليسترين 60 مم. اترك الآجار يتجمد لمدة 1 ساعة في RT. قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بإعداد وسط تمايز وعائي جديد 2x عن طريق استكمال CM +/- الوسط مع bFGF (100 نانوغرام · مل -1) و VEGF-A (50 نانوغرام · مل -1). يخزن الوسط على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. اجمع القطرات المعلقة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة P1000 وقم بإزالة المادة الطافية بعد بضع دقائق من ترسيب EB.
  4. أعد تعليق EBs في 3 مل من وسط تمايز الأوعية الدموية 2x ، وانقل تعليق EB إلى طبق واحد مطلي بالآجار ووزع EBs بشكل متجانس لتجنب التجميع.
  5. احتضان الأطباق في حاضنة CO2 وتحديث الوسط كل يومين حتى اليوم 9 باستخدام وسط تمايز الأوعية الدموية 1x في وجود bFGF (50 ng · mL-1) و VEGF-A (25 ng · mL-1).
  6. بدلا من ذلك ، أضف عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية- BB (PDGF-BB) (10 نانوغرام · مل -1 في اليوم 4 و 5 نانوغرام · مل -1 في اليوم 6 واليوم 8) إلى وسط تمايز الأوعية الدموية لتعزيز تمايز الخلايا الجدارية.

5. تحليل التدفق الخلوي

  1. اجمع EBs البالغة من العمر 9 أيام في أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة P1000 واغسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ.
  2. أضف 1 مل من وسط G-MEM BHK-21 الذي يحتوي على 0.2 مجم · مل -1 من كولاجيناز أ واحتضان الخلايا في حاضنة CO2 لمدة 5 دقائق.
  3. افصل EBs عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000.
  4. أوقف نشاط الكولاجين بإضافة 1 مل من وسط G-MEM BHK-21 البارد مع 10٪ FBS.
  5. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في RT.
  6. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS مع 2٪ FBS.
  7. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم Neubauer.
  8. أعد تعليق 400000 خلية في 100 ميكرولتر من PBS مع 2٪ FBS لكل حالة تلطيخ.
  9. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية بالأجسام المضادة التالية: APC الأجسام المضادة للفأر المترافق PECAM-1 (استنساخ MEC13.3) والفئران المترافقة FITC المضادة للفأر CD45 (استنساخ 30-F11) أو الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل.
  10. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS.
  11. أعد تعليق الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي قدره 5 × 106 خلايا لكل مل.
  12. قم بتصفية الخلايا باستخدام أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع ، مع غطاء مفاجئ لمصفاة الخلية.
  13. تحليل 20000 حدث PECAM-1 (+) عن طريق قياس التدفق الخلوي.

6.3D تنبت مقايسة تكوين الأوعية وتلطيخ المناعي

  1. في اليوم 9 ، قم بإعداد وسط تنبت بإضافة 10٪ FBS (حجم / حجم) ، bFGF (50 نانوغرام · مل -1) ، VEGF-A (25 نانوغرام · مل -1) ، الإريثروبويتين البشري المؤتلف (hEPO) (20 نانوغرام · مل -1) ، إنترلوكين -6 (IL-6) (10 نانوغرام · مل -1) ، 0.05 مللي مول β-ميركابتوإيثانول ، NEAA (1x) ، L- الجلوتامين (1x) ، بيروفات الصوديوم (1x) ، النوع الأول من الكولاجين ذيل الفئران (1.25 ملغ · مل -1) ، وهيدروكسيد الصوديوم (3.1 مللي مول) إلى وسط GMEM BHK-1.
  2. لتجنب هلام الكولاجين ، حافظ على وسط النبتة على الثلج حتى الاستخدام.
  3. لتقييم تأثير الجزيئات المؤيدة / المضادة لتولد الأوعية ، أضف الدواء أو السيارة المختارة إلى وسط التنبت عند التركيز المحدد.
  4. اجمع EBs البالغة من العمر 9 أيام من طبق أجار واحد 60 مم في أنبوب مخروطي سعة 15 مل (أي ما يعادل حالة واحدة) وقم بإزالة المادة الطافية بعد بضع دقائق من الترسيب.
  5. يغطى قاع طبق استزراع 35 مم ب 1 مل من الوسط المنبت ويحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للحث على الهلام.
  6. أعد تعليق EBs في 2 مل من وسط النبتة البارد.
  7. انقل التعليق إلى طبق الاستزراع 35 مم المطلي بالطبقة الأولى من وسط التنبت.
  8. قم بتوزيع EBs في جميع أنحاء اللوحة وتأكد من أنها على مسافة متساوية من بعضها البعض. احتضان الطبق في حاضنة CO2 . يحدث تكوين البرعم الأول في غضون 24-48 ساعة.
  9. في اليوم 12 ، يتم نقل هلام الكولاجين الذي يحتوي على EBs بعناية إلى شريحة زجاجية (75 × 26 مم) باستخدام ملعقة.
  10. قم بإزالة السائل الزائد باستخدام ماصة (P1000) وقم بتجفيف الجل عن طريق وضع ورقة شاش من الكتان النايلون وبطاقات الترشيح الماصة (ورق نشاف الجل) فوق الجل. الضغط عن طريق وضع وزن (250 جم) لمدة 2 دقيقة. قم بإزالة أوراق النايلون / الترشيح بعناية واترك الشرائح تجف في الهواء لمدة 30 دقيقة في RT.
  11. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق في RT.
  12. إصلاح EBs باستخدام محلول الزنك (انظر جدول المواد) o / n عند 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك ، قم بتثبيت EBs الفلورية الفسيفسائية مع بارافورمالدهيد (PFA) (4٪) o / n عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  13. إزالة المثبت. اغسل الشرائح خمس مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في RT.
  14. نفاذية EBs في PBS التي تحتوي على 0.1٪ Triton-X100 لمدة 15 دقيقة في RT.
  15. قم بإزالة محلول النفاذية. اغسل الشرائح خمس مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  16. احتضان EBs في المخزن المؤقت للحظر (PBS مع 2٪ ألبومين مصل البقر ، BSA) لمدة 1 ساعة في RT.
  17. لتلطيخ براعم البطانية ، استخدم الجسم المضاد الأولي المضاد للفأر المضاد ل PECAM-1 (تخفيف 1: 100) في منع المخزن المؤقت o / n عند 4 درجات مئوية.
  18. اغسل الشرائح خمس مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  19. احتضن الشرائح بالجسم المضاد الثانوي المضاد للفئران Alexa 555 في مانع المخزن المؤقت (تخفيف 1: 250) وعند الحاجة ، مع الجسم المضاد المترافق FITC المضاد ل α-SMA في منع المخزن المؤقت (1: 250 تخفيف) لتلطيخ الخلايا الجدارية لمدة 2 ساعة في RT في الظلام.
  20. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق ومرة واحدة باستخدام H20 قبل تركيبها.

7. التصوير البؤري والتحليل المورفومتري والكمي لبراعم البطانة EB

  1. الحصول على صور عالية الدقة ل EBs المناعية عن طريق دمج المستوى البؤري (z-stacking) باستخدام مجهر متحد البؤر. استخدم هدف التكبير 10x لتصوير EBs كاملة.
  2. قم بتحليل الصور التي تم الحصول عليها باستخدام ImageJ لتقييم التشكل وتحديد خصائص براعم البطانة الإيجابية PECAM-1 وفقا لطرق القياس الكمي المعمول بها13،14،21.
    1. احسب متوسط عدد البراعم البطانية لكل EBs عن طريق حساب إجمالي عدد البراعم يدويا لكل EBs فردية.
    2. قم بقياس أطوال البراعم الفردية باستخدام أداة الرسم ImageJ. حدد قاعدة البرعم البطاني بدءا من منطقة EB الأساسية وارسم خطا يدويا حتى ينتهي طرف البرعم.
    3. احسب متوسط عدد خلايا الطرف لكل برعم عن طريق حساب عدد خلايا الطرف يدويا لكل برعم فردي ثم احسب المتوسط لكل EB.
    4. احسب اتجاه الفيلوبوديا عن طريق تحديد محور البرعم الأصلي يدويا وقياس الزاوية الحادة بينهما باستخدام أداة زاوية برنامج ImageJ. احسب عدد البراعم ذات الاتجاه >50 درجة وقسمها على إجمالي عدد براعم EB ذات الاهتمام.
      ملاحظة: تراوحت الزوايا دائما من 0 درجة إلى 90 درجة.
  3. الحصول على صور عالية الدقة من EBs المناعية باستخدام المجهر متحد البؤر. استخدم هدف التكبير 40x لتحقيق صور عالية الدقة للبراعم البطانية المفردة.
  4. حدد تغطية الوعاء لبراعم EC الإيجابية PECAM-1 المحاطة ب MCs إيجابية α-SMA باستخدام برنامج ImageJ.
    1. قم بتقسيم الصور المدمجة إلى قنوات حمراء وخضراء منفصلة.
    2. تحويل الصور إلى شكلها الثنائي.
    3. قم بقياس المساحة الخلوية الكلية للبراعم التي تشغلها بشكل منفصل PECAM-1 (الخلايا البطانية الموسومة باللون الأحمر) والخلايا الإيجابية α-SMA (الخلايا الجدارية المسماة باللون الأخضر).
    4. قم بإنشاء الصورة المدمجة باستخدام وظيفة حاسبة الصورة وعامل التشغيل AND. قم بقياس المساحة الخلوية الكلية للصورة. لحساب التغطية ، قسم مساحة الصورة المترجمة على مساحة الصورة الثنائية PECAM-1.
  5. لتحليل منافسة الخلايا على موضع خلية الطرف / الساق البطانية للبراعم التي طورتها الفسيفساء EBs ، قم بتسجيل عدد خلايا الطرف يدويا وتحديد أصلها الجيني بناء على إشارة التألق. احسب القيم المتوسطة لكل EB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر الشكل 1 نظرة عامة على البروتوكول لفحص تنبت الأوعية الدموية. تم فصل EBs البالغة من العمر تسعة أيام المشتقة من ثلاثة خطوط 129 / Ola mESC مستقلة (Z / Red و R1 و E14) إنزيميا إلى خلايا مفردة باستخدام كولاجيناز A. تم تلطيخ الخلايا من أجل PECAM-1 وتحليلها بواسطة فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) كما هو موضح. أظهرت جميع خطوط الخلايا تمايز بطاني قوي ، ولم يلاحظ أي اختلافات في قدرتها على التمايز إلى خلايا بطانية. أنتجت جميع خطوط الخلايا حوالي 10.5٪ ± 1.3٪ من الخلايا البطانية (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول مقايسة تنبت الأوعية الدموية غير المتحيزة والقوية والقابلة للتكرار القائمة على 3D EB والتي تكون قابلة لفحص الأدوية والجينات التي تعدل تكوين الأوعية. توفر هذه الطريقة مزايا على العديد من المقايسات ثنائية الأبعاد (2D) المستخدمة على نطاق واسع باستخدام ثقافات الخلايا البطانية مثل الخلايا البطانية الوريدية للوريد السري البشري (HUVECs) لمراقبة الهجرة (مقايسة الخدش الجانبي أو مقايسة غرفة بويدن)22،23 أو الانتشار (عد رقم الخلية ، والكشف عن تخليق الحمض النووي ، والكشف عن علامات الانتشار

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح من Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501) ، Health Holland (LSHM19057-H040) ، برنامج الزملاء الرائد Marie Skłodowska-Curie COFUND ، ومن قبل جمعية Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-mercaptoethanolMilipore ، Merck805740Biohazard: يجب اتباع تعليمات السلامة الكافية عند التعامل
مع Agar NobleDifco ، BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 الماعز المضاد للفئران تقنيات IgGLifeA21434
APC الفئران المترافقة PECAM-1 المضادة للفأر (استنساخ MEC13.3)BD Biosciences551262
APC الجرذ IgG2a & kappa; التحكم في النمط المتماثل (Clone  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 مجهر زراعة الأنسجة المتباينة المقلوبZEISS
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي -2 (bFGF)Peprotech450-33
طرد مركزي على مقاعد الطاولة ، Allegra X-15RBeckman Coulter392932
خزانة السلامة الحيوية BioVanguard (الخط الأخضر) Telstar133H401001
ألبومين مصل الأبقار (BSA)غرفة عد الخلايا Sigma-AldrichA9418
، Buerker ، أطباقMarienfeld640211
مم 60 × 15 ممأطباقالخلايا 353802
، 35 × 10 مم353801Corning
12 بئرCorning3512
CFX96 Touch نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيBiorad1855196
مصل الدجاجسيجما ألدريتشC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
الكولاجين الأول ، تركيز عال ، ذيل الفئران ، 100 مجمكورنينج354249
كولاجيناز ARoche10103586001
المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر مجهر ، نظارات غطاء TCS SP5Leica
، 24 & مرة 50 ممVwr631-0146
DAPT γ؟ مثبط الإفرازSigma AldrichD5942
DC101 مضاد للفأر VEGFR-2 استنساخBioXcellBP0060
DC101 النمط المتماثل للفئران IgG1BioXcellBP0290
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: يجب اتخاذ تعليمات السلامة الكافية عند التعامل
مع DPBS (10x) ، بدون كالسيوم ، لا مغنيسيومGibco ، 14200067
EDTA 40 mMGibco ، Thermofisher Scientific15575-038
خلية جذعية جنينية مصل بقريجنين جيبكو ، Thermofisher Scientific16141-079يجب اختباره كثيرا لتحقيق أقصى قدر من صلاحية الخلايا الجذعية الجذعية ونموها. تعطيل الحرارة عند 60 درجة ؛ C وتخزينها في & ناقص ؛ 20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 1 سنة
Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG& nbsp ؛ Z605212
الإريثروبويتين ، الإنسان (hEPO) ، 250 وحدة (2.5 & micro; ز) (1 مل)Roche11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10؟ وحدات   ؛   1 مل)أنابيب Milipore ، MerckESG1107
Falcon 15 ملأنابيب Greiner Bio-One188271
Falcon 50 ملGreiner Bio-0ne227270
طرف مرشح ، واضح ، معقم F.Gilson ، P-200Greiner Bio-One739288
طرف مرشح ، واضح ، معقم F.Gilson ، P10Greiner Bio-One771288
طرف مرشح ، واضح ، معقم F.Gilson ، P1000Greiner Bio-One740288
FITC مترافق مضاد لألفا ؛ أكتين العضلات الملساء (SMA) (استنساخ 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC الفئران المترافقة المضادة للفأر CD45 (استنساخ 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b ، & kappa ؛ الجسم المضاد Isotype Ctrl (استنساخ RTK4530)Biolegend400605
سيجما ألدريتشG1393-100 مل
غلاسكو MEM (GMEM)Gibco ، Thermofisher Scientific21710082
IHC Zinc FixativeBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 حاضنةPHCBiMCO-170AICUV-PE
إنترلوكين -6 ، إنساني (hIL-6)روش11138600001
L-جلوتامين 200 ملي مولارجيبكو ، Thermofisher scientific25030-024
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)Gibco ، صندوق شرائح المجهر العلمي11140035
Kartell Labware278
شريحة مجهر ، زجاج StarfrostKnittelVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect PrimerAssay QiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect PrimerAssay QiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Mouse (ICR) الخلايا الليفية الجنينية المعطلة   ؛ (2 م)Gibco ، Thermofisher scientificA24903تخزين القوارير في النيتروجين السائل (195.79 درجة ؛ ج) خط
الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى أجل غير مسمى 7AC5 / EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033تم إنشاؤه بواسطة الدكتور أ ناجي ، معهد أبحاث صموئيل لونينفيلد ، مستشفى ماونت سيناي ، 600 University Ave ، تورنتو ، أونتاريو ، M5G 1X5 ، كندا. [Hadjantonakis، A. K.، et al. آليات التنمية. 76 (1– 2) ، 79 & ndash ؛ 90 (1998)].
خطوط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر Acvrl1 +/- و Acvrl1 +/+تم إنشاؤها في المركز الطبي بجامعة ليدن [Thalgott، J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698– 2712 (2018)].
خط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر E14مقدم من مختبر M Letarte وتم إنشاؤه وفقا ل Cho، S. K.، et al. Blood. 98 (13) ، 3635 & ndash ؛ 3642 (2001).
خط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011تم إنشاؤه بواسطة الدكتور أ ناجي ، معهد أبحاث صموئيل لونينفيلد ، مستشفى ماونت سيناي ، 600 شارع الجامعة ، تورنتو ، أونتاريو ، M5G 1X5 ، كندا. [Nagy، A.، et al. إجراءات الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية. 90 (18) ، 8424 – 8428 (1993)].
خط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر Z / Red (سلالة 129 / Ola)تم إنشاؤه بواسطة الدكتور A Nagy ، معهد أبحاث صموئيل لونينفيلد ، مستشفى ماونت سيناي ، 600 University Ave ، تورنتو ، أونتاريو ، M5G 1X5 ، كندا [Vintersten، K.، et al. Genesis. 40 (4) ، 241 & ndash ؛ 246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV / VIS مقياس الطيفالحراري فيشر العلميND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB ،المؤتلف Peprotech100-14B
Pecam-1 ، الفئران المضادة للفئرانBD Biosciences550274
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)جيبكو ، ثيرموفيشر علمي15140122
طبق بتري ، PS ، 94/16 مم ، قياسي ، مع فتحات تهوية ، معقمGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Starter Kit ، 4 ماصات كيت ، P2G ، P20G ، P200G ، P1000GجيلسونF167360
مؤتلف بشري BMP-4 البروتينR& مجموعة D Systems314-BP
RNeasy Plus الصغيرةQIAGEN74134
الماصات المصلية ، 10 ملGreiner Bio-One607 180
ماصة مصلية ، 25 ملGreiner Bio-One760 180
ماصة مصلية ، 5 ملGreiner Bio-One606 180
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)Merck 106498
بيروفات الصوديوم 100 ملي مولار11360039علمية حرارية
5 مل دائري القاع مع غطاء مصفاة الخليةكورنينج352235
الدراجة الحرارية ، T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypan Blue Solution ، 0.4٪Gibco ، Thermofisher العلمي15250061
تريبسين (2.5٪)جيبكو ،15090046
/ نظام زجاجة تخزين ، 500 ملCorning430758
VEGFA165< / sup> ، مؤتلف الفئرانPeprotech450-32
ماء ،معقم Fresenius-KabiB230531
، Lab-Line Digitalثيرمو فيشر العلمي18052 أ
جهاز زراعة الخلايا 0.100 زراعة Corning لوحات زراعة الخلايا Thermofisher Scientific وسائط تركيب الفلورسنت DAKO S3023 Gascompress Cutisoft 45846 Gauze Cutisoft 10 × 10 سم Bsn Medical 45844_00 ورق نشاف جل ، محلول جيلاتين واتمان WHA10547922 من الدرجة GB003 ، النوع ب Thermofisher الضوئي الجسم المضاد البشري جيبكو ، أنابيب اختبار نظام فلتر فراغ علمي من Thermofisher حمام مائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215(2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678(2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147(2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002(2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17(2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Sprouting AngiogenesisThree Dimensional AssayEmbryoid BodiesCollagen Gel CultureEndothelial Tip CellsDrug Testing AssayGenetic ScreeningMural Cell Recruitment

مقالات ذات صلة