Method Article

الكشف عن تجميع البروتين باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري

DOI:

10.3791/62576

⸱

April 25th, 2021

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا نقدم إجراء لقياس أوليغومر البروتين والتجميع في الخلايا lysate والخلايا الحية باستخدام التحليل الطيفي ارتباط مضان.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجميع البروتين هو السمة المميزة للاضطرابات العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD) وما إلى ذلك. للكشف عن وتحليل أوليغومرات البروتين القابلة للذوبان أو المنتشرة أو المجاميع ، تم استخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، والذي يمكنه اكتشاف سرعة الانتشار وسطوع جسيم واحد مع حساسية جزيء واحد. ومع ذلك، لم يتم تقاسم الإجراءات والدراية المناسبة للكشف عن تجميع البروتين على نطاق واسع. هنا ، نعرض إجراء قياسيا لقياس FCS لخصائص الانتشار للبروتينات المعرضة للتراكم في lysate الخلية والخلايا الحية: ALS المرتبطة 25 kDa carboxyl-terminal جزء من TAR DNA / الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين 43 كيلودا (TDP25) وdismutase أكسيد 1 (SOD1). تظهر النتائج التمثيلية أن جزءا من مجاميع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم TDP25 تم تضمينه قليلا في الكسر القابل للذوبان من تحلل خلية الورم الأرومي العصبي المورفين Neuro2a. وعلاوة على ذلك ، GFP الموسومة SOD1 تحمل الطفرة المرتبطة ALS يظهر انتشار أبطأ في الخلايا الحية. وبناء على ذلك، نحن هنا نقدم الإجراء للكشف عن تجميع البروتين عن طريق خاصية نشرها باستخدام FCS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجمعات البروتين التي تنطوي على اضطرابات عصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS), مرض الزهايمر, مرض باركنسون, مرض هنتنغتون, وهلم جرا1 ومن المعروف أن تكون سامة ومن شأنها أن تزعج التوازن البروتين (البروتيوستاسي) في الخلايا والأعضاء, التي يمكن أن تؤدي بعد ذلك إلى الشيخوخة2. ومن المتوقع إزالة البروتين تجميع كاستراتيجية علاجية; ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد المواد الكيميائية التي تمنع تكوين البروتين وتتحلل مجاميع البروتين (مثل الجزيئات الصغيرة أو الأدوية). وعلاوة على ذلك، فإن كيفية ممارسة تجميع البروتين للسمية لا تزال بعيدة المنال. لذلك ، لتعزيز المشاريع البحثية المتعلقة بتجميع البروتين ، من المهم إدخال إجراءات عالية الإنتاجية للكش....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المواد والكواشف

  1. استخدام الحلول الحرة بيراموجينيك والمتوسطة لثقافة الخلية (الجدول 1).
  2. إعداد حلول للتجربة الكيميائية الحيوية باستخدام المياه فائقة الشراء واستخدامها كما DNase / RNase الحرة.
  3. حدد FBS مناسبة لثقافة الخلية مع عملية الاختيار الكثير. وبما أن مجموعة FBS المحددة تتغير بانتظام، لا يمكن تمثيل الكتالوج ورقم اللوت ل FBS هنا.
  4. الحمض النووي البلازميد
    1. إعداد pmeGFP-N15 للتعبير عن أحادية eGFP؛ pmeGFP-C1-TDP256 للتعبير GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 للتعبير SOD1-G85R-GFP؛ وpCAGGS8 باعتبارها الناقل.
      ملاحظة: ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بقياس FCS ل GFP-TDP25 في lysate الخلية وSUD1-G85R-GFP في الخلايا الحية. وفي كلتا الحالتين، أمكن الحصول على سعة إيجابية وسلاسة في الصناديق الاستئمانية. لقد أظهرنا أن جزءا من GFP-TDP25 أعرب في خلايا Neuro2a تم استردادها في جزء قابل للذوبان تحت الشرط المشار إليه6. في جزء قابل للذوبان من lysate الخلية، تم الكشف عن جزيئات مضان مشرق للغاية في سجل معدل العد الفوتون باستخدام FCS(الشكل 2A،أعلى، السهم). لم يلاحظ مثل هذه "المسامير (وتسمى أيضا انفجار)" في مونومرات GFP وم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفيما يتعلق بمعايرة النظام قبل القياسات، ينبغي استخدام نفس الأواني الزجاجية المستخدمة لقياس العينة (على سبيل المثال، تغطي الآبار الثمانية الحجرة الزجاجية لليسات الخلية وطبق الأساس الزجاجي للخلايا الحية مقاس 35 ملم). بسبب الامتزاز من Rh6G على الزجاج، قد ينخفض تركيزها الفعال في بعض الأحيان. إذا كان الأمر كذلك، ينبغي استخدام محلول Rh6G مركزة للغاية مثل 1 ميكرومتر فقط لتعديل الثقب. يجب تجنب معدلات العد الفوتون عالية للغاية لحماية الكاشف (على سبيل المثال، أكثر من 1000 كيلوهرتز). وعلاوة على ذلك، فإن الحل المركز غير مناسب لاقتن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هؤلاء المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

11- وتحظى منظمة "A.K. " بدعم من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) منحة في المعونة لأغراض البحث العلمي (C) (#18K06201)، ومنحة معونة من مؤسسة ناكاتاني للتدابير المضادة ضد العدوى الجديدة بالفيروس التاجي، ومنحة من مكتب جامعة هوكايدو لتطوير قادة بحوث المستقبل (L-Station)، ومنحة مساعدة من مؤسسة هوانشا. 10 - وتحظى م. ك. بدعم جزئي من منحة JSPS في المعونة للبحوث العلمية بشأن المجالات الابتكارية "كيمياء النظم الحيوية المتعددة الجزيئات التي تزاحم" (#20H04686)، ومنحة JSPS في المعونة للبحوث العلمية بشأن المجالات المبتكرة "فيزياء المعلومات للمسائل المعيشية" (#20H05522).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25٪ (وزن / حجم) التربسين -1 مليمول / لتر EDTA & middot ؛ محلول 4Na مع الفينول الأحمر (Trypsin-EDTA)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
أطباق بلاستيكية مقاس 100 ممCORNING430167
طبق قاعدة زجاجي مقاس 35 ممIWAKI3910-035لقياس الخلايا الحية
أطباق بلاستيكية مقاس 35 ممThermo Fisher Scientific150460
لوحة ألومنيومBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x / 1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl Zeiss
مكشطة خليةموضوعية Sumitomo Bakelite Co.، Ltd.MS-93100
غشاء مرشح أسيتات السليلوز (0.22 مم)Advantech Toyo25CS020AS
غطاء حجرة زجاجية 8 آبارIWAKI5232-008لقياس المحلول
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796المتوسط القاعدي
مصل الأبقار الجنينية (FBS)bioseraمطلوب فحص الكثير
ليبوفيكتامين 200011668019ثيرمو فيشر العلمي
LSM510 META + ConfoCor3كارل زايسنظام FCS
الورم الأرومي العصبي الفئراني خلايا Neuro2aATCCCCL-131خط الخلية
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938Plasmid DNA لناقل التعدي
محلول البنسلين والستربتومايسين (& مرات ؛ 100شركة فوجي فيلم واكو بيور كيميكال كورب.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25الحمض النووي البلازميد ل TDP25 الموسومة ب eGFP أحادي
pmeGFP-N1البلازميد DNA لتعبير مونومر eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85Rالحمض النووي البلازميد لتحور G85R المرتبط ب ALS من SOD1 الموسومة بكوكتيل مثبط البروتياز أحادي eGFP
Sigma-AldrichP8304
)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregationFluorescence Correlation SpectroscopyNeurodegenerative DisordersDiffusion PropertiesCell LysateLive Cell MeasurementGFP Tagged ProteinsCurve Fitting AnalysisConfocal MicroscopySoluble Oligomers

Related Articles