الجراحة ومعالجة العينة للتصوير المترابط للصمام الرئوي مورين

Summary

هنا، نقوم بوصف سير عمل مترابط لتكسير الصمام الرئوي المورين والضغط عليه وتركيبه وتصويره لتحديد التركيب الإجمالي وهياكل المصفوفة خارج الخلية المحلية.

Abstract

الأسباب الكامنة وراء أمراض صمام القلب ذات الصلة (HVD) بعيد المنال. نماذج مورين توفر أداة ممتازة لدراسة HVD، ومع ذلك، فإن الخبرة الجراحية والآلات اللازمة لتحديد بدقة هيكل وتنظيم عبر جداول طول متعددة قد توقف تقدمها. يقدم هذا العمل وصفا مفصلا لتشريح المورين ، وتلطيخ الكتلة ، ومعالجة العينات ، وإجراءات التصوير المترابط لتصوير صمام القلب على نطاقات طول مختلفة. تم استخدام الضغط عبر الصمام الهيدروستاتيكي للسيطرة على التغايرية الزمنية عن طريق إصلاح كيميائيا تشكيل صمام القلب. تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) لتأكيد هندسة صمام القلب وتوفير مرجع لمعالجة العينة المصب اللازمة للفحص المجهري الإلكتروني لمسح الوجه التسلسلي (SBF-SEM). تم التقاط صور عالية الدقة للمصفوفة خارج الخلية (ECM) وإعادة بنائها لتوفير تمثيل محلي ثلاثي الأبعاد لمؤسستها. ثم تم ربط طرق التصوير μCT و SBF-SEM للتغلب على الاختلاف المكاني عبر الصمام الرئوي. وعلى الرغم من أن العمل المقدم يقتصر على الصمام الرئوي، فإن هذه المنهجية يمكن اعتمادها لوصف التنظيم الهرمي في النظم البيولوجية، وهي محورية بالنسبة لتوصيف الهيكلي عبر مقاييس متعددة الطول.

Introduction

يعمل الصمام الرئوي (PV) على ضمان تدفق الدم أحادي الاتجاه بين البطين الأيمن والشريان الرئوي. ترتبط تشوهات الصمام الرئوي بعدة أشكال من أمراض القلب الخلقية. العلاج الحالي لأمراض صمام القلب الخلقية (HVD) هو إصلاح الصمام أو استبدال الصمام ، والذي يمكن أن يستلزم عمليات جراحية متعددة الغازية طوال عمر المريض¹. وقد تم قبول على نطاق واسع أن وظيفة صمام القلب مشتقة من هيكلها، وغالبا ما يشار إليها باسم وظيفة هيكل مترابطة. وبشكل أكثر تحديدا، فإن الخصائص الهندسية والميكاميكية الحيوية للقلب تملي وظيفته. الخواص الميكانيكية، بدورها، يتم تحديدها من خلال تكوين وتنظيم ECM. من خلال تطوير طريقة لتحديد الخصائص الميكانيكية الحيوية لصمامات القلب مورين، يمكن استخدام نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا لاستجواب دور ECM على وظيفة صمام القلب والخلل^{الوظيفي 2،3،4،5}.

لطالما اعتبر نموذج المورين معيارا للدراسات الجزيئية لأن النماذج المعدلة وراثيا متاحة بسهولة أكبر في الفئران مقارنة بالأنواع الأخرى. نماذج مورين المعدلة وراثيا توفر منصة متعددة للبحث في الأمراض المرتبطة بصمام القلب⁶. ومع ذلك، كانت الخبرة الجراحية ومتطلبات الأجهزة لتوصيف كل من الهندسة وتنظيم ECM عقبة رئيسية في تقدم أبحاث HVD. توفر البيانات الهستولوجية في الأدب صورة في محتوى مصفوفة صمام القلب المورين خارج الخلية ، ولكن فقط في شكل صور 2D ، وغير قادرين على وصف هندسته المعمارية ثلاثية الأبعاد^7و8. بالإضافة إلى ذلك، يكون صمام القلب غير متجانس مكانيا وزمانيا، مما يجعل من الصعب استخلاص استنتاجات عبر التجارب المتعلقة بتنظيم ECM إذا لم يتم إصلاح أخذ العينات والتطابق. لا توفر طرق التوصيف ثلاثي الأبعاد التقليدية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو تخطيط صدى القلب ثلاثي الأبعاد، الدقة اللازمة لحل مكونات ECM^9و10.

هذا العمل تفاصيل سير العمل المترابطة تماما حيث تم تناول التغايرية الزمنية بسبب دورة القلب عن طريق تحديد تشكيل الكهروضوئية مورين مع الضغط عبر الصمام الهيدروستاتيكي. تم التحكم في التغايرية المكانية بدقة عن طريق أخذ عينات المناطق ذات الاهتمام وتسجيل مجموعات البيانات من طرائق التصوير المختلفة ، وتحديدا μCT وكتلة المسلسل مسح المجهر الإلكتروني ، عبر مقاييس طول مختلفة. وقد اقترح هذا الأسلوب من الكشفية مع μCT لتوجيه أخذ العينات المصب سابقا، ولكن لأن الصمام الرئوي يحمل الاختلاف الزمني، كان هناك حاجة إلى مستوى إضافي من السيطرة على المستوى الجراحي¹¹.

في دراسات الجسم الحي التي تصف الميكانيكا الحيوية صمام القلب مورين متناثرة، وبدلا من ذلك، تعتمد على النماذج الحاسوبية عند وصف سلوك تشوه. ومن الأهمية بمكان أن تكون البيانات المحلية خارج الخلية على مقياس طول نانومتر ذات صلة بهندسة وموقع صمام القلب. وهذا بدوره يوفر توزيعات قابلة للقياس الكمي ورسم خرائط مكانية لبروتينات ECM المساهمة ميكانيكيا ، والتي يمكن استخدامها لتعزيز نماذج صمام القلب الميكانيكية الحيوية الموجودة^12و13و14.

Protocol

كان استخدام الحيوانات في هذه الدراسة وفقا للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية لرعاية الحيوانات في مستشفى الأطفال على مستوى البلاد بموجب البروتوكول AR13-00030.

1. استئصال الصمام الرئوي

1. أوتوكلاف الأدوات اللازمة لتشريح الماوس. وهذا يشمل مقص غرامة، ملقط صغير، المشابك الأوعية الدموية الصغيرة، المشبك تطبيق ملقط، أصحاب microneedle، مقص الربيع، والمسحبات.
2. تأقلم جميع الفئران لمدة أسبوعين على الأقل قبل العملية. إزالة C57BL/6 الفئران، ما يقرب من 1 سنة من العمر، من أقفاصها ووزنها، ثم القتل الرحيم مع كوكتيل الكيتامين / xylazine (3:1 الكيتامين: xylazine، 0.01 مل لكل غرام) جرعة زائدة.
3. ضع الماوس في وضع إعادة حثالة الظهر على صينية وأمن أطرافه بشريط لاصق. بمجرد تأمينها، قم بإجراء استئصال الصدر.
   1. كشف القلب عن طريق إزالة أي الأنسجة الدهنية الزائدة واللفافة.
   2. إزالة الأذين الأيمن و perfuse من خلال البطين الأيسر مع محلول ملحي درجة حرارة الغرفة (0.9٪ NaCl). يجب أن يستغرق التشوه حوالي 20 مل فوق 30 s. وهذا يؤدي إلى exsanguination الماوس.
4. إزالة القلب بأكمله عن طريق قطع الوريد الأجوف متفوقة، الوريد الأجوف أدنى، الشريان الرئوي، والشريان الأورطي. يجب توخي الحذر بشكل خاص للشريان الرئوي. قطع ما يقرب من 2 مم فوق تقاطع البطين الشرياني، وهذا سيكون بمثابة قناة للضغط.
5. إزالة البطينين الأيسر والأييم لتعريض الغرف للضغط الجوي. تأكد من أن هيكل الجذع الرئوي يجب أن لا يتأثر بإزالة البطينين.

2. تثبيت ضغط الصمام الرئوي

1. أنابيب الضغط Anastomose مع الشريان الرئوي، وترك ما يقرب من 1 مم المسافة بين تقاطع الصينية أنبوبي ونهاية الأنابيب لاستيعاب لحركات كبيرة من المنشورات والجذع الرئوي.
2. رفع الخزان إلى ضغط فسيولوجي مماثل وملئه بالمحلول الملحي. اختبر نظام التدفق للتأكد من عدم وجود انسداد أو فقاعات هوائية.
3. إرفاق stopcock إلى الصمام الرئوي anastomosed وضمان تدفق كاف من خلال الأنابيب (أي، لا فقاعات الهواء) عن طريق تبديل المسالك تدفق. بمجرد أن يكون التدفق كافيا ، قم بتبديل التدفق إلى الصمام الرئوي المصاب بالانستماء وتأكد من الضغط على الجذع الرئوي. يتم التعرف على هذا عن طريق تفكك الجذع الرئوي.
4. بمجرد تأكيد ضغط الجذع الرئوي ، قم بدمج محلول التثبيت الأساسي تدريجيا (1.25٪ غلوتارالدهيد ، 1.0٪ بارافورمالديهايد في 0.15 M cacodylate) حتى يتم تطهير المحلول المالح. ويتم ذلك عن طريق إزالة جزء، ما يقرب من 25٪ من قدرة الخزان، من المحلول الملحي واستبداله بالمثبت الأساسي.
   تنبيه: المثبتات المستخدمة (بارافورمالديهايد وجلوتارالدهيد) هي معدات حماية شخصية شديدة السمية ومناسبة (PPE) يجب ارتداؤها لضمان السلامة.
5. ضع شاش مثبتا على عينة الأنسجة لمنع التجفيف.
6. Perfuse المثبت لمدة 3 ساعة، وإعادة ملء الخزان حسب الحاجة للحفاظ على ضغط مستمر. في جميع أنحاء التثبيت، فإنه ليس من غير المألوف للصمام الرئوي لتقليص بسبب التثبيت الكيميائي. إذا كان هذا هو الحال، وتجديد باستمرار الخزان مع المثبتة الأولية للحفاظ على الضغط الفسيولوجي.
7. قم بتخزين صمام القلب في المحلول المثبت عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تم تخزين العينات لمدة تصل إلى أسبوع واحد دون أي فرق ملحوظ.

3. En كتلة عينة تلطيخ وتضمين^15،16

تنبيه: الكواشف تلطيخ المستخدمة في هذا القسم (البوتاسيوم ferrocyanide، التيتروكسيد أوسميوم، ثيوكاربوهيدرازيد، اسبارتات الرصاص، وخلات أورانيل) هي سامة للغاية، وينبغي التعامل معها بعناية فائقة. ينصح باستخدام غطاء الدخان وPPE المناسبة.

1. تلطيخ
   1. اغسل عينة صمام القلب الثابت لمدة 5 دقائق مع العازلة الباردة cacodylate 0.15 M. كرر الغسيل مرتين أخريين.
   2. غمر صمام القلب بالكامل في محلول من 1.5٪ فيروكيانيد البوتاسيوم، 0.15 M cacodylate، 2 mM كلوريد الكالسيوم، و 2٪ من التيتروكسيد الأوسميوم، على الجليد لمدة 1 ساعة.
   3. في حين أن العينة هي احتضان، وإعداد محلول ثيوكاربوهيدرازايد (TCH) عن طريق حل 0.1 غرام من TCH في 10 مل من ddH₂O. وضع الحل في فرن 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. يهيج بلطف دوريا لضمان حل TCH تماما. تصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر مباشرة قبل الاستخدام.
   4. غسل العينات مع درجة حرارة الغرفة ddH₂O عن طريق وضعها في أنبوب من DDH₂O لمدة 5 دقائق وتهيج قليلا عن طريق هز الحاوية. كرر هذه العملية ثلاث مرات.
   5. ضعه في محلول TCH المصفى لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء خطوة الغسيل ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) مع درجة حرارة الغرفة ddH₂O كما هو موضح في الخطوة 3.1.4.
   6. وبمجرد الانتهاء من ذلك، ضع العينة في 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل مرة أخرى لما مجموعه ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها مع درجة حرارة الغرفة ddH₂O.
   7. احتضان العينة في خلات أورانيل 1٪ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
   8. خلال هذا الوقت، وجعل حل 0.066 غرام من نترات الرصاص في 10 مل من محلول حمض الأسبارتيك الأسهم. ضبط درجة الحموضة إلى 5.5 مع 1 N KOH. ضع المحلول في فرن 60 درجة مئوية لإذابة نترات الرصاص.
   9. بعد الحضانة الليلية، قم بإجراء خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوة 3.1.4. كرر ثلاث مرات. ثم، احتضان أنسجة صمام القلب في حل الأسبارتات الرصاص من الخطوة 3.1.8 في فرن 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. تجفاف
   1. غسل الأنسجة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع ddH₂O. كرر ثلاث مرات.
   2. تقديم حلول جديدة من 20٪، 50٪، 70٪، 90٪، و 100٪ الإيثانول في ddH₂O. الحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
   3. لتجفف نسيج صمام القلب. إجراء العلاجات اللاحقة من 20٪، 50٪، 70٪، و 90٪ الإيثانول على الجليد لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم إجراء علاجين لاحقين من الإيثانول 100٪ على الجليد لمدة 5 دقائق.
   4. نقل الأنسجة إلى الأسيتون الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة. ثم ضع في الأسيتون الطازج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
3. تضمين
   1. جعل خليط الراتنج (انظر جدول المواد)وفقا لمواصفات الشركة المصنعة: 11.4 غرام من المكون A، 10 غرام من المكون B، 0.3 غرام من المكون C، و 0.05-0.1 غرام من المكون D. في البداية مزيج المكونات A و B عن طريق تسخين كل من المكونات إلى 60 درجة مئوية قبل إضافة المكونات C و D. سوف يتحول الخليط إلى لون العنبر عند إضافة المكونات C و D. وسوف تكون موحدة عندما مختلطة بشكل صحيح.
   2. جعل الخلائط مع نسب حجم 25:75، 50:50، و 75:25 الراتنج: الأسيتون. تخلط جيدا.
   3. وضع الأنسجة في العلاجات اللاحقة من 25:75، 50:50، و 75:25 الراتنج: خليط الأسيتون لمدة 2 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
   4. وضع الأنسجة في الراتنج 100٪ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
   5. في اليوم التالي، ضع الأنسجة في راتنج 100٪ الطازج لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   6. نقل أنسجة صمام القلب إلى كبسولة التضمين، واستبدال مع الراتنج الطازجة 100٪، ووضعها في فرن 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لعلاج.
4. إجراء التصوير المترابط كما هو موضح أدناه.

4. التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة

1. جبل كتلة عينة الراتنج على حامل عينة μCT مع لاصقة (الغراء أو الشريط على الوجهين يعمل بشكل جيد).
2. ضع الحامل في غرفة μCT وأصلحه على المسرح عن طريق الشد على الكلية بحيث لا يكون هناك أي حركة من حاملها. سوف يقلل تحرك العينة أثناء الفحص من جودة الصورة.
3. افتح واجهة المستخدم μCT بالنقر المزدوج فوق الرمز. إضافة مشروع عن طريق تحديد علامة + بجوار المشاريع وتعبئة الحقول الضرورية.
4. بمجرد إنشاء هذا، ابحث عن المشروع الذي تم إنشاؤه، وحدده بالنقر فوقه. سيؤدي ذلك إلى فتح عمود ثان لعمليات الاستحواذ. حدد + بجوار عمليات الاستحواذ واملأ الحقول الضرورية.
5. أغلق أبواب الغرفة وتسلح النظام عن طريق الضغط على زر التسليح على اللوحة الأمامية أو μCT. الاحماء بالأشعة السينية من واجهة المستخدم عن طريق تحديد الزر الذي يشير إلى الاحماء.
   ملاحظة: سيقوم النظام تلقائيا بإيقاف تشغيل الأشعة السينية بعد إجراء عملية إحماء ناجحة. قم بتشغيل الأشعة السينية عن طريق تحديد الزر.
6. ضبط دوران المرحلة بحيث لا ينحرف مركز دوران العينة عن مركز الشاشة (أي أن العينة تقع ضمن مجال الرؤية للمسح الضوئي بأكمله). بالنسبة للنظام المستخدم في هذه التجربة، يتضمن ذلك تعديل مرحلة منطقة الاهتمام (ROI) تحت علامة التبويب المنسدلة كما هو مفصل أدناه.
   1. قم بتعيين تعديل مرحلة عائد الاستثمار عن طريق تعيين زاوية الدوران إلى 0° ووضع علامة على حافة العينة. ثم يتم تدوير العينة إلى 180 درجة ويتم وضع علامة على حافة العينة مرة أخرى.
   2. ضبط وضع محور x المرحلة العائد على الاستثمار بحيث حافة العينة بين هذه النقيضين. كرر هذه العملية لزوايا دوران 90 درجة و 270 درجة للموضع y.
   3. في حالة تسبب دوران العينة في انتقال الحواف من مجال الرؤية، قم بتقليل تكبير احتياجات μCT حتى تظهر حواف العينة في زوايا المجموعة أعلاه ويمكن إجراء تعديل مرحلة عائد الاستثمار الخشن.
   4. بمجرد تعديلها في التكبير السفلي ، قم بتحريك العينة أو الكاشف لزيادة التكبير ويمكن تعديل أوضاع عائد الاستثمار بشكل جيد.
      ملاحظة: قد تحتاج هذه العملية إلى تكرار لضمان المحاذاة. ينتج عن المحاذاة المناسبة عينة تظهر حركة أفقية قليلة أو معدومة من خلال جميع زوايا دوران العينة.
7. ضبط μCT إلى معلمات المسح المطلوب باستخدام برنامج الشركة المصنعة. وتشمل هذه المعلمات إمكانات الأنبوب، وتيار الأنبوب، ومسافة الكاشف، ومسافة العينة، ووقت التعرض، والمسار، وعدد الإسقاطات (انظر الجدول S1 لمعرفة معلمات اكتساب μCT المستخدمة في هذه الدراسة).
   ملاحظة: يجب الاحتفاظ بمعلمات المعايرة، مثل مسح الحقل ومسح الحقل المظلم، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ما لم يذكر خلاف ذلك. على سبيل المثال، إذا كان نموذج كبير جدا ولا يمكن للنظام نقل العينة من طريقة عرض الحقل، ثم العينة تحتاج إلى إزالتها لإجراء مسح مسح معايرة الحقل.
8. بمجرد تعيين المعلمات، يمكن رؤية تقريب مدة الفحص عن طريق الضغط على زر تقدير الوقت. حدد الزر ابدأ لبدء الفحص.
9. بعد الانتهاء من الفحص، تأكد من إيقاف تشغيل الأشعة السينية، فك الكلية، وإزالة العينة بعناية من غرفة μCT.

5. معالجة العينة وارتباط الصورة

1. إعادة بناء إسقاطات μCT باستخدام خوارزمية إسقاط الخلفية المصفاة مع البرنامج المقدم من قبل الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   1. حدد علامة التبويب ريكون في أعلى الشاشة. حدد علامة التبويب المشروع والاستحواذ.
   2. حدد اقتران قالب recon بإسقاط تمت تصفيته مرة أخرى. اضغط على زر بدء إعادة التكون.
2. تحديد الصمام الرئوي وتقسيمه باستخدام برنامج معالجة الصور. وهذا يتطلب معرفة مسبقة لتشريح الصمام الرئوي¹⁷. في الضغوط الشريانية المرتفعة ، تحاصر المنشورات وتحجب تجويف الصمام الرئوي.
3. تحديد اتجاه التقطيع فيما يتعلق باتجاه المسح الضوئي والعينة. إعادة توجيه العينة بحيث يتم محاذاة اتجاه تشريح مع المحور المطلوب.
4. تحديد المناطق ذات الاهتمام للتصوير عالي الدقة. في هذه التجربة، تم اختيار بطن (وسط) المنشور وتقاطع الشرياني فالفولار.
5. إزالة الراتنج الزائد وعينة إما عن طريق شفرة الحلاقة أو الرملي لقطع كبيرة من المواد، أو عن طريق microtome لقطع أدق.
6. مرة واحدة في موقع الاهتمام، قارن العينة المادية مع شرائح μCT الظاهري لتأكيد الموقع. وقد تم ذلك من خلال مقارنة الميزات التشريحية في المقطع العرضي.

6. تسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكتروني¹⁸

1. تقليل المقطع العرضي للعينة لاستيعاب SBF-SEM، حوالي 2.0 × 1.5 × 1.8 مم.
2. قم بتركيب العينة المشذبة على كعب الألمنيوم SBF-SEM باستخدام الايبوكسي.
3. معطف كتلة عينة مع الذهب 35 نانومتر. تدور العينة على المنصة لتطبيق طبقة حتى من الطلاء.
4. تنفيس غرفة SBF-SEM وضبط ارتفاع شفرة السكين إلى ارتفاع المجهر eucentric.
5. إدراج نموذج ومستوى كعب الروتين عينة.
6. الصورة في ظل ظروف فراغ منخفضة لمنع الشحن ومع كاشف الروافض الخلفية (انظر الجدول S2 لمعلمات الاستحواذ SBF-SEM).
7. صورة وغرزة مناطق متعددة من الاهتمام في التكبيرات المختلفة باستخدام البرمجيات الآلية (انظر جدول المواد).

Results

يظهر تناضح الشريان الرئوي إلى أنابيب الضغط في الشكل 1A. بعد تطبيق الضغط الهيدروستاتيكي ، ينتفض الجذع الرئوي شعاعيا(الشكل 1B)مما يشير إلى أن منشورات الصمام الرئوي في تكوين مغلق. تم تأكيد تشكيل الصمام الرئوي عن طريق μCT. في هذه الحالة، كانت المنشورات coapt (مغلقة) وكان annulus دائرية(الشكل 2A). الشكل 2B, C يظهر درجات متفاوتة من الضغط صمام رئوي غير كافية عن طريق إما التثبيت ( الشكل

Discussion

إزالة البطينين يخدم غرضين. أولا، تعريض جانب البطين للضغط الجوي، وبالتالي يحتاج فقط إلى تطبيق ضغط عبر الصمام من الجانب الشرياني للصمام الرئوي لإغلاق، وثانيا، توفير قاعدة مستقرة لمنع التواء الجذع الرئوي. أثناء الضغط ، ينتقص الجذع الرئوي بشكل شعاعي وأقل شأنا ، مما يجعله عرضة للالتواء ، مما يسبب انهيار الجذع الرئوي. يوفر التحميل المسبق للصمام الرئوي بمحلول ملحي فحصا إضافيا للجودة لضمان أن الضغط كاف وإذا كان هناك أي تسرب في النظام. عمل التثبيت الأساسي سريع ، في غضون ثوان قليلة ، وبدون التحميل المسبق الهيدروستاتيكي مع المحلول ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25٪ جلوتارالديهايد (aq)	EMS	16210	المكون المثبت الأساسي
0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 مل حقنة	BD	309659
10 مل حقنة	BD	309604
200 دليل على الإيثانول	EMS	15055
22G إبرة	BD	305156
3 مل حقنة	BD	309657
3 اتجاهات محبس	سميث الطبية ASD، Inc.	MX5311L
4٪ رابع أكسيد الأوزميوم	EMS	19150	مكون تلطيخ
4٪ بارافورمالدهيد (aq)	EMS	157-4-100	مكون مثبت أساسي
تمتص إرقاء قابل	للامتصاص Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
خياطة أحادية بولي أميد أسود ، 10-0	شركة	AROSurgical instruments CorporationTI38402
خياطة أحادية البولي أميد الأسود ، 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL / 6 الفئران	مختبرات جاكسون	664	تقريبا 1 yo
كلوريد الكالسيوم	Sigma-Aldrich	10043-52-4
المشبك تطبيق الملقط	FST	00072-14
طرف القطن	فيشر Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont # 5 ملقط	FST	11251-20
Dumont # 5/45 ملقط	FST	11251-35
Dumont # 7 ملقط ناعم	FST	11274-20
راتنج Durcupan ACM	EMS	14040	لتضمين
مقص ناعم	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
حقن هيدروكلوريد الكيتامين	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	مكون تلطيخ
نترات الرصاص	EMS	17900	مكون تلطيخ
كاشف التشتت الخلفي منخفض الفراغ	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM كاشف التشتت الخلفي
Micro-adson ملقط	FST	11018-12
مرشح Millex-GP ، 0.22 ميكرومتر ، PES 33 مم ، غير معقمة	EMD Millipore	SLGP033NS
الأغاني غير المنسوجة	McKesson Corp.	94442000
سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (II) ثلاثي هيدرات	سيجما-ألدريتش	14459-95-1	مكون تلطيخ
هيدروكسيد البوتاسيوم	سيجما-ألدريتش	1310-58-3
خط مراقبة الضغط	سميثس ميديكال ASD، Inc.	MX562
محلول ملحي (معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
حجم 3 كبسولة BEEM	EMS	69910-01	حاوية التضمين
ثلاثي هيدرات الكاكوديلات الصوديوم	Sigma-Aldrich	6131-99-3	ضاغطات العازلة
Solibri	FST	17000-04
الرش والكربون والشعاع الإلكتروني المغطي	Leica	EM ACE600	Gold المغطي
المجهر الجراحي	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	مكون تلطيخ
Tish حامل إبرة / ملقط	Micrins	MI1540
ماكينة تشذيب	Wahl	9854-500
أسيتات اليورانيل	EMS	22400	مكون تلطيخ
مجهر إلكتروني المسح الضوئي Thermo	Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	الكتلة التسلسلية المسح الضوئي للوجه المجهر الإلكتروني
الحل المعقم زيلازين	Akorn Inc.	ندى # 139-236