مقالة منهجية

فحص الكروموسومات للأجنة البشرية قبل الزرع باستخدام وسط الثقافة المستهلكة: جمع العينات وتحليل الصيغة الصبغية الكروموسومية

DOI:

10.3791/62619

⸱

سبتمبر 7, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير هذه الدراسة إلى بروتوكول لفحص الكروموسومات للأجنة البشرية يستخدم وسط مزرعة مستهلك ، والذي يتجنب خزعة الجنين ويتيح تحديد الصيغة الصبغية للكروموسوم باستخدام NGS. تقدم هذه المقالة الإجراء التفصيلي ، بما في ذلك إعداد وسط الثقافة ، وتضخيم الجينوم الكامل (WGA) ، وإعداد مكتبة تسلسل الجيل التالي (NGS) ، وتحليل البيانات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الإخصاب السريري في المختبر (IVF) ، تتطلب الطريقة السائدة ل PGT-A خزعة من عدد قليل من الخلايا من الأديم الظاهر (TE). هذه هي السلالة التي تشكل المشيمة. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة مهارات متخصصة ، وهي غازية ، وتعاني من إيجابيات وسلبيات كاذبة لأن أعداد الكروموسومات في TE وكتلة الخلية الداخلية (ICM) ، التي تتطور إلى الجنين ، ليست هي نفسها دائما. وقد توفر تقنية NICS، وهي تقنية تتطلب تسلسل الحمض النووي الذي يتم إطلاقه في وسط الاستزراع من كل من TE و ICM، مخرجا لهذه المشاكل ولكن ثبت سابقا أن فعاليتها محدودة. وتبلغ هذه الدراسة عن البروتوكول الكامل لنظام NICS، الذي يتضمن أساليب أخذ العينات بوسط الاستزراع، وتضخيم الجينوم الكامل وإعداد المكتبة، وتحليل بيانات NGS بواسطة برامجيات التحليل. بالنظر إلى أوقات الحفظ بالتبريد المختلفة في مختبرات الأجنة المختلفة ، لدى علماء الأجنة طريقتان لجمع وسط زراعة الأجنة الذي يمكن اختياره وفقا للظروف الفعلية لمختبر التلقيح الاصطناعي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام تقنيات الإنجاب المساعدة (ARTs) بشكل متزايد لعلاج العقم. ومع ذلك، فإن معدل نجاح العلاج المضاد للفيروسات القهقرية، مثل التلقيح الاصطناعي، كان محدودا، ومعدل فقدان الحمل أعلى بكثير من معدل فقدان الحمل لدى السكانالعاديين 1. السبب الرئيسي لهذه المشاكل هو تشوهات الكروموسومات ، والتي توجد عادة في الأجنة البشرية قبل الزرع2. PGT-A هي طريقة فعالة لفحص الأجنة لتوازن الكروموسومات قبل الزرع 3,4. أثبتت بعض الدراسات أن PGT-A يمكن أن يقلل من معدل الإجهاض ويحسن معدل الحمل5،6،7،....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على إذن أخلاقي من لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة بكين الثالث.

1. التحضير

ملاحظة: يتم سرد المواد والمعدات المطلوبة في جدول المواد.

  1. الكواشف
    1. التسخين المسبق والتوازن (المتوازن) 20-30 ميكرولتر من وسط الأمشاج / وسط الإخصاب ووسط ثقافة مرحلة الانقسام / الكيسة الأريمية (مغطى بالزيت المعدني) والهيالورونيداز (في أنبوب مغطى بإحكام) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 و 5٪ O2 في حاضنة ثلاثية الغازات طوال الليل قبل الاستخدام.
    2. سخن الهيالورونيداز إلى 37 درجة مئوية على سطح العمل في غطاء الدخان.
    3. قم بإعداد المخزن المؤقت للتزجيج وكواشف جمع العينات وفقا ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طبقت الدراسة الحالية الطريقة المقترحة على المريض. وتم الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية والموافقة المستنيرة قبل تطبيق تحليل النظام الوطني للإحصاء الوطني. حصلت الدراسة الحالية على 6 أكياس أريمية من المرضى وأجرت NICS على جميع الأجنة الستة في اليوم 4 إلى اليوم 5 المتوسط. تم الكشف عن تشوهات الكروموسومات الناجمة عن النقل المتوازن للوالدين في خمسة من الكروموسومات مع اختبار NICS. لذلك ، لا يمكن استخدامها للنقل (الشكل 4A-E). أظهرت نتائج NICS للجنينين نفس النمط النووي 45 ، وكا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

إذا كانت نتائج NICS ملوثة بالمواد الوراثية الأبوية ، فتأكد من إزالة جميع خلايا الركام - كورونا الشعاعي وتأكد من إجراء الحقن المجهري للتخصيب. يتم تجنب التخزين المتوسط غير السليم أو عمليات إعداد القالب ، مما قد يؤدي إلى تدهور الحمض النووي. تم تنقية مساحة العمل تماما باستخدام كواشف إزالة التلوث DNase و RNase. لتجنب التلوث من الأجنة الأخرى ، تم دائما استزراع جنين واحد في قطرة واحدة من الوسط لتجنب التلوث المتبادل بدءا من اليوم 4. يتم تقليل ظاهرة .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaxin Yao و Jieliang Ma و Jing Wang و Sijia Lu هم موظفون في Yikon Genomics Co.، Ltd.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا Shiping Bo و Shujie Ma على مساعدتهم في تحليل بيانات NGS. التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (رقم المنحة 2018YFC1003100).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

يوصى يمكن يمكن كاشف كاشف كاشف مزيج الاصطناعي قبل ميزة ، فإن

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
باستخدام أنبوب EP سعة 1.5 مل ، وأنبوب PCR سعة 0.2 ملAxygenMCT-150-C ، وأنابيب PCR-02-CDNase / RNase الخالية من أنابيب PCR منخفضة الربط وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
10 وميكرو ؛ لتر ، 200 وميكرو ؛ L ، 1000 & L DNase / RNase نصائحمجانية AxygenT-300-R-S ، T-200-Y-R-S ، T-1000-B-R-Sيمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لنقل العينة
100٪ من الإيثانولسينوفارم الكيميائي10009218يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لتنقية مكتبة الحمض النووي
الباركود التمهيدي 1-48كاشف Yikon Genomicsفي NICمجموعة إعداد المكتبةلطبق
ثقافة الجهاز BD Falcon ، 363037 معقمBD Bioscienceاستبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لزراعة الأجنة
أطباق زراعة أنسجة BD Falcon (Easy Grip) ، ومعقمBD Bioscience353001يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لزراعة الأجنة
أطباق زراعة أنسجة BD Falcon ، 353002 معقمةBD Bioscienceاستبدالها بعلامة تجارية أخرى / لزراعة الأجنة
Cell Lysis BufferYikon كاشف الجينومفي NICطقم تحضير المكتبةلوسط الثقافة المعالجة المسبقة
إنزيم تحلل الخليةكاشف جينوم Yikonفي NICSطقم تحضير المكتبةلوسط الثقافة المعالجة المسبقة
برنامج ChromGoYikon Genomics
تحليل البيانات CMPure Magbeadsجينوم Yikonفي NICSIمجموعة إعداد المكتبةلتنقية المكتبة
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma81110يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لتزجيج الأجنة
جينوم الماء المقطرYikon في NICSIمجموعة تحضير مكتبةلحل DNA
ES (مجموعة التزجيج)  ؛ كيتازاتو بيوفارماكاشف فيمجموعة التنقيطيمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لتزجيج الأجنة
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى
/ بالنسبة لمحلول الحقن المجهري
Hyaluronidase ، 80 U / mLSAGEART4007-Aيمكن استبداله بعلامة تجارية أخرى / مركب البويضة الهالية الركامية
ICSIORIGIOMPH-35-35يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / For ICSI
Illumina MiSeq & reg ؛ نظامIlluminaSY-410-1001لتسلسل المكتبة
حاضنةLabotectInkubator C16يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لثقافة الأجنة
المخزن المؤقت للمكتبةYikon Genomicsفي NICSI طقم إعداد المكتبةلمكتبة Amplificaton
مكتبة مزيج إنزيمYikon GenomicsRecode في NICSI طقم تحضير المكتبةللمكتبة amplificaton
الحامل المغناطيسيDynaMagTM-212321Dلتنقية المكتبة
المجهرOLYMPUS1X71يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لمراقبة الأجنة
جهاز طرد مركزي صغيرESSENSCIENELF6للفصل
إنزيمMT كاشف جينوم Yikonفي NICطقم تحضير مكتبةللمعالجة المسبقة لوسط الثقافة
NICSIمجموعة إعداد المكتبةYikon GenomicsKT1000800324تضخيم الجينوم الكامل وبناء المكتبة
NICSInst محطة إعداد العينةYikon Genomics  ME1001003تضخيم الحمض النووي
Nunc IVF 4-Well DishThermo Scientific144444يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لغسل الأجنة وثقافة الكيسة الأريمية
Pasteur PipetteOirgio& nbsp ؛ MXL3-IND-135يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / بالنسبة لغربة الأجنة
ماصات باستورORIGIOPP-9-1000يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لمختبر التلقيح
Pre-Lib Bufferكاشف Yikon GenomicsReagent في NICSI مجموعة إعداد المكتبةالمكتبة
Pre-Lib EnzymeYikon GenomicsReagent in NICSI
Qubit & reg; 3.0 مقياس الفلورالحراري العلميQ33216لتقدير كمية المكتبة
ميزة كوين الكيسة الأريمية المتوسطةSAGEART-1029لزراعة مرحلة الكيسة الأريمية الجنينية
Quinn's Cleavage MediumSAGEART-1026يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لثقافة مرحلة انقسام الأجنة
Quinn's ميزة الإخصاب متوسطSAGEART-1020يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لتخصيب البويضات المنوية
Quinn's Advantage m-HTF Medium مع HEPESSAGEART-1023يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / بالنسبة للأجنة
Quinn's Advantage SPS مصل البروتين البديلكيت SAGEART-3010يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لتعرية البويضة
ميزة كوين زيت معدني لزراعة الأنسجةSAGEART-4008Pيمكن استبداله بعلامة تجارية أخرى / لتغطية وسط الثقافة
STRIPPER TIPSORIGIOMXL3-IND-135يمكن استبداله بعلامة تجارية أخرى / لتعرية الخلايا الحبيبية
Cryotop نظام مفتوحKIZTAZATO81111يمكن استبداله بعلامة تجارية أخرى / لطقم
تزجيج الأجنة  KITAZATO BioPharmaVT101يمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لتزجيج الأجنة
VortexerQilinbeierDNYS8مزيج عينة
VS (طقم التزجيج)  ؛ كيتازاتو بيوفارماكاشف فيطقم التزجيجيمكن استبدال هذا بعلامة تجارية أخرى / لتزجيج الأجنة
ZILOS-tk نظام الليزرهاميلتون ثورنالفئة 1يمكن استبداله بعلامة تجارية أخرى / لانهيار الأريمة الاصطناعية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationshi....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

الوسوم

مقالات ذات صلة