مقالة منهجية

طريقة فعالة لتوجيه الخلايا الكبدية مثل التعريفي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

DOI:

10.3791/62654

⸱

مايو 6, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى خلايا وظيفية تشبه خلايا الكبد (HLCs) من خلال استكمال أكتيفين A وCHIR99021 باستمرار أثناء التمايز hESC إلى بطانة الرحم النهائية (DE).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الوظائف المحتملة للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية (HLCs) المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تبشر بالكثير لنمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية. 10- إن هذه الطريقة هي طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتمايز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى مركبات سداسية الهكربون الوظيفية. ويعتبر إنشاء سلالة من الاندوديرم خطوة رئيسية في التمايز بين المراكز العليا. من خلال طريقتنا، ونحن تنظيم مسارات الإشارات الرئيسية من خلال استكمال مستمر أكتيفين A وCHIR99021 خلال التمايز hESC إلى endoderm نهائي (DE)، تليها جيل من خلايا السلف الكبدي، وأخيرا HLCs مع مورفولوجيا خلايا الكبد نموذجية في طريقة حكمية مع الكواشف محددة تماما. وHESC المشتقة من HLCs التي تنتجها هذه الطريقة التعبير عن علامات مرحلة محددة (بما في ذلك الألبومين، مستقبلات HNF4α النووية، وتوروشولات الصوديوم cotransporting polypeptide (NTCP))، وتظهر خصائص خاصة تتعلق خلايا الكبد ناضجة والوظيفية (بما في ذلك تلطيخ الأخضر إيندوكيانين، تخزين الجليكوجين، تلطيخ hematoxylin-eosin والنشاط CYP3)، ويمكن أن توفر منصة لتطوير التطبيقات القائمة على HLC في دراسة أمراض الكبد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكبد هو جهاز الأيضية للغاية التي تلعب عدة أدوار, بما في ذلك السمية, تخزين الجليكوجين, وإفراز وتوليف البروتينات1. مسببات الأمراض المختلفة والأدوية والوراثة يمكن أن يسبب تغيرات مرضية في الكبد وتؤثر على وظائفه2،3. تلعب خلايا الكبد ، باعتبارها الوحدة الوظيفية الرئيسية للكبد ، دورا مهما في أنظمة دعم الكبد الاصطناعي والقضاء على سمية الدواء. ومع ذلك ، فإن مورد خلايا الكبد البشرية الأولية محدود في العلاج القائم على الخلايا ، وكذلك في أبحاث أمراض الكبد. لذلك ، فإن تطوير مصادر جديدة للخلايا الكبدية البشرية الوظيفية هو اتجاه بحثي مهم في مجال الطب التجديدي. منذ عام 1998 عندما تم إنشاء hESCs

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. صيانة الخلايا الجذعية

ملاحظة: بروتوكول صيانة الخلية الموضحة أدناه ينطبق على خط الخلية hES03 الاحتفاظ بها في أحادية تابعة. بالنسبة لجميع البروتوكولات التالية في هذه المخطوطة، يجب التعامل مع الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.

  1. إعداد 1x mTesR الخلايا الجذعية ثقافة المتوسطة عن طريق تخفيف 5x المتوسطة التكميلية إلى mTesR المتوسطة الأساسية.
  2. إعداد 30x hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة عن طريق تمييع 5 مل من ماتريجل hESC المؤهلين مع 5 مل من DMEM/F12 على الجليد. يخزن عند -20 درجة مئوية.
  3. إعداد 1x hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة عن طريق تخفيف 33.3 ميكروغرام من 30x hESC المؤهلين Matrigel مع 1 مل من DMEM/F12.
  4. معط....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرسم التخطيطي لحث HLC من hESCs والصور التمثيلية ذات المجال الساطع لكل مرحلة تمايز تظهر في الشكل 1. في المرحلة الأولى، تمت إضافة أكتيفين A وCHIR99021 لمدة 3 أيام لحث الخلايا الجذعية على تشكيل خلايا إندوديرم. في المرحلة الثانية ، تمايزت خلايا بطانة الرحم إلى خلايا سلف كبدية بعد علاجها بوسط تمايز لمدة 5 أيام. في المرحلة الثالثة، نضجت خلايا الكبد المبكرة وتباينت في HLCs بعد 10 أيام في HGF وOSM(الشكل 1A). في المرحلة النهائية من التمايز، أظهرت الخلايا النمط الظاهري ا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم طريقة تدريجية تحفز HLCs من hESCs على ثلاث مراحل. وفي المرحلة الأولى، استخدمت أكتيفين ألف وCHIR99021 لتمييز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى DE. وفي المرحلة الثانية، استخدمت الخلايا السلفية KO-DMEM وDMSO لتمييز DE إلى خلايا سلف كبدية. وفي المرحلة الثالثة، استخدمت HZM بالإضافة إلى HGF وOSM وهيدروكورتيزون 21-hemisuccinate ملح الصوديوم لمواصلة التمييز بين خلايا السلف الكبدي إلى HLCs.

10- وينبغي أخذ الخطوات الحاسمة التالية في الاعتبار عند استخدام البروتوكول. كثافة التمايز الأولي للخلايا و.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81870432 81570567 إلى شركة X.L.Z. (رقم 81571994 إلى شركة P.N.S.)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة غوانغدونغ، الصين (رقم 2020A1515010054 إلى P.N.S.)، مؤسسة جامعة لي كا شينغ شانتو (رقم L1111 2008 إلى P.N.S.). نود أن نشكر البروفيسور ستانلي لين من كلية الطب بجامعة شانتو على المشورة المفيدة.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-MercaptoethanolSigmaM7522لتمايز السلف الكبدي
488 المسمى الماعز ضد الفأر IgGZSGB-BIOZF-0512بالنسبة ل IF ، الجسم المضاد الثاني
488 المسمى الماعز ضد الأرنب IgGZSGB-BIOZF-0516ل IF ، تقنيات الخلايا الجذعية للجسم المضاد الثاني
Accutase7920لمرور الخلية
Activin ApeproTech120-14Eلتكوين الأديم الباطن النهائي
مضاد للألبومين (ALB)Sigma-AldrichA6684ل IF و WB ، الجسم المضاد الأساسي
المضاد للإنسان Oct4AbcamAb19587ل IF ، الجسم المضاد الأساسي
المضاد للبروتين الجنيني (AFP)Sigma-AldrichA8452ل IF و WB ، الجسم المضاد الأساسي
Anti -SOX17Abcamab224637بالنسبة ل IF ، الجسم المضاد الأساسي
المضاد للخلايا الكبدية العامل النووي 4 ألفا (HNF4 α)Sigma-AldrichSAB1412164ل IF ، ملحق الجسم المضاد
الأساسي B-27Gibco17504-044لتكوين الأديم الباطن النهائي
BSABeyotimeST023-200gلحجب الخلايا
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046لتكوين الأديم الباطن النهائي
DAPIBeyotimeC1006للتلوين النووي
DEPC-waterBeyotimeR0021لحل الحمض النووي الريبي
DM3189MCEHY-12071لتكوين الأديم الباطن
النهائي DMEM / F12Gibco11320-033لزراعة الخلايا
DMSOSigma-AldrichD5879لتمايز السلف الكبدي
DPBSGibco14190-144لزراعة الخلايا
GlutaMAXGibco35050-061لتمايز السلف الكبدي
H& طقم تلطيخ EBeyotimeC0105Sلليد & E تلطيخ
عامل نمو خلايا الكبد (HGF)peproTech100-39لتمايز خلايا الكبد
HepatoZYME-SFM (HZM)جيبكو17705-021لتمايز خلايا الكبد
هيدروكورتيزون -21-هيميسوكسيناتسيجما ألدريتشH4881لتمايز خلايا الكبد
إندوسيانينسانجون للتكنولوجيا الحيويةA606326لتلوين الإندوسيانين
Knock Out DMEMGibco10829-018لتمايز السلف الكبدي
Knock Out SR متعدد الأنواعGibcoA31815-02لتمايز السلف الكبدي
Matrigel hESCالمؤهل 354277Corning لزراعة الخلايا
MEM NeAAGibco11140-050لتمايز السلف الكبدي
mTesR 5X تقنياتالخلايا الجذعية85852لزراعة الخلايا
mTesR تقنياتالخلايا الجذعية85851لزراعة الخلايا
Oncostatin (OSM)peproTech300-10لتمايز خلايا الكبد
P450 - CYP3A4 (لوسيفيرين - PFBE)PromegaV8901لنشاط CYP450
طقم تلطيخ PASSolarbioG1281لتلطيخ PAS
القلم / البكتيريا العقديةGibco15140-122لتمايز الخلايا
الماعز المترافق بيروكسيداز المضاد للفأر IgGZSGB-BIOZB-2305ل WB ، الجسم المضاد
الثاني المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة الأولية ل   ؛ Western BlotBeyotimeP0256لتخفيف الأجسام المضادة الأولية
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101لتخليق (كدنا
RNAiso PlusTaKaRa9109لعزل الحمض النووي الريبي
RPMI 1640Gibco11875093لتكوين الأديم الباطن النهائي
سانجونللتكنولوجيا الحيويةA600669لإعداد الأجسام المضادة الثانية
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742لتحليل RT-PCR
Torin2MCEHY-13002لتشكيل الأديم الباطن النهائي
TweenSigma-AldrichWXBB7485Vلتحضير العازلة للغسيل
التكميلية القاعدية المتوسطة ) حليب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Hepatocyte Like CellsHuman Embryonic Stem CellsDirected DifferentiationDefinitive EndodermHepatic Progenitor CellsActivin ACHIR99021Stagewise DifferentiationCYP3A4 ActivityDisease Modeling

مقالات ذات صلة