نقدم بروتوكولا لاستخدام المجهري بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة التوزيع المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية في العين بشكل غير جراحي بعد الحقن تحت الملتحمة.
مقالة منهجية
نقدم بروتوكولا لاستخدام المجهري بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة التوزيع المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية في العين بشكل غير جراحي بعد الحقن تحت الملتحمة.
الحقن تحت الملتحمة هو طريق جذاب لإدارة أدوية العين بسبب سهولة الوصول عبر الصلبة التي تتجاوز حواجز العين الأمامية ، مثل القرنية والملتحمة. في حين تم وصف الآثار العلاجية والحركية الدوائية للأدوية عند الحقن تحت الملتحمة في بعض الدراسات ، فإن عددا قليلا جدا منها يقيم التوزيع العيني للأدوية أو أنظمة توصيل الدواء (DDS). هذا الأخير أمر بالغ الأهمية لتحسين تصميم DDS داخل العين والتوافر البيولوجي للأدوية لتحقيق التوطين العيني المطلوب ومدة العمل (على سبيل المثال ، الحادة مقابل الطويلة). تثبت هذه الدراسة استخدام المجهر بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة نوعية للتوزيع العيني للجسيمات الشحمية الفلورية في الوقت الفعلي في الفئران الحية بعد الحقن تحت الملتحمة. كونها مصممة للفحص البصري في الجسم الحي للأنسجة على المستوى المجهري ، وهذا هو أيضا أول وصف كامل لطريقة التصوير CLM لدراسة التوزيع المكاني والزماني للحقن في العين بعد الحقن تحت الملتحمة.
إن إزالة الدم وتوزيع الأنسجة والإشغال المستهدف للعقاقير في الأنظمة الحية هي ركائز لفهم التصرف في الأدوية في الجسم الحي. في النماذج الحيوانية قبل السريرية ، يتم تقييم هذه المعلمات عادة عن طريق أخذ عينات الدم والأنسجة بشكل متكرر في نقاط زمنية معينة بعد إعطاء الدواء. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات غازية بشكل عام ، وغالبا ما تتضمن قياسات عدم البقاء على قيد الحياة ، وتتطلب مجموعات كبيرة من الحيوانات للتشغيل الإحصائي. قد تكون هناك تكلفة إضافية ووقت متكبد ، إلى جانب المخاوف الأخلاقية للاستخدام المفرط للحيوانات. ونتيجة لذلك ، أصبح التصوير غير الجراحي بسرعة خطوة أساسية في دراسات التوزيعات الحيوية. يعد التنظير المجهري بالليزر البؤري (CLM1,2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في SingHealth (سنغافورة). تم الحصول على إناث الفئران C57BL/6 J (6-8 أسابيع ؛ 18-20 جم) من InVivos ، سنغافورة ، وتم وضعها في درجة حرارة و vivarium التي يتم التحكم فيها بالضوء في كلية الطب Duke-NUS ، سنغافورة. تم التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.
ملاحظة: يظهر في الشكل 2 مخطط انسيابي يسلط الضوء على الإجراءات الرئيسية.
1. إعداد عوامل التباين: إيفانز الأزرق (EB) والجسيمات الشحمية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يوضح البروتوكول فائدة CLM لتقييم التوزيع العيني المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء التي تدار عن طريق الحقن تحت الملتحمة. للاستفادة من القدرة المزدوجة اللون (488 نانومتر و 660 نانومتر من الأطوال الموجية للإثارة) لنظام CLM ، تم تخدير الجسيمات الشحمية POPC المحايدة التي سيتم حقنها ب 5٪ Fl-DHPE (تظهر بيانات التركيب والتوصيف في الشكل 1B) ، وتم حقن EB IV لتحديد المعالم في العين. إن وجود طبقة رقيقة من episclera والملتحمة ، وكلاهما ذو أوعية دموية عالية ، يسمح لمنطقة الصلبة بأن تكون ملط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
كما هو موضح من النتائج ، يوفر CLM طريقة بسيطة ومجدية لتصوير التوزيع العيني للجسيمات الشحمية في العين. لقد أظهرنا سابقا استخدام CLM لتوصيف توطين التركيبات الشحمية المختلفة داخل عين الفأر بمرور الوقت1. بالنسبة للتطبيقات غير الغازية ، يسمح CLM بالتصوير في الوقت الفعلي لسطح العين الأمامي للحصول على رؤى حول كيفية توزيع الجسيمات الشحمية في العين من نفس الحيوان. وهذا يجعل CLM مناسبا للفحص المسبق لناقل النانو / DDS قبل إجراء تحديد كمي أكثر شمولا. بالنظر إلى الخصائص الفيزيائية الكيميائية الفريدة ل DDS المت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
تم تمويل هذا البحث من قبل منحة NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) الممنوحة (إلى SV) وجزئيا من قبل منحة مؤسسة سنغافورة الوطنية للبحوث AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 ومنحة صندوق محاذاة الصناعة للصحة والعلوم الطبية الحيوية (HBMS) في سنغافورة H18/01/a0/018 التي تديرها وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A*STAR) (إلى AMC). شكرا لأعضاء من مختبر Duke-NUS للتصوير الانتقالي والجزيئي (LTMI) لتسهيل الخدمات اللوجستية وتنفيذ الدراسات والتدريب على المعدات. شكر خاص للسيدة ويسنا نوفيرا على مساعدتها التحريرية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.08 وميكرو ؛ م فلتر البولي واتمان | ، الولايات المتحدة الأمريكية | 110604 | |
| 0.22 & مرشح حقنة m | فيشربراند ، أيرلندا | 09-720-3 | |
| 0.5٪ محلول بصري معقم بروكسي ميتاكائين هيدروكلوريد | ألكون ، سنغافورة | ||
| 10 & مايكرو ؛ L حقنة زجاجية | هاميلتون ، الولايات المتحدة الأمريكية | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | أفانتي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 850457 | |
| إبرة 32 جم (هاميلتون ، 0.5 " PT4) | هاميلتون ، الولايات المتحدة الأمريكية | 7803-04 | |
| وحدة تحكم في درجة حرارة مع لوحة تسخين (15 سم × 20 سم) | WPI ، USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band و S1500 Probe و Quantikit (مجموعة معايرة في الخطوة 3.5) | Mauna Kea Technologies ، فرنسا | قطر التلميح: 1.5 مم ، مجال الرؤية: 600 & micro ؛ م × 500 وميكرو ؛ م ، الدقة المحورية: 15 ومايكرو ؛ م ، الدقة الجانبية: 3.3 وميكرو ؛ م | |
| كلوروفورم | سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة | الأمريكية 472476 | |
| ملاقط دومون # 5 ، دوموستار | WPI ، الولايات المتحدة الأمريكية | 500233 | 11 سم ، مستقيم ، 0.1 مم × 0.06 مم نصائح |
| إيفانز بلو | سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية | E2129 | |
| قطرة العين حمض الفوسيديك | LEO Pharma ، الدنمارك | ||
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical ، المملكة المتحدة | ||
| الميثانول | Sigma Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti ، الولايات المتحدة الأمريكية | 610020 | |
| N- (فلورسين -5-ثيوكاربامويل) -1،2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (ملح ثلاثي إيثيل أمونيوم) (فلوريدا-DHPE) | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10010023 | |
| نظام المجهر المجسم مع حامل مشبك الطاولة | أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان | SZ51 & SZ2-STU3 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن