Method Article

الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية القشرية لمورين للأنسجة الهندسية الشبيهة بالعصبية

DOI:

10.3791/62691

⸱

July 16th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نحن تقرير طريقة الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الخلايا الفلكية القشرية مورين للأنسجة الحيوية مثل العصبية لدراسة وظائف الخلايا الفلكية في الجهاز العصبي المركزي والآليات التي تنطوي على الخلايا الدبقية في الأمراض العصبية والعلاجات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الفلكية هي خلايا جلبقية لها دور أساسي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك دعم الخلايا العصبية ووظائفها. هذه الخلايا تستجيب أيضا للإصابات العصبية وتعمل على حماية الأنسجة من الأحداث التنكسية. الدراسات المختبرية من وظائف الخلايا الفلكية مهمة لتوضيح الآليات المشاركة في مثل هذه الأحداث والمساهمة في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية. يصف هذا البروتوكول طريقة لتصنيع بنية أنسجة تشبه العصبية غنية بالخلايا الفلكية عن طريق الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية المحملة بالفينك الحيوي. تم استخدام طابعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد تعتمد على البثق في هذا العمل ، وتم استخراج الخلايا الفلكية من قشريات الدماغ C57Bl/6 الفئران. تم إعداد bioink عن طريق خلط الخلايا الفلكية القشرية من ما يصل إلى الممر 3 إلى محلول المواد الحيوية المكون من الجيلاتين والجيلاتين الميثاكريلويل (GelMA) والفيبرينوجين ، المكمل باللامينين ، والذي قدم ظروف الطباعة الحيوية المثلى. قللت ظروف الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد من إجهاد الخلايا ، مما ساهم في البقاء العالي للخلايا الفلكية أثناء العملية ، حيث كان 74.08٪ ± 1.33٪ من الخلايا قابلة للحياة مباشرة بعد الطباعة الحيوية. بعد أسبوع واحد من الحضانة ، زادت صلاحية الخلايا الفلكية بشكل كبير إلى 83.54٪ ± 3.00٪، مما يشير إلى أن البناء ثلاثي الأبعاد يمثل بيئة دقيقة مناسبة لنمو الخلايا. سمح تكوين المادة الحيوية بتعلق الخلية وحفز السلوك الفلكي ، مع الخلايا التي تعبر عن الخلايا الفلكية المحددة علامة البروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) وامتلاك مورفولوجيا فلكية نموذجية. يوفر هذا البروتوكول القابل للاستنساخ طريقة قيمة لتصنيع الأنسجة ثلاثية الأبعاد الشبيهة بالخلايا العصبية الغنية بالخلايا الفلكية التي تشبه البيئة الدقيقة الأصلية للخلايا ، مفيدة للباحثين الذين يهدفون إلى فهم وظائف الخلايا الفلكية وعلاقتها بالآليات المشاركة في الأمراض العصبية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الفلكية هي نوع الخلية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا رئيسيا في التوازن الدماغي. بالإضافة إلى دعم الخلايا العصبية دائمة, الخلايا الفلكية هي المسؤولة عن تحوير امتصاص الناقلات العصبية, الحفاظ على سلامة حاجز الدم في الدماغ, وتنظيم تولد الخلايا العصبية1,2. الخلايا الفلكية أيضا دورا أساسيا في التهاب الجهاز العصبي المركزي, الاستجابة لإصابات الدماغ في عملية تؤدي إلى التفاعل الفلكي أو astrogliosisالتفاعلية 3,4, تشكيل ندبة الدبقية التي تمنع معرض الأنسجة السليمة للعوامل التنكسية5. ينتج عن هذا الحدث تغييرات في....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اتبعت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات المبادئ التوجيهية الدولية لاستخدام الحيوانات في الأبحاث (http://www.iclas.org) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في أبحاث جامعة ساو باولو الاتحادية (CEUA 2019 / 9292090519).

1. الفئران تشريح الدماغ

  1. نقل 10 مل من محلول الملح البارد هانكس المخزنة (HBSS) إلى طبق ثقافة 100 ملم و 1 مل إلى 1.5 مل ميكروب. إعداد واحد الأنابيب الدقيقة لكل.
    ملاحظة: يجب الاحتفاظ بكل من طبق الثقافة والميكروبيوب على الجليد.
  2. إعداد الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة باستخدام DMEM F12 + 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2٪ الجلوتامين، و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين (P/S). قم بتعقيم الوسط عن طريق التصفية باستخدام فلتر 0.2 ميكرومت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا العمل إلى تطوير نسيج يشبه العصبية باستخدام تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لإيداع الجيلاتين /GelMA/fibrinogen bioink الأولي المشحون بالخلايا الفلكية طبقة بطبقة. تم استخراج الخلايا الفلكية وعزلها عن قشرة الدماغ من جراء الفئران (الشكل 1) ، إضافة إلى تكوين المواد الحيوية ، مما يسمح با الصنع الحيوي لبناء 3D حية.

تم تطوير التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) باستخدام G-code(ملف تكميلي)ك إطار مترابط من الشكل المربع (0.6 × 0.6 مم) ، مع مسام 1 مم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كبديل ل الصنع الحيوي يسمح بهندسة البنى المكررة التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا الأنسجة الأصلية22، بما في ذلك الدماغ23. يسمح التصنيع الحيوي للأنسجة الشبيهة بالعصبية بنمذجة البيئة الدقيقة الأصلية في المختبر ، كونها أداة مهمة لفهم الآليات الخلوية والجزيئية المرتبطة بتطوير وعلاج العديد من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي11. نظرا للدور الهام للخلايا الدبقية في الوظائف العصبية ، تم استخدام الخلايا ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في الكشف عن المعلومات.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للبحوث (FAPESP)، وأرقام المنح 2018/23039-3 و2018/12605-8؛ المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية ،أرقام المنح 465656/2014-5 و 309679/2018-4 وتنسيق تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES)، القانون المالي 001.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3D Bioprinter3D حلولالحيوية الطابعة الحيوية القائمة على البثق
ملقط حاد الطرفIntegra Miltex6-30ملقط لتشريح الدماغ معقم سابقا
ألبومين مصل الأبقارSigma-Aldrich9048-46-8خالي من البروتياز وخالي من الأحماض الدهنية وخالي من الجلوبيولين
CaCl2< / sub>Sigma-Aldrich10043-52-4
قارورة زراعة الخلايافيشر ساينتفيك156340قارورة ثقافة T25
مصفاة خليةكورنينج إنكوربوريتد352340مصفاة خلية 40 وميكرو ؛ م
المجهر متحد البؤرLeicaConfocal TCS SP8 المجهر إلى جانب نظام Olympus FluoView 300
متحد البؤر الأنابيب المخروطية339651 العلمي الحراري, 339652أنابيب معقمة من 15 مل و 50 مل
DAPIAbcamab224589DAPI محلول تلطيخ
DMEM / F12Gibco; شركة Life TechnologiesCorporation 12500062DMEM / F-12 50/50 ، 1X (Dulbecco's Mod. من Eagle's Medium / Ham's F12 50/50 Mix) مع أنابيب L-glutamine
DyalisisSigma-AldrichD9527قطع الوزن الجزيئي = 14 كيلو دالتون
الإيثانولفيشر العلمي64-15-5كاشف الصف
مصل الأبقار الجنينيجيبكو ؛ شركة Life TechnologiesCorporation 12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5مسحوق Fibrinogen cristalline من البلازما البقرية
الجيلاتينSigma-Aldrich9000-70-8مسحوق الجيلاتين من جلد الخنازير
GlycineSigma-Aldrich56-40-6مسحوق الجلايسين
محلول الملح المخزن هانكس (HBSS)Gibco ؛ شركة Life TechnologiesCorporation 14175095خال من الكالسيوم والمغنيسيوم ولا الفينول الأحمر
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine مسحوق بلوري
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg / mL L في 50 ملي Tris-HCl
طقم تصوير الخلايا الميتةالحية Thermo ScientificR37601التألق الأخضر في الخلايا الحية (ex / em 488 نانومتر / 515 نانومتر). التألق الأحمر في الخلايا الميتة (على سبيل المثال / EM 570 نانومتر / 602 نانومتر)
أنهيدريد الميثاكريليكسيجما-ألدريتش760-93-0لتحضير GelMA
الأنابيب الدقيقةCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes من 1,5 مل
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
إبرة 22Gفيشر ScientificNC1362045إبرة حادة معقمة
تعمل مقصIntegra Miltex05-02مقص حاد لتشريح الدماغ معقم سابقا
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4مسحوق Paraformaldehyde
Penicillin / StreptomycinGibco ؛ شركة Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 وحدة / مل بنسلين ؛ 5,000 ميكروغرام / مل ستربتومايسين)
طبق بتريCorningIncorporated 430591 ، 430588أطباق بتري معقمة من 35 و 100 مم
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 كاشف
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4 & prime ;-(2-hydroxyethoxy) -2- ميثيل بروبيوفينون
محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS)جيبكو ؛ شركة Life TechnologiesCorporation 10010023PBS 1 x ، درجة الثقافة ، بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيوم
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30،000-70،000
Primary antobodyAbcamab4674دجاج متعدد النسيلة إلى GFAP
الجسم المضاد الثانويAbcamab150176Alexa fluor 594 ملعقة مضادة للدجاج
MiltexV973-70رقم 24 ملعقة أسمنتية معقمة سابقا
مجهر مجسمفيشربراند3000038مجهر لتشريح الدماغ
حقنة 5 ملBD1222C84معقمة
فلتر حقنة 2 & مفيشر Scientific09-740-105مرشح البولي بروبلين للتعقيم
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4مسحوق الثرومبين كريستالين من بلازما البقر
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1درجة المختبر
Trypsin-EDTAGibco ؛ شركة Life TechnologiesCorporation 15400054Trypsin no phenol red 1 x مخفف في حل PBS
VerseneGibco ؛ شركة Life Technologies Corporation15040066Versene Solution (0.48 ملم) تمت صياغته على شكل 0.2 جم EDTA (Na4) لكل لتر من
لوحة PBSWell Thermo Scientific144530Stereole 24 بئرا
التكنولوجيا حقنة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114(2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D BioprintingCortical AstrocytesNeural Tissue EngineeringAstrocyte BioinkExtrusion BioprintingGlial Fibrillary Acidic ProteinBiomaterial ScaffoldCell Viability AssayImmunofluorescence MicroscopyAstrocytic Morphology

Related Articles