مقالة منهجية

الدماغ بيريسيت الكالسيوم والتصوير الدموي في الفئران المعدلة وراثيا في فيفو

4.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62725

⸱

نوفمبر 20, 2021

 ,  ,  , 
1College of Pharmacy, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول خطوات للحصول على صور الكالسيوم الفلورية وتحليلها من بيريسيتات الورث الدماغي وبيانات تدفق الدم من الأوعية الدموية القريبة في الفئران المخدرة. هذه التقنيات مفيدة لدراسات فسيولوجيا الخلايا الجدارية ويمكن تكييفها للتحقيق في عابري الكالسيوم في أي نوع من الخلايا.

الملخص

وقد جعلت التطورات الأخيرة في بيولوجيا البروتين وعلم الوراثة الماوس من الممكن لقياس تقلبات الكالسيوم داخل الخلايا من خلايا الدماغ في الجسم الحي وربط هذا مع الديناميكا الدموية المحلية. يستخدم هذا البروتوكول الفئران المعدلة وراثيا التي تم إعدادها مع نافذة الجمجمة المزمنة والتعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا، RCaMP1.07، تحت α الملساء العضلات actin المروج لتسمية الخلايا الجدارية على وجه التحديد، مثل خلايا العضلات الملساء الأوعية الدموية وingsheathing pericytes. وترد خطوات حول كيفية إعداد قسطرة الوريد الذيل للحقن الوريدي من الأصباغ الفلورية لتتبع تدفق الدم، فضلا عن كيفية قياس الكالسيوم بيريسيت الدماغ والديناميكا الدموية الأوعية الدموية المحلية (القطر، وسرعة خلايا الدم الحمراء، وما إلى ذلك) من قبل اثنين من المجهر الفوتون في الجسم الحي من خلال النافذة القحفية في الفئران مخدر الكيتامين / xylazine. وأخيرا، يتم توفير تفاصيل لتحليل تقلبات الكالسيوم وأفلام تدفق الدم عبر خوارزميات معالجة الصور التي وضعها باريت وآخرون 2018، مع التركيز على كيفية تكييف هذه العمليات مع بيانات التصوير الخلوي الأخرى.

المقدمة

الجهاز العصبي المركزي الأوعية الدموية يتكون من اختراق الشرايين، الشعيرات الدموية، والفينولا الصاعدة. داخل هذه الشبكة، تقوم الخلايا الجدارية مثل خلايا العضلات الملساء الوعائية بتغليف الشرايين والبيريسيات بتوسيع العمليات الخلوية على طول فروع الشرايين الأولى والشعيرات الدموية1. بيريسيتس ويبدو أن لها عدة أدوار داخل الدماغ بما في ذلك الحفاظ على الدم الدماغ حاجز1,2,الهجرة والحركة3, خصائص الخلايا الجذعية المحتملة, وتنظيم تدفق الدم في الدماغ4,5,6. وقد تم ربط العديد من الأدوار الوظيفية للبيريسيت إلى تقلبات في الكالسيوم داخل الخلايا التي قد تنظم تمدد أو انكماش هذه الخلايا4,5,6.

وقد وضعت العديد من الدراسات الحديثة معايير لتحديد أنواع مختلفة من pericytes الدماغ7,8. الخلايا الجدارية داخل الفروع 4 الأولى من اختراق الشرايين هي ensheathing pericytes على أساس تعبيرهم عن البروتين الانكماشي α السلس العضلات أكتين (αSMA) وتبرز بهم, سوماتا ovoid مع العمليات التي تلتف حول الأوعية7,8,9. لتصور تقلبات الكالسيوم في البيريسيت ensheathing، يستخدم هذا البروتوكول خط الماوس المعدلة وراثيا رواية، Acta2-RCaMP1.07، المعروف أيضا باسم TG(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. هذه الفئران تعبر عن مؤشر الكالسيوم الأحمر المشفرة وراثيا، RCaMP1.07، في αSMA التعبير عن الخلايا (خلايا العضلات الملساء الأوعية الدموية وpercytes ensheathing). يتم الحفاظ على مستعمرات التربية عن طريق عبور الحيوانات غير الحاملة مع الهيميزيغات. RCaMP1.07 هو بروتين فلوري أحمر مع مجال ربط كالمودولين ، مما يزيد من الفلورسنت عند ربط الكالسيوم داخل الخلايا10،11. يحدد هذا البروتوكول خطوات التصوير بالكالسيوم المشترك لمخلفات البيريسيت وقياسات تدفق الدم من خلال مجهرين فوتونين بما في ذلك إجراءات حقن الوريد الذيل للأصباغ الفلورية ، واكتساب صورة المجهر في الفئران المخدرة ، وتحليل البيانات مع منصات البرمجة(الشكل 1). هذه التقنيات مفيدة لمعالجة الأسئلة حول فسيولوجيا الخلايا الجدارية ولكن يمكن تكييفها لدراسة عابري الكالسيوم في أي نوع من الخلايا في الدماغ أو نظام الأعضاء الأخرى.

تم استخدام فأرة Acta2-RCaMP1.07 البالغة من العمر 10 أشهر للتجربة المعروضة في هذه المقالة. خضع الفأر لعملية جراحية لنافذة الجمجمة المزمنة وزرع الرأس بعد شهرين. تفاصيل البروتوكول الجراحي تناقش في الدراسات السابقة12و13 وتم تنفيذ إجراءات مماثلة في بروتوكولات أخرى نشرت سابقا14و15. تم تسمية الأوعية الدموية بالفلورسين الأخضر -Dextran (70،000 ميجاوات ، محلول أنيوني ، 2.5٪ ث / v) تم حقنه عن طريق الوريد. هذه الصبغة فعالة من حيث التكلفة ومتاحة بسهولة من المصادر التجارية ، ولكن لديها طيف انبعاثات أوسع قد تتداخل مع انبعاثات RCaMP وتنزف خلال اكتساب صورة المجهر. وترد الخطوات اللازمة للتمثيل الطيفي في القسم 4 أدناه للتحايل على ذلك، ولكن يمكن أيضا استخدام الأصباغ الخضراء الأخرى ذات أطياف الانبعاثات الأضيق، مثل تلك القائمة على EGFP.

البروتوكول

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان التابعة لجامعة مانيتوبا، التي يحكمها المجلس الكندي لرعاية الحيوانات، على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات التجريبية المبينة أدناه.

1. إعداد الإجراء وإعداده

ملاحظة: العناصر التالية مطلوبة لحقن قسطرة الوريد الذيل: حقن الأنسولين، قطعة 15 سم من أنابيب PE10، إبر 30 G، شاش، ملحي، ملقط، صبغة الفلورسين الخضراء ديكتران، كماشة، ومقص. أيضا، لديك إبرة جاهزة مع الكيتامين / التخدير xylazine التي سيتم حقنها قبل جلسة التصوير.

حرجة: يجب تعقيم جميع المواد والمعدات في الخطوتين 1 و 2 قبل الاستخدام عن طريق الالاستعباد التلقائي أو الشطف بالإيثانول بنسبة 70٪. إذا كان لا يمكن تعقيم كماشة بشكل صحيح، ينصح باستخدام زوج من أصحاب إبرة كبيرة. يجب أن يتم تجميع القسطرة مع كماشة وملقط لتجنب ثقوب إبرة عرضية.

  1. قطع ما يقرب من 15-20 سم من أنابيب البولي ايثيلين، PE10 (I.D. 28 ملم؛ O.D. 61 ملم).
  2. ملء حقنة الأنسولين 27 G مع 0.9٪ المالحة والدانتيل إبرة من الحقنة في غيض من أنبوب البولي ايثيلين. دفع المالحة من خلال الأنبوب، والتأكد من عدم وجود تسرب.
  3. باستخدام كماشة، ثني إبرة 30 G (0.3 مم × 25 ملم) ذهابا وإيابا حتى ينفصل عن المحور. يجب أن تكون الإبرة نظيفة بدون انحناءات.
  4. عقد الإبرة مع ملقط، أدخل بعناية الإبرة في نهاية أنابيب PE10 التي تعلق على حقنة مملوءة المالحة وإزالة فقاعات الهواء. هذا هو القسطرة للحقن.
  5. فلتر 30 ميكرولتر من 2.5٪ (ث / v) الفلورسين dextran من خلال مرشح 13-25 ميكرومتر قبل الحقن.
  6. ملء حقنة الأنسولين آخر مع aliquot 30 ميكرولتر من dextran وتأكد من عدم وجود فقاعات في حقنة مملوءة.

2. حقن الوريد الذيل

  1. تخدير الماوس مع ايزوفلوران (4٪ التعريفي، 1.5٪ الصيانة) أو الكيتامين / xylazine (60 ملغ / كجم؛ 10 ملغ / كغ؛ أي p.) وتطبيق هلام زيوت التشحيم العين. يوصى بالكيتامين /الإكسيلازين لقياسات تدفق الدم الأكثر استقرارا أثناء التصوير ويمكن زيادة الجرعة إلى 90 ملغم /كجم؛ 10 ملغم/كغ كيتامين/إكسيلازين لجلسات تصوير أطول.
  2. عندما يكون الفأر في الطائرة الجراحية للتخدير، ضع قفازا مملوءا بالماء الدافئ على الذيل لتوسيع الوريد الجانبي.
  3. إزالة القفاز بعد 30 ق وتنظيف الذيل مع الإيثانول.
  4. ضع الذيل بين الإبهام والإصبع الأوسط. توفير الضغط مع السبابة على الذيل لتوسيع الوريد. من ناحية أخرى، التقط إبرة القسطرة مع ملقط توجيه الإطار صعودا نحو السقف.
  5. بعد تنظيف الذيل مع الإيثانول 70٪ ، بسلاسة ، أدخل الإبرة في الوريد بزاوية 0 درجة وحقن المالحة بلطف من خلال القسطرة لضمان وضع الإبرة بشكل صحيح.
    ملاحظة: إذا لم يكن هناك مقاومة على المكبس ولا تورم في الذيل ، فإن الإبرة في الوريد. إذا كان هناك مقاومة كبيرة أو تورم، يجب إزالة الإبرة. يمكن تكرار الخطوات 2.2-2.5 حتى 3 مرات على كل جانب من الذيل، واستبدال إبرة 30G في نهاية القسطرة كل تجربة ثانية حتى يكون الموضع صحيحا.
  6. بمجرد أن تكون الإبرة في الوريد، قم بتبديل المحاقن المالحة في نهاية القسطرة مع الحقنة التي تحتوي على الفلورسين ديكتران (الخطوة 1.6). حقن ببطء الدكستران في أنابيب القسطرة، وضمان عدم وجود فقاعات دخول الأنبوب. إذا كانت فقاعة الهواء واضحة، اقطع الأنابيب التي تحتوي على الفقاعة لإزالتها وإعادة ربط الحقنة.
  7. عندما يتم حقن جميع الدكستران (30 ميكرولتر aliquot) ، قم بإزالة الحقنة ، واستبدالها بحقنة ملحية. حقن dextran المتبقية من الأنابيب في الماوس حتى يتم ترك أي صبغة في الأنبوب.
  8. إزالة الإبرة من الذيل وتوفير الضغط مع الشاش لمدة 10-30 ق حتى يتوقف النزيف.
    حرجة: إذا بعد 6 محاولات حقن الوريد الذيل ليست ناجحة, يجب أن يكون الحيوان صورة في جلسة أخرى. أيضا، يجب أن لا يتجاوز إجمالي حجم (المالحة و dextran) حقن في الماوس 100 ميكرولتر.

3. اثنين من المجهر فوتون

  1. التركيز على النافذة القحفية
    ملاحظة: استخدام الكيتامين / التخدير xylazine أثناء الحصول على البيانات لأنه أقل آثار الأوعية الدموية (توسع الأوعية) من isoflurane. إذا كان استخدام ايزوفلوران في الخطوات المذكورة أعلاه، حقن الماوس مع الكيتامين / xylazine i.p. (الجرعة الموصى بها المذكورة أعلاه) قبل التصوير.
    1. إصلاح الماوس مع المسمار من خلال رأسها وظيفة لمنصة مع وسادة التدفئة تحت المجهر.
    2. تطبيق مواد تشحيم العين على عيون الماوس.
    3. تنظيف نافذة الجمجمة مع قضيب الأسنان رطبة. تأكد من عدم وجود جزيئات متبقية يمكن أن تتداخل مع عملية التصوير.
    4. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على النافذة.
    5. التركيز من خلال هدف المجهر اثنين فوتون حتى يمكن رؤية الأوعية الدموية الظنس تحت النافذة.
    6. تحقق من تنفس الماوس وتأكد من أن لوحة التدفئة توفر دعما كافيا لدرجة الحرارة.
  2. الحصول على الصورة
    ملاحظة: يحتوي المجهر ذو الفوتونين المستخدم في هذه التجربة على ليزر Ti-Sapphire غير قادر على الإثارة الفلورية باستخدام خلية بوكيل التي تتحكم في كمية الليزر التي تصل إلى العينة. يتم تقسيم الضوء المنبعث بواسطة 565 تمريرة طويلة dichroic إلى اثنين من أنابيب غاسب فوتوموليتيلير (PMTs) مع 595/50 مرشح تمرير الفرقة (الأحمر) و525/70 مرشح تمرير الفرقة (الأخضر) للكشف.
    يتم تنفيذ الإجراءات الموضحة في الخطوات 3.2 إلى 3.4 باستخدام برنامج محدد من المجهر ثنائي فوتون من هذا البروتوكول (انظر جدول المواد). ويمكن تكييف هذه الخطوات مع برامج ومعدات المجهر الأخرى.
    1. مع أضواء الغرفة قبالة، تعيين الطول الموجي المطلوب في برنامج المجهر إلى 990 نانومتر لإثارة كل من RCaMP وفلوريسجين دكستران عن طريق النقر على مربع ليزر 2-P.
    2. تعيين قوة الليزر عن طريق النقر على السلطة / كسب مربع /الليزر المقطع وضبط الجهد خلية بوكلز 1 في 30٪ أو قيمة 300 على مقياس من 1000. تم تحديد طاقة الليزر التي تصل إلى العينة في هذا الإعداد مسبقا لتكون ~ 30 كيلوواط.
    3. تعيين حساسية كاشف PMT بالنقر فوق مربع الطاقة / كسب /PMTs المقطع وضبط القيمة إلى 700-800.
      ملاحظة: يمكن ضبط هذه القيم بالنسبة لشدة عينة الفلورسنت ويجب تعيينها إلى الصفر قبل تشغيل الأضواء في الغرفة.
    4. انتقل إلى قسم دقة الصورة وانقر على دقة 512 × 512 للحصول على حجم صورة أكبر.
    5. انقر على ليزر 2-P/فتح لفتح مصراع ليزر 2-P.
    6. انتقل إلى قسم المسح الضوئي وانقر على زر المسح الضوئي المباشر.
      ملاحظة: يمكن رؤية المسح الحي مع هذه المعلمات ودقة أعلى، والخلايا الجدارية الإيجابية RCaMP وبلازما الدم المسمى فلوريا. إذا كانت الإشارة ضعيفة، يمكن زيادة قيمة pockel حتى تكون الصورة واضحة.
      حرج: في طبقات الأنسجة السطحية، يجب ألا تتجاوز قوة الليزر 50 ميجاوات، أي حوالي 600 في إعدادات خلايا بوكلز في هذا المثال.
  3. الحصول على كومة عمق من الخلايا الجدارية وشبكة الأوعية الدموية
    ملاحظة: يستحسن الحصول على كومة عمق لتحديد موقع pericytes بشكل صحيح في شبكة الأوعية الدموية. وتقع البيريسيات الإنشياثينج على الفروع الأولى إلى الرابعة من الشريان اختراق7،8،9. يشير برنامج المجهر المستخدمة في هذا البروتوكول إلى مداخن العمق باسم "Z-سلسلة".
    1. تحريك الهدف المجهر في الطائرة X و Y و Z، توطين شريان كبير على سطح الدماغ على أساس وضع العلامات على خلايا العضلات الملساء من RCaMP.
    2. انقر على مربع سلسلة Z.
    3. التركيز في الجزء العلوي من الأنسجة بالقرب من الأوعية الظنسة، تعيين هذا كنقطة الصفر وأعلى المكدس سلسلة Z عن طريق النقر على الحالي Z-سلسلة / بدء الموقف [μm] القسم. انقر على مربع مع أربعة خطوط سوداء وشريط أحمر واحد على الجزء العلوي.
    4. التركيز لأسفل في الأنسجة إلى العمق المطلوب وتعيين هذا الجزء السفلي من المكدس عن طريق النقر على الحالي Z-سلسلة / وقف موقف [μm] القسم. انقر على مربع مع أربعة خطوط سوداء وشريط أحمر واحد في الجزء السفلي.
    5. تعيين سمك كل صورة الطائرة (حجم الخطوة) إلى 1-2 ميكرومتر بكتابة القيمة المطلوبة في المربع أسفل"حجم الخطوة"زر ( زرحجم الخطوة هو المترجمة في Z-سلسلة / الحالي Z-سلسلة المقطع). هذا سيتم تعريف عدد الصور التي يتم الحصول عليها في المكدس.
    6. تعيين قوة الليزر لزيادة أضعافا مضاعفة كما يتحرك المجهر أعمق من خلال المكدس عن طريق النقر على مربع التعويض ليزر / PMT واختيار النسبي (الانحدار الأسي).
    7. اسم الملف، اختار مجلد لحفظه وانقر على بدء سلسلة Z.
    8. بعد الحصول على، افتح سلسلة Z في برنامج معالجة التصوير.
    9. دمج القناتين والصور الملونة ومسح من خلال كومة تبحث عن pericytes والأوعية الدموية ذات الأهمية عن طريق النقر في مربع صورة | | الألوان تقسيم القنوات؛ صورة | | الألوان دمج القنوات.
    10. حدد المناطق ذات الاهتمام (ROIs) التي تحتوي على pericytes وحفظ المواضع للمساعدة في تحديد موقع هذه البقع مرة أخرى في جلسات التصوير المستقبلية.
  4. تي سلسلة الكالسيوم فيلم التصوير اكتساب (الوقت)
    1. باستخدام كومة العمق و ROIs من الأعلى كمرجع، قم بتحريك هدف المجهر في محور X و Y و Z أثناء وضع المسح الحي حتى يتم العثور على بيريسيت من الاهتمام.
    2. لجمع فيلم لأحداث الكالسيوم بيريسيت، زيادة معدل إطار الاستحواذ (>10 إطارات في الثانية) من خلال الانتقال إلى قسم دقة الصورة، والنقر على مربع 128x128.
    3. تعيين مدة التصوير إلى 60 s بالنقر فوق مربع سلسلة T وإدخال الوقت في مربع المدة.
    4. بجانب مربع حفظ المسار، انقر على الزر بثلاث نقاط لتحديث مسار الحفظ باسم ملف فريد.
    5. تكبير بصريا على السفينة لحساب القرار أقل والحصول على رؤية أقرب من pericyte عن طريق ضبط القيمة في التكبير البصري [ماج] المقطع.
    6. الحصول على تي سلسلة من خلال النقر على بدء تي سلسلة.
  5. قياسات الديناميكا الدموية باستخدام الكيموغراف (مسح الخط)
    1. التركيز على السفينة من الفائدة في 512 × 512- بكسل القرار في وضع المسح الحي.
    2. لقياس قطر الأوعية الدموية وسرعة خلايا الدم الحمراء، انقر على مسح الخط لبدء مسح أحادي الأبعاد بالمجهر.
    3. تعيين مدة الفحص (30-60 ثانية) بالمللي ثانية.
    4. رسم خط يقسم السفينة ذات الأهمية ويتحرك بالتوازي على طول السفينة. وهذا سوف يولد kymograph قطر السفينة على اليسار والشرائط من خلايا الدم الحمراء تتحرك من خلال الوعاء على اليمين.
      ملاحظة: يمكن قياس الأوعية الدموية المتعددة بنفس الخط طالما أنها في نفس مستوى التصوير.
    5. اسم الملف وانقر فوق Start Linescan(s) للحصول على البيانات.

4. تحليل الصور

  1. تحليل فيلم الكالسيوم.
    ملاحظة: يحدد هذا البروتوكول خطوات الطيز الطيفي (الشكل 2) وطرقتين مختلفتين لتحليل أحداث البيريسيت للكالسيوم باستخدام مؤشرات الاستثمار اليدوية المختارة يدويا (الشكل 3) واختيار عائد الاستثمار الآلي القائم على النشاط (الشكل 4)16,17. من أجل الكشف عن وتصنيف قمم الإشارة مع تتبع الكالسيوم العادي من كل عائد استثمار ، يتم تصفية البيانات طويلة التمرير وتمرير النطاق مما يساعد على تسهيل البيانات لتقديرات السعة والعرض وكذلك تحديد قمم الأشكال المختلفة: قمم واحدة ، قمم متعددة ، وهضاب (الشكل 3ب). يمكن تحسين معايير هذا التحليل للكشف عن أنواع مختلفة من الإشارات الخلوية الديناميكية. الخطوات أدناه سوف تتطلب استخدام برامج معالجة الصور وبرامج البرمجة مع حزم معالجة الصور التي تحتوي على رموز مختلفة لتحليل أفلام الكالسيوم كما ذكر أعلاه. يرجى الاطلاع على جدول المواد للحصول على قائمة كاملة بالبرامج والحزم المستخدمة في هذا البروتوكول. يمكن استيراد بيانات التصوير من أنواع مختلفة من المجاهر مع هذه الحزم الحفاظ على البيانات الوصفية من الصور.
    ملاحظة: تصف الخطوات 4.1.1-4.1.7 كيفية تحديد ROIs يدويا في برنامج معالجة الصور لاستخدامه لاحقا في طريقة تحليل الكالسيوم اليدوية (الخطوة 4.1.16)
    1. تحميل سلسلة T التصوير الكالسيوم في برنامج معالجة الصور، عن طريق سحب ملف .xml إلى شريط أداة البرمجيات. انقر على المربع موافق.
    2. خذ متوسط المكدس (يتم تسمية متوسط المكدس باسم "إسقاط Z" بواسطة برنامج معالجة الصور). ويمكن القيام بذلك عن طريق النقر على صورة | | المكدسات Z الإسقاط في شريط الأدوات.
    3. قم بعمل صورة ملونة من القناتين كما في الخطوة 3.3.9.
    4. افتح إطار إدارة عائد الاستثمار بالنقر فوق في المربع تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار، أو ببساطة الضغط على الحرف "T" في لوحة المفاتيح.
    5. حدد أداة المضلع بالنقر فوق شكل المضلع على شريط أداة معالجة الصور وحدد الهياكل المحيطة المرئية ، مثل سوما والعمليات.
    6. انقر على الزر إضافة الموجود في إطار مدير عائد الاستثمار لإضافة مؤشرات الاستثمار المحددة في مدير عائد الاستثمار.
    7. إعطاء كل منطقة من مناطق الاهتمام اسما فريدا بالنقر فوق الزر إعادة تسمية وحفظها كمجلد مضغوط التي يمكن تحميلها لاحقا في برنامج البرمجة بالنقر فوق المزيد>> | حفظ.
      ملاحظة: الخطوات 4.1.8-4.1.14 تصف كيفية استيراد سلسلة T الكالسيوم في منصة البرمجة وكيفية عدم استخدام الفلوروفوريس المختلفة التي اكتشفها PMTs المجهر في قنوات مختلفة (الشكل 2).
    8. افتح برنامج البرمجة وتأكد من أن المجلدات الخاصة بحزم معالجة الصور موجودة على المسار (راجع جدول المواد).
    9. استيراد الكالسيوم تي سلسلة في برنامج البرمجة عن طريق استدعاء وظيفة BioFormats في إطار الأمر منصة البرمجة، والذي يفتح تلقائيا إطار تحديد الملف.
    10. حدد ما هو موجود على كل قناة عن طريق إدخال الرقم المطلوب. في هذا المثال البيانات، القناة 1 الإجابة =6 (cellular_signal)، القناة 2 الإجابة =1 (blood_plasma).
    11. رسم البيانات كفيلم داخل برنامج البرمجة لتسهيل التصور عن طريق استدعاء وظيفة المؤامرة.
    12. لإزالة الفلورسينس الأخضر من الفلورسين-ديكتران الذي ينزف إلى قناة RCaMP الحمراء، لا يمكن إلغاء دمج القنوات الموجودة في حزمة معالجة الصور عن طريق استدعاء وظيفة unmix_chs في إطار أمر النظام الأساسي للبرمجة.
    13. حدد منطقة تحتوي فقط على مضان من هذا الفلورفور في القناة 1، مثل RCaMP في هذه الحالة.
    14. حدد منطقة تحتوي فقط على مضان من الفلوروفور 2، مثل الفلورسين في بلازما الدم في هذا المثال.
    15. حدد منطقة خلفية لا تتمتع بفلورسينس من أي من الفلوروفور. وهذا يولد مصفوفة مساهمة الطيفية التي يتم تطبيقها على كل بكسل في كل قناة. ويحسن بشكل كبير توطين إشارة RCaMP التي ستعزز الكشف عن أحداث الكالسيوم في هذه الهياكل.
      ملاحظة: كما ذكر أعلاه، هناك طرق متعددة يمكن تحليل بيانات تصوير الكالسيوم داخل حزم معالجة الصور. تصف الخطوات 4.1.16-4.1.23 طريقة تحليل أحداث التكلس المحيطية باستخدام مؤشرات الاستثمار اليدوية المختارة يدويا.
    16. تشغيل تحليل الإشارات الخلوية على فيلم الكالسيوم unmixed عن طريق استدعاء وظيفة CellScan في إطار الأمر منصة البرمجة.
    17. سوف يسأل التعليمات البرمجية "أي أسلوب الكشف عن عائد الاستثمار تريد استخدامه؟". اكتب الرقم 2 لتحميل ROIs المحددة يدويا إلى النظام الأساسي للبرمجة.
    18. تحميل المناطق ذات الاهتمام من مجلد الرمز البريدي التي تم تحديدها من pericytes باليد في وقت سابق (الخطوة 4.1.6).
    19. سوف يسأل الرمز "ما هو عامل المقياس؟". حدد عامل المقياس ل ROIs المحددة يدويا نسبة إلى سلسلة الصور التي يتم تحليلها واكتب رقم المقياس. في هذا المثال، عامل المقياس هو 1 لأن ROIs لا تحتاج إلى تغيير حجمها حيث تم تحديدها على الصور ذات 128 ×128 بكسل، بنفس الدقة التي تم بها تصوير فيلم الكالسيوم الأصلي.
    20. إنشاء مخططات لكل عائد استثمار وآثار الكالسيوم العادية بألوان مختلفة(الشكل 3A)عن طريق استدعاء وظائف العملية والمؤامرة في إطار الأمر.
    21. إذا لم يكشف التعليمات البرمجية معظم أحداث الكالسيوم في تتبعات الفردية تعديل المعلمات المضمنة داخل مربع تحسين التكوين عن طريق استدعاء الدالة opt_config وضبط القيم مثل تقليل عتبة البيانات التي تمت تصفيتها تمرير قصيرة إلى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري لفترة الأساس، وهو أول 30 إطار من سلسلة T.
    22. حدد الزر عملية في المربع تحسين لتطبيق المعلمات الجديدة.
      ملاحظة: من أجل الكشف عن وتصنيف الإشارات، تتبع الكالسيوم تطبيع هو تمريرة طويلة وتمرير النطاق تصفيتها، مما يساعد على تسهيل البيانات لتقديرات السعة والعرض، ولكن أيضا لتحديد ما إذا كانت الإشارات هي قمم واحدة، قمم متعددة أو الهضاب(الشكل 3B).
    23. إخراج البيانات كملف .csv يحتوي على معلومات مكانية حول مناطق الاهتمام والقمم التي تم تعريفها عن طريق استدعاء الدالة output_data في إطار الأمر. إعطاء الملف اسما فريدا لمزيد من التحليل في برنامج إحصائيات.
      ملاحظة: تصف الخطوات 4.1.24-4.1.31 طريقة تحليل أحداث الكالسيوم المحيطية باستخدام تحليل مؤشرات الاستثمار المستندة إلى النشاط.
    24. كرر الخطوات 4.1.8.-4.1.16 لاستيراد فيلم الكالسيوم، و unmix القنوات، واستدعاء وظيفة CellScan في منصة البرمجة.
    25. سوف يسأل التعليمات البرمجية "أي أسلوب الكشف عن عائد الاستثمار تريد استخدامه؟". اكتب الرقم 6 لتحديد المنطقة التلقائية لتحديد الفائدة استنادا إلى النشاط والتغيير في الفلورسينس في 3 أبعاد (س، ص، والوقت؛ "خوارزمية 3D FLIKA").
    26. رسم النتائج المعالجة لعرض المناطق المحددة ذات الاهتمام كألوان مختلفة عن طريق استدعاء دالات العملية ورسمها في إطار الأمر. يتم تمييز كل عائد استثمار في الزمان والمكان ويمثل كقناع متراكب(الشكل 4).
    27. إذا لم تكتشف الخوارزمية ROIs التي تكون مرئية بوضوح بالعين، قم بتعديل المعلمات المضمنة داخل مربع التحسين عن طريق استدعاء دالة opt_config وضبط القيم، مثل زيادة عامل التصفية الغاوسي الذي ينعم البيانات في الوقت المناسب (بمقدار 2 s) وتقليل عتبة العثور على ROIs إلى 3 أضعاف الانحراف المعياري لخط الأساس.
    28. حدد زر العملية في مربع التحسين لتطبيق المعلمات الجديدة. مع عملية التحسين يجب تحديد المزيد من ROIs(الشكل 4B).
    29. رسم ROIs كفيلم لتحديد مناطق النشاط بوضوح (موضحة بألوان قوس قزح) عن طريق تغيير وضع المربع الافتراضي إلى فيلم داخل إطار التحسين لمزيد من التصور.
    30. إخراج البيانات كملف csv عن طريق استدعاء الدالة output_data في إطار الأمر. يمكن تحليل هذا الملف في برنامج إحصائيات.
      ملاحظة: يمكن تعديل معلمات التحليل لتناسب أي نوع من الإشارات الخلوية الديناميكية (الكالسيوم ونسب FRET وما إلى ذلك). يمكن أن تكون جميع الخطوات المذكورة أعلاه الآلي مع رمز البرمجة بسيطة من أجل دفعة عملية العديد من أفلام الكالسيوم مع نفس الإعدادات.
  2. خط مسح تحليل تدفق الدم.
    1. استيراد خط مسح ملف بيانات kymograph المكتسبة في القسم 3.5 في برنامج البرمجة.
    2. سيسأل الرمز "ما هو المعروض على القناة 1 و 2؟". تحديد ما هو موجود على كل قناة عند المطالبة. في هذا المثال، القناة 1 فارغة (نوع 0)والقناة 2 blood_plasma (النوع 1).
    3. تشغيل وظيفة تحليل القطر على خط المسح الضوئي عن طريق استدعاء الدالة LineScanDiam، الذي يفتح مربع لتحديد المنطقة التي تتوافق مع القطر في kymograph (الشكل 5B، إلى اليسار).
    4. رسم مربع خارج حدود مضان kymograph التي تتوافق مع قطر السفينة.
    5. معالجة هذه الفئة البيانات عن طريق استدعاء وظيفة العملية من أجل قياس العرض الكامل في نصف ماكسيما القطر وعاء وتوليد مؤامرة (الشكل 5C) مع وظيفة المؤامرة.
    6. إخراج البيانات كملف csv عن طريق استدعاء الدالة output_data في إطار الأمر. يمكن تحليل هذا الملف في برنامج إحصائيات.
    7. تشغيل تحليل تحويل الرادون السرعة عن طريق استدعاء الدالة LineScanVel، الذي يفتح مربع لتحديد المنطقة التي تتوافق مع سرعة RBC في kymograph (الشكل 5B، والحق).
    8. رسم مربع داخل حدود مضان كيموغراف الذي يتوافق مع سرعة السفينة.
    9. معالجة هذه الفئة البيانات عن طريق استدعاء وظيفة العملية من أجل حساب السرعة والتدفق والكثافة الخطية لخلايا الدم الحمراء من زاوية الشرائط في الفلورسينس. إنشاء مؤامرة (الشكل 5D) مع وظيفة المؤامرة.
    10. إخراج البيانات كملف csv عن طريق استدعاء الدالة output_data في إطار الأمر. يمكن تحليل هذا الملف في برنامج إحصائيات.
      ملاحظة: يجب أن يكون للكيموغراف مضان واضح مع حواف محددة جيدا بين المسافات السوداء من أجل أن يكون تحليل القطر والسرعة دقيقا(الشكل 5A، B). من المهم جدا رسم الخطوط المتعامدة والمتوازية بطريقة دقيقة، وإلا فلن يكون من الممكن إجراء تحليل موثوق به للكيموغراف. على غرار تحليل الكالسيوم مع خوارزميات معالجة الصور ، يمكن تحسين معلمات حسابات القطر والسرعة.

النتائج

فلورسين-ديككستران لديه طيف الانبعاثات واسعة التي يمكن أن تنزف من خلال في القناة الحمراء, مما يؤثر على الكشف RCaMP في البيريسيات ensheathing (الشكل 2A). الطيفية unmixing بعد الحصول على البيانات في برنامج يقلل من نزيف الفلورسين من خلال(الشكل 2B، أقل) ، وتعزيز الكشف عن إشارة الكالسيوم في خطوات التحليل اللاحقة.

تحليل الكالسيوم مع خوارزميات معالجة الصور المستخدمة في هذا البروتوكول يسمح عدة نهج مختلفة لتحديد ROIs وتقلبات الكالسيوم داخل الخلايا (أي إشارات الكالسيوم). اختيار الهياكل الخلوية باليد يسمح الكشف عن تقلبات الكالسيوم داخل هذه المناطق (الشكل 3A)، بما في ذلك أنواع مختلفة من قمم الإشارات، مثل قمم واحدة وقمم متعددة، بعد آثار الكالسيوم تطبيع منخفضة تمرير وتمرير الفرقة تصفيتها(الشكل 3B). بالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد ROIs من خلال تجميع وحدات البكسل النشطة معا حيث تتغير كثافة الفلورسينس بمرور الوقت باستخدام خوارزميات معالجة الصور التي طورتها Ellefsen et al. 201416 و Barrett et al. 201817 (الشكل 4). ويمكن تطبيق ذلك على أي إشارة خلوية ديناميكية عن طريق ضبط الوقت والعتبة والمعلمات المكانية لتشمل الحجم والشكل المتوقعين للإشارة. خفض عتبة تحديد الإشارة يجد المزيد من المناطق ذات الأهمية(الشكل 4B).

يمكن تحليل kymographs الهمودية مشرق وواضح لقياس القطر وسرعة RBC في الأوعية الدموية بالقرب من البيريسيت ensheathing (الشكل 5A، B). يتم حساب القطر من العرض الكامل بنصف الحد الأقصى للفلورسينس(الشكل 5C). يتم تقريب سرعة RBC من الشرائط المصنوعة من RBCs غير الملساء ، حيث يتم إدخال الزاوية في تحويل الرادون لحساب السرعة والتدفق (الخلايا / الخلايا) والكثافة الخطية (الخلايا / مم ؛ الشكل 5D). وتوجد نوعية رديئة من الكيموجرافات حيث يوجد تشبع مضان، أو إشارة ضعيفة إلى نسبة الضوضاء أو حركة مجال التصوير(الشكل 6 ألف)تخلق مؤامرات غير موثوقة مع نقاط خطأ (الصلبان الحمراء) حيث لا يمكن تحديد البيانات(الشكل 6B، جيم). نوعية البيانات المكتسبة أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتيجة جيدة واتباع الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول يضمن نتائج جيدة.

figure-results-1
الشكل 1. ملخص البروتوكول. يقدم البروتوكول خطوات الحصول على صور الكالسيوم الفلورية وتحليلها من بيريسيتات الورث الدماغي وبيانات تدفق الدم من الأوعية الدموية القريبة في الفئران المخدرة. وينقسم البروتوكول إلى 4 خطوات. 1) إعداد الإجراء: إعداد المعدات وإعداد القسطرة؛ 2) حقن الوريد الذيل; 3) الحصول على البيانات عن طريق المجهر اثنين فوتون؛ 4) تحليل البيانات مع خوارزميات معالجة الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. الطيفية من الفلوروفوريس. أ) صورة تمثيلية متوسطة من RCaMP ensheathing pericyte والفلورسين-dextran المسمى الأوعية الدموية من اقتناء سلسلة T. شريط المقياس = 10 ميكرومتر.B) العلوي: عند النظر في القنوات الفردية، ينزف من خلال القناة 2 هو واضح في القناة 1 (يسار). أقل: بعد الطياف الطيفي، يتم تقليل النزيف من خلال وإشارة من RCaMP هو أكثر بروزا في هيكل pericyte. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. مؤشرات الاستثمار المحددة يدويا وآثار الكالسيوم المحسنة. أ) المناطق ذات الاهتمام المحدد في برنامج معالجة الصور المستخدمة (أشكال قوس قزح) يمكن استخدامها لتحديد آثار إشارة الكالسيوم. ب) يتم تحديد قمم الإشارة من آثار تطبيع من قبل تمرير منخفضة وتمرير النطاق تصفية البيانات. لقد حددنا عتبة الإشارة على أنها 3 أضعاف الانحراف المعياري لفترة خط الأساس (أول 30 إطارا) وأي قمم فوق هذه العتبة تعتبر إشارة (تتبع أقل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. مؤشرات استثمار آلية قائمة على النشاط لتحليل الكالسيوم. تم تحليل نفس البيانات بعتبة 7 أضعاف الانحراف المعياري لخط الأساس (A) و3 أضعاف الانحراف المعياري لخط الأساس (B). يؤدي تقليل عتبة تحديد وحدات البكسل النشطة إلى العثور على المزيد من مؤشرات ROIs (B) وقمم الإشارة (المخطط الدائري) داخل pericytes. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5. قياسات كيموجراف للموديناميك. أ) مثال خط المسح الضوئي من خلال السفينة. ب) مثال على kymographs محددة جيدا القطر (يسار) والسرعة (يمين). الشرائط السوداء داخل النطاق الأيمن من الفلورسينس تتوافق مع تحليل قطر RBCs.C) مع تقلبات واضحة في حركة الأوعية. D) تحليل السرعة مع المؤامرات لمحور Y = تدفق RBC (خلايا / ثانية)، وكثافة الخط (الخلايا / ملم)، والسرعة (مم / ثانية)، وزاوية خط (درجة)، إشارة إلى نسبة الضوضاء (وحدات التعسفي، a.u.)، محور X = الوقت (ثانية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6. تمثيل القياسات الهمودية ذات الجودة الرديئة. أ) أمثلة على kymographs ذات نوعية رديئة مع التشبع الفلوري، وضعف نسبة الإشارة إلى الضوضاء، أو حركة مجال التصوير أثناء الاستحواذ. باء وجيم) مؤامرات مماثلة للرسم 7 من قطر وسرعة البيانات التي لديها نقاط خطأ (النقاط الحمراء) بسبب سوء نوعية kymographs. (الصورة E، محور ص= القطر (μm)، محور X = الوقت (ثانية)؛ الصورة F، محور Y= تدفق RBC (خلايا/ق)، كثافة الخط (الخلايا/مم)، السرعة (مم/ثانية)، وزاوية الخط (درجة)، نسبة الإشارة إلى الضوضاء (a.u.)، محور X=الوقت (ثانية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

الطريقة الحالية توفر تفاصيل عن الماوس حقن الوريد الذيل مع القسطرة، واثنين من الفوتونات صورة مجهر اقتناء لمداخن العمق، والخلايا الأفلام إشارات الكالسيوم، وخلق kymographs الهمودية، وتحليل الكالسيوم والهيوم الديناميكي مع خوارزميات معالجة الصور لدينا17 (الشكل 1). هناك العديد من المزايا لهذه التقنيات التي تحسن نتيجة التصوير في الجسم الحي وتقلل من الوقت والموارد والإجهاد الحيواني خلال الدورة. أولا، استخدام القسطرة لحقن الوريد الذيل يوفر المزيد من السيطرة على الإبرة والمحاقن وكمية المادة التي يتم حقنها في الدورة الدموية للفأر. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمنع حقن صبغ في أنسجة الذيل، وتوفير الكواشف باهظة الثمن. ثانيا، نستخدم الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن أجهزة استشعار الكالسيوم المشفرة وراثيا في إعادة بث البيريسيت وإظهار كيفية توطينها داخل شبكة الأوعية الدموية في الدماغ مع عمق z-stack، مما يسهل تحديد الخلايا ونقلها في جلسات التصوير اللاحقة على المدى الطويل. هذا عامل مهم في دراسات بيريسيت ويضمن تصنيف الخلايا السليم6،7. ثالثا، نحن نقدم معلماتنا لجمع أفلام الكالسيوم وبيانات مسح الخط الديناميكي الدموي التي تشكل نقطة انطلاق جيدة لقياس الإشارات الخلوية الديناميكية. وأخيرا ، نقدم خوارزميات معالجة الصور17، صندوق أدوات معالجة الصور الشامل الذي يحتوي على نهج متعددة للمعالجة المسبقة للصورة (مثل التمليس الطيفي) ، وتحليل صورة الكالسيوم ، وتحليل ديناميكية الدم (القطر والسرعة وما إلى ذلك). يمكن لهذه الخوارزميات توليد مؤامرات لتصور سريع وسهل للبيانات ، مع تقليل مستوى خبرة المستخدم المطلوبة لتحليل النتائج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الآلي مع بضعة أسطر من التعليمات البرمجية لعملية بسرعة مجموعات بيانات متعددة مع نفس المعلمات. وهذا يمكن أن يحسن تصور البيانات واستثمار الوقت للباحث.

المفتاح لجمع بيانات جيدة لتصوير الكالسيوم هو ضبط طاقة الليزر وإعدادات PMT للحصول على إشارة مضان واضحة ، ولكن أيضا جمع البيانات بمعدل إطار كاف لالتقاط حدث الكالسيوم بأكمله. تم الحصول على البيانات الواردة في هذا البروتوكول بمعدل 10-11 إطارا في الثانية ، مما يلتقط ذبذبات الكالسيوم الأبطأ في إعادة التكسير. وهناك أيضا عدة خطوات أثناء التحليل يمكن أن تحسن نتائج التحليل. أولا، يكون التمسيد الطيفي مفيدا إذا كان هناك تداخل كبير بين أطياف الانبعاثات للفلوروفوريس(الشكل 2). تم استخدام فلورسين-ديكتران في هذا البروتوكول لأنه قابل للتكرار فعال من حيث التكلفة ومتاح تجاريا يستخدم عادة لقياسات الديناميكا الدموية5. ويساعد الطيز الطيفي على تنظيف البيانات من أجل تحسين الكشف عن إشارات الكالسيوم، ولكن يمكن أيضا استخدام الفلوروفوريس البديلة ذات أطياف الانبعاثات الأضيق. ثانيا، اختيار الهياكل الخلوية ك ROIs(الشكل 3)مفيد لتصنيف أحداث الكالسيوم في مناطق فرعية مختلفة مثل سوما أو فروع العملية. يوفر اختيار عائد الاستثمار القائم على النشاط (الشكل 4)16 المزيد من المعلومات المكانية والزمانية حول أحداث الكالسيوم الفردية. وهذا يمكن أن يكون مفيدا عند تحديد وتيرة أحداث الكالسيوم في منطقة معينة أو نشر الأحداث إلى مناطق خلوية أخرى. يمكن أن يوفر استخدام برامج البرمجة لتحليل بيانات التصوير على الباحثين ساعات من الوقت عند معالجة البيانات دفعة واحدة ، ولكنه يتطلب بعض الاستثمار في الوقت الأولي لضبط المعلمات لتحقيق أفضل النتائج. وأهم العوامل هي الحجم المتوقع (في μm2)للمنطقة النشطة وكذلك مدة الإشارة (يجب تحديد الحد الأدنى لوقت الإشارة والحد الأقصى لوقت الإشارة). يجب على الباحثين فحص بعض الأفلام تي سلسلة المثال أولا لتحديد أفضل المعايير التي تناسب بياناتها. وأخيرا، فإن البيانات ذات النوعية الرديئة التي يتم الحصول عليها على المجهر يمكن أن تعيق إلى حد كبير تحليل الكالسيوم والديناميكا الدموية(الشكل 6). لذلك ، يجب توخي الحذر لتحسين إعدادات اكتساب المجهر في البداية. مع وضع هذه العوامل في الاعتبار، فإن هذا البروتوكول الذي يمكن تكييفه ليناسب تصوير الكالسيوم أو تحليل الإشارات الخلوية الديناميكية الأخرى (مثل الصوديوم الفلوري أو البوتاسيوم أو المستقلب أو تقلبات الجهد) في الأنسجة أو أنواع الخلايا الأخرى.

هناك العديد من القيود على هذا البروتوكول. أولا، يتم جمع البيانات تحت التخدير، مما يؤثر على نشاط الدماغ ويمكن أن يؤثر على تدفق الدم. ويمكن إجراء تصوير مماثل في الفئران مستيقظا التي يتم تدريبها على قبول تثبيت الرأس لمزيد من النتائج الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن نتذكر أن نجمع صور ثنائية الأبعاد لخلية ثلاثية الأبعاد ووعاء دموي في الجسم الحي. لذلك، يمكننا التقاط فصيل فقط من أحداث الكالسيوم داخل هذه الخلايا أو تدفق الدم في قسم واحد من الأوعية الدموية في وقت واحد.

وهناك قيد آخر يجب ملاحظته هو أن تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون حساس للقطع الأثرية للحركة ، حيث يمكن أن يكون التنقل داخل وخارج المستوى البؤري مخطئا بسبب تقلبات الكالسيوم. تم تنفيذ هذا البروتوكول تحت التخدير ، مما يحد من حركة الحيوان . ومع ذلك ، يمكن إدخال القطع الأثرية الحركة عن طريق معدل التنفس من الماوس ، ومعدل ضربات القلب ، وتورم الأنسجة المحتملة ، وفي حالة النفخ pericytes ، تقلص الأوعية أو vasomotion 4،6،18،19. يمكن التخفيف من القطع الأثرية الحركة من خلال عدة استراتيجيات. تتضمن حزم معالجة الصور المستخدمة في هذا البروتوكول خطوة تصحيح الحركة الاختيارية ، والتي تستخدم محركا ملتويا ثلاثي الأبعاد لمحاذاة الصور داخل السلسلة T استنادا إلى الأوعية الدمويةالمرئية 13و17. يتم تحديد الإطارات ذات التغيرات الهامة في المستوى البؤري بواسطة هذه الخوارزمية ويمكن استبعادها من التحليل. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن استخدام استراتيجيات إحصائية داخل حزم معالجة التصوير، مثل درجة Z عند توليد آثار مضان لتطبيع الحركة الناجمة عن تقلبات الكالسيوم20. النهج الأكثر قوة لحساب القطع الأثرية الحركة في التصوير اثنين الفوتون هو الجمع بين التعبير عن اثنين من المؤشرات الفلورية داخل نفس الخلية، مثل مؤشر الكالسيوم (على سبيل المثال، GCaMP) ومراسل الفلورسنت (على سبيل المثال، mCherry) التي هي مستقلة عن الكالسيوم. ويمكن بعد ذلك أن تعزى التقلبات في المراسل الفلوري إلى الحركة ويتم طرحها من إشارة مؤشر الكالسيوم لتطبيع القطع الأثرية للحركة.

الغرض من هذا البروتوكول هو توفير فهم واضح لكيفية جمع أفضل بيانات تصوير الكالسيوم وتدفق الدم في الجسم الحي وتقديم أساليب وأدوات تحليل جديدة يمكن للباحثين تنفيذها من أجل تحسين نتائجهم. ويمكن تطبيق هذه التقنيات لدراسة دور مجموعات مختلفة من البيريسيات في السيطرة على تدفق الدم أو في حالات أمراض الدماغ المختلفة. ويمكن أيضا استخدام معلمات التصوير هذه لدراسة الكالسيوم وتدفق الدم في أنواع الخلايا الأخرى وأنظمة الأعضاء وتنطبق مبادئ مماثلة على تقنيات التصوير الديناميكية الأخرى التي أصبحت ممكنة من خلال أجهزة استشعار أخرى مشفرة وراثيا، تتجاوز الكالسيوم.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

J. Meza مدعومة بزمالات من Mitacs والبحوث مانيتوبا. وقدمت تمويل هذا العمل المعاهد الكندية للبحوث الصحية، والبحوث مانيتوبا، ومؤسسة مانيتوبا للخدمات الطبية، والتمويل الأولي من جامعة مانيتوبا وكندا للدماغ من خلال الصندوق الكندي لبحوث الدماغ، بدعم مالي من وزارة الصحة الكندية ومؤسسة أزريلي. والآراء الواردة هنا لا تمثل بالضرورة آراء وزير الصحة أو حكومة كندا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Acta2-RCaMP1.07مختبر جاكسون28345في بروتوكول الفيديو ، النموذج الحيواني المستخدم هو أنثى فأر يبلغ من العمر 10 أشهر ، 1 يوم.
أدوات التطبيق (العادية)BiscoX-80250P
BioFormats ل MATLABNANAالمقومة في هذا البروتوكول باسم "حزم معالجة الصور".  متوفر في: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/
CHIPS MATLAB toolboxNAمقوم في هذا البروتوكول باسم "خوارزميات معالجة الصور". باريت MJP ، فيراري دينار كويتي ، ستوبارت جي إل ، هولوب إم ، ويبر ب. رقائق: صندوق أدوات قابل للتوسيع لتحليل الصور الخلوية والديناميكية ثنائية الفوتون. المعلوماتية العصبية. 2018; 16(1):145-147. دوي: 10.1007 / S12021-017-9344-Y. متوفر في: جل
الموجات فوق الصوتية https://github.com/EIN-lab/CHIPS الشفاف ،HealthCare PlusUGC250
Dextran، الفلورسين ، 70,000 ميجاوات ، أنيونيThermo Fisher ScientificD1823
Dextran، Texas Red، 70,000 ميجاوات ،Thermo Fisher ScientificD1830
Eye Lube PlusOptixcareNA
FIJIالصورة JNAالمقومة في هذا البروتوكول باسم "برنامج معالج الصور".  متوفر في: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GCaMP6sfl / flمنصة تثبيت عمود مختبر
جامعة زيورخNA
الكيتامين (ناركيتان 100 مجم / مل)فيتوكينول440893
MATLAB R2020bNAالمقوم في هذا البروتوكول باسم "منصة البرمجة". متوفر في: https://www.mathworks.com/downloads/
إبرة 0.3 مم × 25 ممBD PrecisionGlide305128
الهدف XLUMPLFLN20XWأوليمبوسNAhttps://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/
PDGFR & beta ؛ -CreERT2أنابيب البولي إيثيلين مختبر جاكسون30201
، معرف PE10 28 مم (0.11 بوصة) OD 61 مم (.024 ”)BD Intramedic427401
Prairie ViewBruker Fluorescence المجهرNAhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Ultima في المختبر مجهر متعدد الفوتونبروكر الفلورةالمجهر NAhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
سخان تحت الخزانReptitherm U.T.HE169064
Xylazine (رومبون 20 مجم / مل)باير هيلثكير 2169592
حزمة NA جاكسون

المراجع

  1. Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  3. Berthiaume, A. -A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
  4. Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
  5. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  6. Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
  7. Hartmann, D. a, et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402(2015).
  8. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
  9. Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
  10. 28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021).
  11. Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
  12. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  13. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  14. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680(2008).
  15. Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297(2019).
  16. Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
  17. Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
  18. Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
  19. Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
  20. Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة