Microelectrode صفيف تسجيل سينواتري عقدة معدل اطلاق النار لتحديد عيوب الإيقاع القلب الجوهرية في الفئران

ملخص

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف منهجية جديدة لقياس معدل إطلاق القلب الجوهري باستخدام تسجيل صفيف microelectrode لأنسجة العقدة الصينية الصناعية بأكملها لتحديد عيوب صنع الإيقاع في الفئران. يمكن أيضا إدخال العوامل الدوائية في هذه الطريقة لدراسة آثارها على صنع الإيقاع الجوهري.

الملخص

العقدة سينواري (SAN)، وتقع في الأذين الأيمن، يحتوي على خلايا منظم ضربات القلب في القلب، والخلل الوظيفي في هذه المنطقة يمكن أن يسبب عدم دقات القلب أو بطء القلب. تحديد موثوق بها من عيوب صنع ضربات القلب يتطلب قياس معدلات ضربات القلب الجوهرية من خلال منع إلى حد كبير تأثير الجهاز العصبي اللاإرادي، والتي يمكن أن تخفي العجز معدل. وتشمل الطرق التقليدية لتحليل وظيفة تنظيم ضربات القلب الجوهرية الحصار اللاإرادي الناجم عن المخدرات لقياس معدلات ضربات القلب في الجسم الحي، وتسجيلات القلب المعزولة لقياس معدلات ضربات القلب الجوهرية، وشريط sinoatrial أو تسجيلات المشبك التصحيح خلية واحدة من خلايا منظم ضربات القلب sinoatrial لقياس معدلات إطلاق النار المحتملة العمل العفوي. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه التقنيات التقليدية أكثر تحديا من الناحية الفنية ويصعب تنفيذها. هنا ، نقدم منهجية جديدة لقياس معدل إطلاق القلب الجوهري من خلال إجراء تسجيلات صفيف microelectrode (MEA) لتحضيرات العقدة الصينية الكاملة من الفئران. وتتألف MEAs من microelectrodes متعددة مرتبة في نمط يشبه الشبكة لتسجيل في إمكانات حقل خارج الخلية المختبر. الطريقة الموصوفة هنا لديها ميزة مجتمعة لكونها أسرع نسبيا، أبسط، وأكثر دقة من النهج السابقة لتسجيل معدلات ضربات القلب الجوهرية، مع السماح أيضا الاستجواب الدوائية سهلة.

المقدمة

القلب هو جهاز معقد تحكمه كل من التأثيرات القلبية الجوهرية والخارجية مثل تلك التي تنشأ في الدماغ. العقدة سينواتي (SAN) هي منطقة محددة في القلب التي تضم خلايا منظم ضربات القلب (يشار إليها أيضا باسم الخلايا الصينية، أو خلايا SA) المسؤولة عن بدء وإدامة ضربات القلب الثديية^1،2. معدل ضربات القلب الجوهري هو المعدل الذي تدفعه خلايا تنظيم ضربات القلب دون تأثير من التأثيرات القلبية أو العصبية الفكاهية الأخرى ، ولكن التدابير التقليدية لمعدل ضربات القلب في البشر والحيوانات الحية ، مثل تخطيط القلب الكهربائي ، تعكس كل من منظم ضربات القلب والتأثيرات العصبية على القلب. التأثير العصبي الأبرز على خلايا SA هو من الجهاز العصبي اللاإرادي ، والذي يعدل باستمرار أنماط إطلاق النار لتلبية المتطلبات الفسيولوجية للجسم³. دعم هذه الفكرة، يمكن العثور على كل من التوقعات متعاطفة وشبه متعاطفة بالقرب من سان⁴. الجهاز العصبي القلبي الجوهري (ICNS) هو تأثير عصبي مهم آخر حيث plexi ganglionated، وتحديدا في الأذين الأيمن، innervate وتنظيم نشاط سان^5،6.

فهم العجز في صنع الإيقاع مهم سريريا، حيث أن الخلل الوظيفي يمكن أن يكون وراء العديد من اضطرابات القلب، فضلا عن المساهمة في خطر حدوث مضاعفات أخرى. متلازمة الجيوب الأنفية المريضة (SSS) هي فئة من الأمراض التي تتميز بخلل وظيفي في العقدة الصينية التي تعوق صنع الإيقاع السليم^7،8. SSS يمكن أن تقدم مع بطء القلب الجيوب الأنفية, توقف الجيوب الأنفية, اعتقال الجيوب الأنفية, كتلة الخروج سيناوي, وبالتناوب bradyarrythmias وtachyarrhythmias 9 ويمكن أن يؤدي إلى مضاعفات بما في ذلك^زيادة خطر السكتة الدماغية الانسدادية والموت المفاجئ^8,10. أولئك الذين يعانون من متلازمة بروغادا, اضطراب القلب تميزت الرجفان البطيني مع زيادة خطر الوفاة القلبية المفاجئة, هم أكثر عرضة للأحداث غير صحية إذا كان لديهم أيضا خلل سان comorbid^11,12. قد يكون للخلل الصناعي الصيني أيضا عواقب فسيولوجية تتجاوز القلب. على سبيل المثال، وقد لوحظ SSS لتحريك المضبوطات في المريض بسبب نقص التروية^{الدماغية 13}.

لتحديد العجز في صناعة الإيقاع sinoatrial ، ومعدلات القلب الجوهرية تحتاج إلى تحديد من خلال قياس نشاط سان دون تأثير الجهاز العصبي اللاإرادي أو العوامل الفكاهية. سريريا، وهذا يمكن أن يكون تقريبيا عن طريق الحصار اللاإرادي^{الدوائية 14،}ولكن يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية نفسها في نماذج الثدييات^{لدراسة وظيفة القلب الجوهرية 15،16}. في حين أن هذا النهج يمنع جزءا كبيرا من التأثيرات العصبية المساهمة ويسمح بإجراء فحص القلب في الجسم الحي ، فإنه لا يقضي تماما على جميع التأثيرات الخارجية على القلب. تقنية بحثية أخرى تستخدم لدراسة وظيفة القلب الجوهرية في النماذج الحيوانية هي تسجيلات القلب المعزولة باستخدام قلوب Langendorff perfused ، والتي تنطوي عادة على قياسات باستخدام الكتروجرامات ، وسرعة ، أو صفائف متعددة الأقطاب epicardial^{17،18،19،20}. في حين أن هذه التقنية هي أكثر تحديدا لوظيفة القلب لأنه ينطوي على إزالة القلب من الجسم، قد لا تزال تتأثر القياسات من قبل آليات التنظيم الذاتي الميكانيكية الكهربائية التي يمكن أن تؤثر على قياسات معدل ضربات القلب^{الجوهرية 21}. تسجيلات القلب المعزولة قد لا تزال تتأثر أيضا التنظيم اللاإرادي من خلال ICNS^5,6,22,23. وعلاوة على ذلك، الحفاظ على درجة حرارة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للقلب، وهو أمر بالغ الأهمية لقياس وظيفة القلب، يمكن أن يكون من الصعب في القلب المعزول النهج²⁰. وهناك طريقة أكثر مباشرة لدراسة وظيفة سان هو عزل أنسجة سان على وجه التحديد وقياس نشاطها. ويمكن تحقيق ذلك من خلال شرائط سان (أنسجة سان معزولة) أو معزولة SAN خلايا منظم ضربات القلب^24,25. كلاهما يتطلب درجة عالية من التدريب التقني، كما SAN هي منطقة صغيرة جدا ومحددة للغاية، وعزل الخلايا يشكل تحديا أكبر لأن الانفصال يمكن أن تلحق الضرر بالصحة العامة للخلية إذا لم يتم تنفيذها بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه التقنيات مهارات الخبراء الكهربية من أجل تسجيل بنجاح من الأنسجة أو الخلايا باستخدام الخلايا الدقيقة تسجيل الفردية.

في هذا البروتوكول، نقوم بوصف تقنية لتسجيل SAN في المختبر باستخدام صفيف microelectrode (MEA) للحصول على قياسات معدل ضربات القلب الجوهرية. هذا النهج لديه ميزة جعل التسجيلات الكهربية محددة للغاية في متناول الباحثين الذين يفتقرون إلى skillsets الكهربية المكثفة. وقد سبق أن استخدمت MEAs لدراسة وظيفة cardiomyocyte في الثقافات القلبية الأولية^{26،27،28،29،30،31،32}، أوراق القلب³³،^{34،35،36،37،38،39}، والأنسجة كلها يتصاعد^{40، 41،42،43،44،45،46،47}. كما تم القيام بعمل سابق لدراسة الإمكانات الميدانية في أنسجة سان^41،42. هنا ، ونحن نقدم منهجية لاستخدام MEA لتسجيل وتحليل مورين الجوهرية سان معدلات اطلاق النار. ونحن نصف أيضا كيف يمكن استخدام هذه التقنية لاختبار الآثار الدوائية للأدوية على معدلات إطلاق سان الجوهرية من خلال توفير تجربة عينة تبين آثار 4-aminopyridine (4-AP), والجهد بوابات K⁺ مانع القناة. باستخدام المعالم التشريحية المحددة، يمكننا تسجيل سان بدقة دون الحاجة إلى إجراء تشريح الأنسجة واسعة النطاق أو عزل الخلايا المطلوبة في أساليب أخرى. في حين أن MEA يمكن أن تكون باهظة التكلفة ، فإن التسجيلات توفر مقاييس محددة وموثوقة للغاية من صنع الإيقاع التي يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من تطبيقات البحوث السريرية والفسيولوجية.

البروتوكول

وقد نفذت جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة، على النحو الذي وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في الجامعة الميثودية الجنوبية.

1. طلاء مجموعة متعددة الأقطاب (MEA) للتسجيل

1. جعل 25 mM بورات المخزن المؤقت.
   1. حل 0.953 غرام من نا₂B₄O₇· 10 H₂O في 80 مل من الماء المقطر.
   2. ضبط درجة الحموضة إلى 8.4 مع HCl ثم إضافة الماء المقطر إلى حجم النهائي من 100 مل.
2. جعل 0.1٪ حل الأسهم من البولي ايثيلين (PEI).
   1. أضف 100 ميكرولتر من 50٪ (ث/v) PEI إلى 4.9 مل من الماء المقطر لصنع حل PEI بنسبة 1٪.
   2. تمييع حل PEI بنسبة 1٪ إلى 0.1٪ في المخزن المؤقت للبورات عن طريق إضافة 1 مل من حل PEI بنسبة 1٪ إلى 9 مل من المخزن المؤقت للبورات 25 mM.
3. Pipette ~ 1 مل من الحل PEI 0.1٪ في طبق صفيف microelectrode (MEA) بحيث يتم تغطية الأقطاب الكهربائية بالكامل(الشكل 1A و 1B).
   ملاحظة: تتكون الميكروبيكترودات من MEA عادة من البلاتين الأسود أو الكربون نانوتوب ومعزولة مع البوليميد (أو الاكريليك)؛ كلا المواد هي مسعور. من خلال طلاء MEA مع البوليمر cationic مثل جزيرة الأمير إدوارد ، يتم إجراء سطح MEA الكاره للماء أكثر مائية ، مما يسمح لعينات الأنسجة بإجراء اتصال أفضل مع سطح MEA(الشكل 1A1).
4. تغطية طبق MEA مع فيلم بالحرارة للحد من التبخر وترك MEA بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة(الشكل 1C).
5. يستنشق حل PEI من طبق MEA باستخدام ماصة ، مع الحرص على عدم لمس شبكة القطب الكهربائي التي يمكن أن تلحق الضرر بالأقطاب الكهربائية ، ثم شطف ≥4 مرات بالماء المقطر(الشكل 1D).
6. تخزين MEA المغلفة جزيرة الأمير إدوارد تحت 1-2 مل من المياه فائقة البور ومختومة مع فيلم بالحرارة في 4 درجة مئوية حتى الحاجة. بدلا من ذلك، تخزين MEA المغلفة عن طريق غمرها في كوب مملوءة بالماء فائقة(الشكل 1E).
   ملاحظة: يجب إجراء عملية طلاء PEI مرة واحدة فقط ل MEA قبل استخدامها لأول مرة ، وبعد كل جلسة تسجيل ، يجب تخزين MEA غارقة في مياه فائقة النبور.

2. إعداد حل تايرود الكامل لتشريح الأنسجة

1. جعل 1000 مل من حل تايرود كاملة لتشريح; أولا، إضافة 8.1816 غرام من NaCl إلى 800 مل من المياه فائقة النبور.
2. إضافة الكمية التالية من المواد الكيميائية إلى الحل: 0.4025 غرام من KCl; 0.1633 غرام من KH₂PO₄; 1.1915 غرام من HEPES؛ 0.9999 غرام من الجلوكوز. 0.0952 غرام من MgCl₂; 0.2646 غرام من CaCl₂· 2H₂O.
3. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع NaOH ثم إضافة المياه فائقة النبور حتى يبلغ إجمالي حجم 1000 مل.
   ملاحظة: التركيب النهائي للحل التيرود الكامل سيكون التالي (في mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 5 HEPES, 5.55 الجلوكوز, 1 MgCl₂, 1.8 CaCl₂.

3. إعداد محلول التيرود المؤوكسجين للتسجيل

1. جعل 500 مل من الحل التيرود; إضافة 4.003 غرام من NaCl إلى 400 مل من المياه فائقة البور.
2. إضافة الكميات التالية من المواد الكيميائية إلى الحل: 0.651 غرام من NaHCO₃; 0.042 غرام من ناه₂PO₄; 0.132 غرام من CaCl₂· 2H₂O; 0.149 غرام من KCl؛ 0.0476 غرام من MgCl₂; 0.999 غرام من الجلوكوز.
3. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl ثم إضافة المياه فائقة النبور حتى يبلغ إجمالي حجم 500 مل.
4. أكسجين الحل مع كاربوجين لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل بدء التسجيل.
   ملاحظة: التركيب النهائي للحل التيرود سيكون التالي (في mM): 137 NaCl, 15.5 NaHCO₃, 0.7 NaH₂PO₄, 1.8 CaCl₂, 4 KCl, 1 MgCl₂, 11.1 الجلوكوز. حل هذا التيرود لديه تكوين مختلف قليلا من حل تايرود كاملة تستخدم لتشريح.

4. إعداد 4-aminopyridine (4-AP) حل لتعديل الدوائية

1. جعل 1 mM حل العمل من 4-AP; إضافة 18.82 ملغ من 4-AP إلى 200 مل من الحل التيرود من الخطوة 3.
2. أكسجين الحل 4-AP لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجربة.

5. إعداد طبق بيتري للتشريح

1. مزيج مكونات الاستومر السيليكون في نسبة 10:1 (حسب الوزن) من قاعدة إلى عامل المعالجة.
2. صب ~ 15 مل من خليط الاستومر السيليكون في طبق بيتري قطرها 60 ملم.
3. السماح للإلدائن لعلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة قبل الاستخدام.
   ملاحظة: يمكن إعادة استخدام طبق بيتري السيليكوني للتشريح في المستقبل.

6. تشريح العقدة sinoatrial (سان)

1. إعداد حل تايرود الكامل heparinized لتشريح سان.
   1. إضافة 400 ميكرولتر من الهيبارين (1000 USP / مل) إلى 40 مل من محلول تايرود كاملة ودافئة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. حقن الماوس intraperitoneally مع 200-300 ميكرولتر من الهيبارين (1000 USP/mL) والسماح للحيوان للجلوس لمدة 10 دقيقة.
3. القتل الرحيم الماوس الهيبارين بواسطة جرعة زائدة من ايزوفلوران.
   1. ضع الماوس في غرفة زجاجية صغيرة تحتوي على أبخرة isoflurane التي تم إنشاؤها عن طريق إضافة 200-300 ميكرولتر من الأيزوفلوران السائل إلى ورقة تصفية داخل أنبوب بلاستيكي مثقب.
      ملاحظة: لأن الأيزوفلوران يمكن أن يسبب تهيج الجلد ويمكن أيضا أن يمتص من خلال الجلد، يجب على السائل عدم الاتصال الماوس مباشرة. لذلك ، يتم وضع المسح المنقوع بالايسوفوران في أنبوب مثقب للإدارة.
   2. تحقق من الموت عن طريق التوقف عن الحركة والجهد التنفس وعدم وجود قرصة إصبع القدم منعكس. الموت عادة ما يستغرق حوالي 1-2 دقيقة بعد التنسيب في الغرفة.
      ملاحظة: عادة ما يكون الموت مصحوبا بالتبول.
4. ضع الماوس في وضع ية على لوح تشريح مع الكفوف الممدودة وإصلاح الكفوف إلى اللوحة باستخدام إبر حقن بطول 1 بوصة و23 قياسا. ثم إزالة الفراء في محيط الجزء السفلي من القفص الصدري باستخدام مقص الجراحية وقطع الفراء في الجذور.
   ملاحظة: بالنسبة إلى لوحة تشريح، يمكن استخدام أغطية مبردة البوليسترين.
5. في حين عقد الجلد مع hemostat، استخدم مقص الجراحية لجعل شق عرضية في الجلد فقط تحت الجزء السفلي من القفص الصدري من حوالي قوس كوستال اليسار إلى القوس كوستال الأيمن (الشكل 3A).
6. قطع فتح الصفاق مع مقص الجراحية وفصل بعناية الكبد من الحجاب الحاجز، مع الحرص على عدم الكبد، والتي سوف تسبب نزيف مفرط(الشكل 3B). يسوس الحجاب الحاجز على طول الصدر لفضح تجويف الصدر (الشكل 3C- D).
7. باستخدام مقص الجراحية، وقطع الجدران الجانبية من القفص الصدري من حواف الأقواس costal تصل إلى الترقوة لفضح القلب، مع الحرص على تجنب إلحاق الضرر بالقلب(الشكل 3D). ثم استخدم إبرة حقنة قياس 23 لتثبيت القفص الصدري على الكتف، وعقد في مكان والخروج من الطريق من المجال الجراحي.
8. استخدام ماصة نقل لبالتنقيط الحارة (37 درجة مئوية) heparinized حل تام التيرود على القلب للحفاظ على رطوبة.
   ملاحظة: لا تسمح للقلب بالجفاف.
9. إزالة الرئتين عن طريق عقد لهم مع ملقط Graefe غرامة اضافية وقطع القصبة الهوائية مع مقص الجراحية (الشكل 3E).
10. عقد قمة القلب مع ملقط Graefe غرامة اضافية وإزالتها عن طريق قطع الشريان الأورطي وفيناي كافاي مع مقص الجراحية. نقل القلب إلى طبق بيتري التي تحتوي على شفيت السيليكون elastomer (الشكل 4A) واستخدام ماصة نقل للاستحمام القلب مع 2-3 مل من الحارة (37 درجة مئوية) heparinized حل تايرود الكامل.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم إتلاف الجدار الخلفي الحساس من الأذين الأيمن، الذي يحتوي على سان، والأوردة الأذينية اليمنى المتصلة. الاستحمام القلب مع حل تام تايرود يحافظ على القلب من الجفاف ولكن لا تغمر تماما القلب في الحل لأنها سوف تضعف الرؤية أثناء تشريح.
11. توجيه القلب مع الأذين الأيمن على الأذين المجرب الأيمن والأذين الأيسر على يسار المجرب.
    ملاحظة: يجب أن يتم تشريح أنسجة سان بسرعة من أجل منع الإصابة المرتبطة ب نقص التروية.
12. إرفاق قمة القلب إلى الطبق مع دبوس تشريح. ثم, في حين عقد كافا الوريد السفلي مع دومون #2 ملقط لامينكتوم, إدراج إبرة حقنة 22 G من خلال كافا الوريد أدنى ومتفوقة لتحديد موقعها في الأذين الأيمن, الذي يحدد أيضا الموقف التقريبي لسان (تقع في رقعة من الأنسجة بين كافا فينا أدنى ومتفوقة (الشكل 4B).
13. باستخدام دبابيس تشريح صغيرة، دبوس الزوائد الأذيني الأيسر والأيحي إلى الطبق.
    1. أثناء عقد الملحق الأذيني الأيسر مع دومونت #2 ملقط استئصال اللامينكتوم ، ضع دبوس تشريح من خلال الملحق الأذيني الأيسر لتثبيته في مكانه.
    2. في حين عقد الملحق الأذيني الأيمن مع ملقط #55 دومون، وضع دبوس تشريح من خلال الملحق الأذيني الأيمن لعقد في مكانه.
       ملاحظة: يمكن استخدام نفس نوع ملقط للاحتفاظ الزوائد الأذيني الأيسر والأينى إذا رغبت في ذلك.
14. إزالة إبرة الحقنة التي تمتد فيناي كافاي.
15. لتحرير الدم من القلب، استخدم مقص كاستروفيجو لإزالة قمة القلب (أي النصف السفلي) عن طريق إجراء شق عرضي عبر البطينين(الشكل 4C). ثم، وغسل القلب عن طريق إضافة دافئة (37 درجة مئوية) heparinized حل تايرود كاملة مع ماصة نقل.
16. استخدام مقص كاستروفيجو لقطع على طول الحاجز الأذيني البطين الحفاظ على شق أقرب إلى البطين من الأذين. استمر في القطع على طول الحاجز الأذيني البطيني حتى يتم فصل الأذينين عن البطينين.
17. قطع على طول الحاجز الصناعي لإزالة الأذين الأيسر.
18. مكان دبابيس تشريح في محيط الأذين الأيمن لجعله وضع شقة (الشكل 4D). إزالة أي الدهون المتبقية، والأوعية، أو الأنسجة من الأذين باستخدام مقص كاستروفيجو.
19. حدد موقع SAN في الأذين الأيمن ، والذي يحده في هذا الاتجاه تقريبا الوريدا الكافا المتفوق (في الأعلى) ، وفينا كافا السفلي (في الأسفل) ، و cristae terminalis (على اليسار) (الشكل 4D).
    ملاحظة: يظهر المبنى كريستا ك سلسلة من التلال العضلية الداكنة بين الملحق الأذيني الأيمن و SAN. في كثير من الأحيان يمكن أيضا أن ينظر إلى الشريان سان coursing من خلال سان (الشكل 4D).

7. إعداد نظام MEA للتسجيل

1. إضافة حل تايرود (من الخطوة 3) إلى زجاجة حل الإدخال (الشكل 5C) والأوكسيجين عن طريق تشغيل تدفق غاز كاربوجين(الشكل 5A)إلى النظام.
   ملاحظة: حل التيرود المستخدمة للتسجيل يختلف قليلا في تكوين من حل التيرود الكامل المستخدمة لتشريح.
2. تحقق من تدفق كاربوجين من خلال مراقبة الفقاعات في القارورة المخروطية ، والتي تستخدم لترطيب الغاز (الشكل 5B) ، وزجاجة محلول الإدخال(الشكل 5C).
3. إدراج أنابيب تدفق مضخة التجبير(الشكل 5D)في حل تسجيل التيرود(الشكل 5C). ثم أدخل أنابيب تدفق مضخة التجبير في زجاجة جمع(الشكل 5I).
4. تعيين مضخة التجسيم إلى 25 دورة في الدقيقة، والذي يعطي معدل تدفق 2 مل / دقيقة وبدء المضخة. تحقق من النظام لأي تسرب عازل أو تجاوز.
5. تعيين وحدة تحكم درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، ودرجة الحرارة الفسيولوجية للفئران (الشكل 5E).

8. وضع أنسجة القلب على شبكة MEA

1. نقل الأنسجة SAN تشريح بمساعدة فرشاة الطلاء (الشكل 6A) من طبق بيتري تشريح على شبكة MEA (الشكل 1A1).
   1. أثناء النظر تحت المجهر المقلوب ، ضع الأنسجة برفق مع فرشاة طلاء ناعمة بحيث تغطي منطقة سان شبكة القطب الكهربائي.
   2. إعادة وضع الأنسجة حسب الضرورة لضمان وضعها شقة على شبكة القطب الكهربائي، مما يجعل اتصال جيد مع الأقطاب الكهربائية.
      ملاحظة: مطلوب فرشاة الطلاء الناعمة لتحريك الأنسجة لتجنب إتلاف شبكة القطب الكهربائي.
2. بمجرد وضع الأنسجة بشكل صحيح ، استخدم ملقط العظام (أو أي ملقط منحني) لوضع الشبكة فوق الأنسجة(الشكل 6A). ثم استخدم ملقط العظام لوضع مرساة القيثارة(الشكل 6A)على شبكة لعقد كل شيء في مكانه (الشكل 6B).
3. التقاط صورة لتحديد المواقع من الأنسجة على MEA بحيث يمكن ربط نشاط الأقطاب الفردية مع موقعها التشريحي أثناء التسجيل. ويمكن القيام بذلك عن طريق عقد الهاتف الذكي تصل إلى الهدف المجهر مقلوب أو باستخدام كاميرا المجهر المرفقة.
   ملاحظة: إذا لم يتم تغيير اتجاه MEA بعد التقاط الصورة، سيظهر القطب العلوي الأيسر كالقناة الأولى (Ch1) أثناء التسجيل.
4. وضع طبق MEA على لوحة موصل(الشكل 5F و 6C)ووضع بعناية غطاء التغلغل(الشكل 6C)على طبق MEA دون إزعاج مرساة شريحة القيثارة. يمكن تأمين غطاء التغلغل باستخدام قطعة من شريط المختبر(الشكل 6C).
   ملاحظة: بالإضافة إلى وجود حل قابل للتعديل تدفق وتدفق الأنابيب، وسقف لديها أيضا منفذ لتسليم الغاز (الشكل 6C). وبالإضافة إلى ذلك، حلقة القطب المرجعي يمتد من خلال الغطاء(الشكل 6C).
5. السماح للأنسجة للتعافي من المناولة والتأقلم مع الغرفة لمدة 15-20 دقيقة قبل التسجيل.

9. وضع بروتوكول الحصول على البيانات للتسجيل

ملاحظة: تصف الخطوات التالية فتح بروتوكول البرنامج لتسجيل فوز عفوية وتعريف شروط التسجيل. قد تختلف تفاصيل هذه الخطوات اعتمادا على البرامج المحددة المستخدمة، ولكن يجب أن يظل المخطط العام كما هو.

1. تشغيل مكبر للصوت (الشكل 5G)، وإعداد سير عمل للتسجيل في البرنامج على الكمبيوتر (الشكل 5H).
   1. افتح البرنامج وانقر على سير العمل.
   2. حدد فتح مجلد جديد.
   3. افتح المجلد من القوالب.
   4. حدد 64MD1-1920X1080 (اعتمادا على دقة سطح المكتب).
   5. افتح المجلد QT.
   6. افتح مجلد التسجيل التلقائي.
   7. حدد قالب Beat_recording.moflo وفتحه (الشكل 7A).
2. تعيين معلمات التسجيل لتحديد عدد من آثار، مدة التتبع، الفاصل الزمني تتبع، الجهد المدخلات، معدل أخذ العينات، الخ، وفقا لشروط التسجيل المطلوب(الشكل 7B).
   ملاحظة: للحصول على تردد النبض والحصول على البيانات بين البينية، استخدم عادة جهد نطاق الإدخال 2.9 mV، ومرشح تمرير عالية 1-Hz، ومرشح تمرير منخفض 1000-Hz، ومعدل أخذ العينات من 20 كيلوهرتز.
3. لوضع علامة على مراحل أو شروط مختلفة من التجربة، مثل قبل وبعد إدارة الدواء، انقر على علامة التبويب الشروح لإضافة العلامات المطلوبة(الشكل 7C).
4. لتحديد وجهة الملف للبيانات التي سيتم تجميعها، حدد المربع تمكين التخزين وأدخل اسم الملف المطلوب في المربع تعديل اسم الملف.

10. تنفيذ التسجيل وجمع البيانات

1. انقر فوق الزر تسجيل وتشغيل في أعلى شريط قائمة من برنامج الاستحواذ لبدء التسجيل. الحصول على بيانات ل 10 آثار لمدة دقيقة واحدة مع فترات من 2 دقيقة بين آثار.
2. من هذه الآثار الأولية، تحقق من أن الأشكال الموجية المسجلة تتسق مع إعداد الأنسجة صحية وعالية الجودة من خلال تأكيد أن غالبية قنوات التسجيل تظهر سعة إشارة ≥ 0.5 mV وفواصل متطابقة بين الارتفاع(الشكل 8).
   ملاحظة: يمكن إجراء تقييم أولي للنشاط وأشكال الموجات للموجات الدقيقة الفردية المقابلة لمواقعها التشريحية من خلال الرجوع إلى الصورة المكتسبة بعد وضع الأنسجة على MEA.
3. لقياس آثار الأدوية على الأنسجة، أوقف التسجيل مؤقتا بعد الحصول على بيانات خط الأساس الأولية بالنقر فوق زر الإيقاف المؤقت في أعلى شريط قائمة.
   ملاحظة: يمكن تدوين مرحلة استجابة الدواء للتجربة في التسجيل بالنقر على علامة التبويب الشروح وإضافة التدوين المطلوب كما هو موضح أعلاه(الشكل 7C).
4. وقفة المضخة والتبديل أنابيب تدفق مضخة من حل تسجيل العادي إلى حل تايرود التي تحتوي على الدواء المطلوب من الاختيار.
   ملاحظة: في تجربة المثال، تم استخدام الحل التيرود مع 1 MM 4-aminopyridine (4-AP).
5. أعد تشغيل المضخة وأوقف التسجيل مؤقتا لبدء جمع البيانات مرة أخرى.
6. بمجرد وصول محلول التيرود المشبع بالمخدرات إلى الأنسجة ، سجل 10 آثار بنفس الطريقة التي تم إجراؤها سابقا للتسجيلات الأساسية.
   ملاحظة: سوف آثار يستغرق بعض الوقت لتحقيق الاستقرار كما يبث المخدرات في غرفة التسجيل. آلية عمل الدواء قد تؤثر أيضا على تسجيل الاستقرار. بالنسبة للأدوية التي لديها آليات عمل قابلة للعكس ، يجب أيضا تسجيل فترة الاغتسال لتأكيد استعادة النشاط إلى مستويات خط الأساس ، وهو مؤشر على الأنسجة السليمة.
7. انقر فوق إيقاف لإنهاء التسجيلات.
8. التقاط صورة نهائية لتحديد المواقع من الأنسجة على MEA تحت المجهر في حالة تحول الأنسجة بعد إجراء إعداد التسجيل الأولي.

11. تنظيف الإعداد بعد التسجيل

1. تنظيف MEA.
   1. بعد الانتهاء من التسجيل، قم بإزالة محلول التسجيل برفق من طبق MEA باستخدام ميكروباينيت 1 مل.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم الاتصال أقطاب MEA التي يمكن أن تلحق الضرر بها.
   2. إزالة شبكة ومرساة القيثارة مع ملقط العظام (أو أي ملقط المنحني). ثم استخدم فرشاة الطلاء لطرد الأنسجة من سطح MEA دائما الحرص على عدم لمس microelectrodes الفردية.
   3. باستخدام زجاجة غسيل، اشطف طبق MEA برفق بالماء فائق النبور حوالي 3 إلى 4 مرات.
   4. تخزين MEA تنظيف مغمورة في المياه فائقة النبور في 4 °C.
2. شطف أنابيب النظام عن طريق تشغيل المياه فائقة النضر من خلال ذلك لمدة 5 دقائق على الأقل باستخدام الإعداد أقصى سرعة على مضخة التجبير.
   ملاحظة: لمنع نمو الفطريات، يجب ترك أي محلول الماء أو العازلة داخل الأنابيب بعد التنظيف.

12. تحليل التسجيلات MEA لقياس سان فاز تردد

1. افتح ملف البيانات المسجل المحفوظة في قالب "Beat_frequency_analysis" لبرنامج التحليل (الشكل 9) .
2. انقر على زر التشغيل والسماح للتسجيل بأكمله لتشغيل لتصور مجموعة البيانات وتعيين المعلمات التحليل المناسب.
   1. حدد إطار binning لتنسيق العرض المطلوب للبيانات، سواء تم عرضه كمتوسط لكل تتبع أو متوسط في كل مرة (الشكل 10A).
   2. حدد القنوات التي سيتم تضمينها في التحليل وتعيين الحد الأقصى للسعة المطلوبة أو قيم عتبة السعة المصغرة لتحديد ذروة الموجي الآلي(الشكل 10B).
      ملاحظة: يمكن تحديد قناة فردية أو مجموعة من القنوات أو جميع القنوات ال 64 للتحليل في هذه الخطوة(الشكل 9). إذا كانت قيم العتبة المحددة قريبة جدا من قيم الحد الأقصى للموجة وقيم التوابع، فقد لا يتم تحديد بعض قمم الشكل الموجي من خلال برنامج التحليل.
   3. تعيين مقدار وقت ما قبل الارتفاع وما بعد الارتفاع ليتم تضمينه في التحليل.
      ملاحظة: إعدادات 50 مللي ثانية قبل الارتفاع و 100 مللي ثانية بعد ارتفاع عادة ما تعمل بشكل جيد(الشكل 10B).
3. بعد تعيين شروط التحليل، انقر فوق الزر تشغيل مرة أخرى لإعادة تشغيل مجموعة البيانات وتأكيد أن معلمات التحليل مناسبة لاستخراج المسامير.
4. للتحليل، حدد الآثار الثلاثة الأكثر استقرارا على التوالي التي تظهر معدل ضرب مستقر لكل أثر عبر غالبية القنوات خلال فترة خط الأساس للتجربة وثلاثة آثار مستقرة متتالية أخرى خلال فترة التعرض للمخدرات(الشكل 10A).
5. حدد آثار البدء والنهاية للتحليل وأدخل المدة الزمنية لكل تتبع ليتم تحليله(الشكل 9).
6. قبل البدء في التحليل، حدد مربعات تمكين لكل من حفظ فوز في الدقيقة الواحدة وحفظ الفاصل الزمني interspike (الشكل 10B).
7. أدخل اسم الملف المطلوب في المربع تعديل اسم الملف ( الشكل10B). سيتم حفظ البيانات التي تم تحليلها لتردد النبض والفاصل الزمني بين البينية في شكل تنسيق ASCII (نص).
   ملاحظة: لتحليل الحالات المختلفة (مثل خط الأساس والاستجابة الدوائية)، يجب إجراء التحليل بشكل منفصل لكل حالة.
8. انقر فوق الزر تشغيل وتسجيل في شريط علامة التبويب العلوي لبدء التحليل.
9. لتصدير البيانات للتطبيقات الأخرى، حدد المربعات لحفظ فوز في الدقيقة الواحدة وحفظ الفاصل الزمني interspike (الشكل 10B). أدخل اسم الملف المطلوب في المربع تعديل اسم الملف ( الشكل10B) وانقر فوق حفظ لحفظ البيانات التي تم تحليلها بتنسيق نص ASCII في المجلد المحدد.

النتائج

بعد السماح للأنسجة بالتأقلم في الطبق لمدة 15 دقيقة ، يتم تسجيل 10 آثار دقيقة واحدة. يسجل بروتوكولنا الحالي النشاط لأكثر من ساعة، ولكننا سجلنا أنماط إطلاق مستقرة ل ≥4 ساعة في بيانات غير منشورة غير مبينة هنا. إذا كان التحضير التجريبي جيدا لجمع البيانات ، فيجب أن تظهر كل قناة تسجيل أشكال موجات متكررة متسقة ومتباعدة بالتساوي (أي طفرات) الشكل الموحد لقناة معينة(الشكل 11D). تتوافق هذه الأشكال الموجية مع دقات القلب الفردية التي تعكس نشاط الإيقاع القلبي الجوهري. يجب أن تكون الفواصل الزمنية بين القنو...

المناقشة

ممارسة واتقان عملية تشريح سان أمر حتمي لأن الأنسجة هشة والأنسجة السليمة ضرورية لتسجيل ناجح. أثناء تشريح سان، التوجه الصحيح ضروري للحصول على المنطقة المناسبة من الأنسجة. ومع ذلك ، يمكن بسهولة فقدان التوجه الأصلي للقلب أثناء عملية التشريح ، مما يعقد هذا المسعى. لذلك ، لضمان التوجه الصحيح بين اليسار واليمين ، يجب فحص الأذين بصريا. عادة، الأذين الأيمن يميل إلى أن يكون أكثر شفافية، في حين أن الأذين الأيسر عادة ما يكون أغمق وأكثر أحمر في اللون^25،48. وعلاوة على ذلك، فمن...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
4-Aminopyridine	Sigma	A78403-25G
22 إبرة حقنة	قياس فيشر Scientific	14-826-5A	تستخدم لتشريح
إبرة حقنة قياس 23	فيشر Scientific	14-826-6C	تستخدم لتشريح
أطباق بتري 60 مم	جينيسي Scientific	32-105G
500 مل زجاجة بيركس	فيشر العلمية	06-414-1C	تستخدم لتخزين الحلول
1000 مل زجاجة بيركس	فيشر Scientific	06-414-1D	تستخدم لتخزين الحلول
ملقط العظام	أدوات العلوم الدقيقة	16060-11
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub> & middot ؛ 2H 2 < / sub >O)	Sigma-Aldrich	C5080-500G
كربوجين (95٪ O 2< / sub > ، 5٪ CO2< / sub>) مقص
Castroviejo ، 4 "	أدوات العلوم	الدقيقة 15024-10
D- (+) -Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
الحصول على البيانات PC			وحدة المعالجة المركزية: Intel Xeon أو Intel Core i7 ، الذاكرة: 8 جيجابايت ، الأقراص الصلبة: 1 تيرابايت ، بطاقة الرسومات: NVIDIA أو على متن الطائرة ، الشاشة: 1920 × 1080
مجهر تشريح	Jenco
تشريح دبابيس	أدوات العلوم الدقيقة	26002-20
Dumont # 2 Laminectomy Litterps	أدوات العلوم الدقيقة	11223-20
Dumont # 55 Fulps	Fine Science	Tools 11295-51
أدوات العلوم الدقيقة للغاية من الملقط Graefe		11152-10
Glass Chamber	Grainger	49WF30	تستخدم للقتل الرحيم للماوس
Harp Anchor Kit	Warner Instruments	؛ SHD-22CL / 15 WI 64-0247
HCl	Fisher Chemicals	SA48-4	تستخدم لموازنة الأس الهيدروجيني
Hemostat	Fine Science	Tools 13013-14
Heparin	Aurobindo Pharma Limited IDA ، Pashamylaram	NDC 63739-953-25
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
المجهر المقلوب	Motic	AE2000
إيزوفلوران	باترسون بيطري	07-893-1389
شريط مختبر	فيشر العلمي	15-950
ضوء لمجهر التشريح	دولان جينر	MI150DG 660000391014
كلوريد الماغيسيوم (MgCl2< / sub>)	سيجما ألدريتش	208337-100G
MED64 مضخم الرأس	MED64	MED-A64HE1S
مكبر للصوت الرئيسي MED64		MED-A64MD1A
MED64 غطاء التروية	MED64	MED-KCAP01
MED64 طقم حامل أنابيب التروية	MED64	MED-KPK02
MED64 ThermoConnector	MED64	MED-CP04
Mesh	Warner Instruments	640246
مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) Alpha	Med Scientific	MED-R515A
Mobius Software	WitWerx Inc.		برنامج محدد ل MED64
NaOH	Fisher Chemicals	S320-500	يستخدم لموازنة الأس الهيدروجيني
العادي	Salte Ultigiene	NDC 50989-885-17
فرشاة الطلاء	فيشر العلمية	NC1751733
بارافيلم	جينيسي Scientific	PM-996
مضخة التمعج	جيلسون	F155009
أنابيب المضخة التمعجية	فيشر العلمية	14-171-298	1/8 '' القطر الداخلي
البولي إيثيلين	سيجما	P3143
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	سيجما ألدريتش	P9333-500G
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2< / sub>PO4< / sub>)	سيجما ألدريتش	P5655-500G
الصوديوم بيكربونات	سيجما	S6297
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	فيشر Scientific	S671-3
Sylgruard Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5 كجم
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة	Sigma	S6566
رباعي الصوديوم	Sigma	S9640
مقص جراحي	أدوات	العلوم الدقيقة14074-09
ماصات النقل (3 مل) سامكو	ساينتفيك	225