يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنتاج سريع وبأسعار معقولة وغير معقد من ليسات خالية من الخلايا البكتيرية

4.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62753

⸱

أكتوبر 29, 2021

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لإنتاج اليزحات البكتيرية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا ، وذلك باستخدام سلالة هندسية من الإشريكية القولونية وتتطلب معدات مختبرية قياسية فقط.

الملخص

التعبير الجيني الخالي من الخلايا يوفر قوة البيولوجيا دون مضاعفات الكائن الحي. على الرغم من وجود العديد من أنظمة التعبير الجيني هذه ، فإن معظمها مكلف للغاية لشراء و / أو تتطلب معدات خاصة وخبرة شحذ بدقة لإنتاج فعال. يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج ليسات خالية من الخلايا البكتيرية تدعم مستويات عالية من التعبير الجيني ، وذلك باستخدام معدات المختبر القياسية فقط وتتطلب الحد الأدنى من المعالجة. تستخدم الطريقة سلالة الإشريكية القولونية التي تنتج الإندوريسين الذي لا يؤثر على النمو ، ولكنه يقوم بكفاءة بفرز بيليه الخلية المحصودة بعد دورة تجميد ذوبان بسيطة. والمعالجة الإضافية الوحيدة المطلوبة هي حضانة قصيرة يتبعها الطرد المركزي لتطهير الخلايا من الحطام الخلوي. يمكن تحقيق الدوائر الجينية الديناميكية من خلال التعبير عن heterologous من protease ClpX في الخلايا قبل الحصاد. يمكن استخدام سلالة الإشريكية القولونية التي تفتقر إلى جين lacZ لتطبيقات الاستشعار الحيوي عالية الحساسية والخالية من الخلايا باستخدام قراءات ملونة أو فلورية. يتطلب البروتوكول بأكمله ما لا يزيد عن 8-9 ساعات ، مع 1-2 ساعة فقط من العمل العملي من التطعيم إلى الانتهاء. ومن خلال خفض التكلفة والوقت للحصول على ليسات خالية من الخلايا، ينبغي أن تزيد هذه الطريقة من القدرة على تحمل تكاليف التعبير الجيني الخالي من الخلايا لمختلف التطبيقات.

المقدمة

التعبير الجيني في الخلايا الخالية من الخلايا lysates له العديد من المزايا على استخدام الخلاياالحية1،2،3،4. يمكن تعديل اللسات بسهولة كيميائيا حيوية واستخدامها في ظروف يمكن أن تكون ضارة أو مستحيلة التحقيق في الخلايا الحية. لا يتعين على دوائر التعبير الجيني أن تتنافس أو تتنافس مع العمليات البيولوجية المضيفة، واختبار الدوائر الجينية الجديدة بسيط مثل إضافة الحمض النووي. لهذه الأسباب، وجدت التعبير الجيني الخالي من الخلايا تطبيقات مختلفة، من أجهزة الاستشعارالحيوية 5،6 إلى النماذج الأولية بسرعة دوائر الجينات الاصطناعية7،8 لتطوير الخلايا الاصطناعية9. معظم التعبير الجيني الخالي من الخلايا يستخدم الخلايا الlysates التي تم تجهيزها بشكل كبير، تتطلب عموما بروتوكولات طويلة ومعقدة، والمعدات المتخصصة، و / أو الخطوات الحساسة التي يمكن أن تؤدي إلى اختلاف كبير بين المستخدمين والدفعات10،11.

تصف هذه الورقة طريقة بسيطة وفعالة لإنتاج lysate خالية من الخلايا التي تتطلب الحد الأدنى من المعالجة والخبرة (الشكل 1A)12. تعتمد الطريقة على خلايا الإشريكية القولونية التي تم تصميمها للليس بعد دورة تجميد ذوبان بسيطة. الخلايا تعبر عن انداليسين من لامبدا phage التي تتحلل جدار الخلية. كما تنمو الخلايا, هذا الإندولاسين لا يزال في السيتوبلازم, عزل من جدار الخلية. ومع ذلك ، فإن دورة التجميد والذوبان البسيطة تعطل الغشاء السيتوبلازمي ، وتطلق الإندوريسين في periplasm ، حيث تتحلل جدار الخلية ، مما يؤدي إلى تحلل سريع للخلية. يمكن الانتهاء من البروتوكول مع بضع ساعات فقط من العمل العملي ويتطلب فقط ثلاجة، جهاز طرد مركزي قادر على 30،000 × غرام (للحصول على نتائج مثالية؛ يمكن استخدام سرعات أقل مع مزيد من الرعاية لعدم إزعاج بيليه)، خلاط دوامة، ومحلول عازل بسيط. يمكن حتى أن تنتج lysate وظيفية عن طريق تجميد تجفيف الخلايا وإعادة ترطيب لهم في الموقع. ومع ذلك، تنتج هذه الطريقة lysates مع نشاط أقل، ويفترض أن يرجع ذلك إلى حطام الخلية المتبقية.

الlysates نشطة للغاية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا ، ويمكن تعزيزها بطرق مختلفة اعتمادا على الاستخدام النهائي. يمكن زيادة معدل تخليق البروتين عن طريق تركيز اليزيت باستخدام المكثفات الدورانية القياسية. يمكن حماية الحمض النووي الخطي من التدهور عن طريق إضافة بروتين GamS المنقى. يمكن تحقيق تدهور البروتين ، الضروري لديناميكيات الدوائر الأكثر تعقيدا مثل التذبذب ، من خلال التعبير المشترك عن سداسي ClpX في سلالة إنتاج التحلل التلقائي13. وأخيرا، يتم تمكين قراءات البصرية المستندة إلى LacZ باستخدام سلالة autolysate تفتقر إلى lacZ. بشكل عام، ينتج هذا الأسلوب lysate الخالية من الخلايا النشطة للغاية التي تناسب مجموعة واسعة من التطبيقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الوسائط والمخازن المؤقتة.

  1. إعداد المتوسطة 2xYTPG.
    1. مزيج 62 غ 2xYT مسحوق، 5.99 غرام فوسفات البوتاسيوم أحادية، 13.93 غرام فوسفات البوتاسيوم ديباسيك، والمياه deionized إلى 2 L.
    2. الأوتوكلاف على دورة السائل مع وقت التعرض من 30 دقيقة14.
    3. إلى 400 مل من وسائط 2xYTP من 1.1.2، أضف 7.2 غرام من الجلوكوز D (دكستروز) واخلط حتى يذوب.
    4. تصفية تعقيم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
  2. إعداد المخزن المؤقت S30A.
    1. مزيج تريس-HCl (pH 7.7, 50 mM التركيز النهائي), الغلوتامات البوتاسيوم (60 mM النهائي), وجلوتامات المغنيسيوم (14 mM النهائي).
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.7 باستخدام 10 M KOH.
  3. إعداد الحل 1 (انظر الجدول 1).
    1. ريسوسبند 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1- حمض بيبرازينيثانسولفونيك (HEPES) في 2 مل من الماء.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 باستخدام KOH.
    3. إضافة كافة المكونات الأخرى من الجدول 1.
    4. ضبط درجة الحموضة إلى 7.6 باستخدام 10 M KOH. تصفية التعقيم.
  4. إعداد حل بريميكس 2.5x (انظر الجدول 2).
    1. خلط جميع المكونات في الجدول 2.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام KOH.
    3. Aliquot وتجميد عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يستخدم رد فعل 20 ميكرولتر 8.9 ميكرولتر من بريميكس.

2. إعداد الخلايا.

  1. الصق الخلايا المهدرجة تلقائيا على لوحات أجار LB التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل أمبيسلين باستخدام حلقة تلقيح وتنمو عند 37 درجة مئوية (انظر الملاحظة 1).
  2. اختيار مستعمرة واحدة في ثقافة بداية من LB / ampicillin المتوسطة باستخدام طرف pipet وتنمو في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. تلقيح 400 مل من 2xYTPG المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين مع 400 ميكرولتر من ثقافة المبتدئين، وتنمو عند 37 درجة مئوية في قارورة 1 L Erlenmeyer، تهتز في 300 دورة في الدقيقة.
  4. قياس الكثافة البصرية للثقافة بشكل دوري عند 600 نانومتر (OD600)باستخدام مطياف لقراءة cuvette بصري بطول مسار 1 سم. عندما يتجاوز OD600 1، ابدأ في تمييع الثقافة 5 أضعاف قبل القياسات لضمان بقاء القياسات ضمن النطاق الخطي لمطياف مختبر نموذجي. مواصلة نمو الخلايا حتى الثقافة المخففة 5 أضعاف تصل إلى OD600 من 0.3 (المقابلة لثقافة OD600 من 1.5).

3. إعداد الياء.

  1. إعداد المخزن المؤقت S30A تكملها مع 2 م dithiothreitol (DTT). مزيج 3 مل من المخزن المؤقت S30A مع 6 ميكرولتر من محلول مخزون DTT في 1 M. مكان على الجليد للاستخدام في الخطوة 3.7.
  2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1800 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تجاهل supernatant عن طريق صب تشغيله واستخدام ماصة لإزالة أي السائل المتبقية.
  4. Resuspend بيليه في 45 مل من البرد (4-10 درجة مئوية) S30A العازلة باستخدام خلاط دوامة.
  5. وزن أنبوب طرد مركزي فارغ 50 مل، ونقل الخلايا إليه، وتكرار الخطوات 3.2-3.3 لغسل الخلايا.
  6. وزن بيليه، طرح وزن أنبوب فارغ 50 مل. تأكد من تنشق بعناية أي supernatant المتبقية لضمان قياس دقيق للوزن بيليه.
    ملاحظة: العائد النموذجي هو ~ 1.3 غرام من بيليه الخلية من 400 مل من ثقافة الإنتاج.
  7. إضافة 2 وحدات التخزين المؤقت S30A الباردة تكملها مع 2 م dithiothreitol، أي 2 مل من العازلة لكل 1 غرام من بيليه الخلية، وإعادة إنفاق الخلايا عن طريق خلط دوامة بقوة.
  8. تجميد الخلايا. ضع أنبوب 50 مل الذي يحتوي على الخلايا في ثلاجة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى يتم تجميد الكريات تماما.
    ملاحظة: خطوة التجميد نقطة توقف جيدة لهذا اليوم.
  9. إذابة الخلايا في حمام مياه درجة حرارة الغرفة.
  10. دوامة بقوة لمدة 2-3 دقائق.
  11. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز في 300 دورة في الدقيقة.
  12. مسح عينة الحطام الخلوي الثقيل عن طريق الطرد المركزي في أنابيب الطرد المركزي الشفافة عند 30,000 × غرام لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: إذا لم يتوفر جهاز طرد مركزي قادر على 30000 x g، فإن جهاز الطرد المركزي لمدة 45 دقيقة عند 21000 × غرام،واستخدم المزيد من الحذر في الخطوة 3.13، حيث ستكون الكريات أقل إحكاما.
  13. نقل بعناية supernatant إلى أنبوب جديد مع pipet، وتجنب إزعاج بيليه قدر الإمكان. إذا كان المتسخ المنقول ملوثا بمواد من الكريات ، كرر الخطوة السابقة.
  14. نقل الناطور الفائق إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 21000 × غرام (أو السرعة القصوى لأجهزة الطرد المركزي الطاولة) لمدة 5 دقائق.
  15. Aliquot مسح autolysate في وحدات التخزين المطلوبة، وتجنب بعناية أي بيليه المتبقية، وتجميد في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.
    ملاحظة: يستخدم رد فعل واحد 20 ميكرولتر 8 ميكرولتر من التولير التلقائي.

4. التعبير الجيني الخالي من الخلايا

ملاحظة: autolysate الآن جاهزة لأية نهاية الاستخدام المطلوب. فيما يلي مثال بروتوكول قياسي للتعبير الجيني الخالي من الخلايا.

  1. لتفاعل 20 ميكرولتر، اخلط على الجليد 8 ميكرولتر من التوليت التلقائي و8.9 ميكرولتر من بريميكس. انظر ملاحظة في نهاية قسم البروتوكول فيما يتعلق بتحسين الغلوتامات المغنيسيوم وتركيزات PEG 8000.
  2. أضف الحمض النووي (على سبيل المثال، pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 إلى تركيز نهائي قدره 8 nM)، وأية كاشفات أخرى، والماء إلى 20 ميكرولتر.
  3. ضع التفاعل في لوحة صغيرة 384 جيدا ويقيس مسار وقت الفلورسينس و/ أو نقاط النهاية باستخدام قارئ لوحة. بالنسبة للبروتين الفلوري الأخضر (GFP)، استخدم طول موجي مثير قدره 485 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 520 نانومتر.

5. تعديلات البروتوكول

ملاحظة: التعديلات التالية من البروتوكول تمكينه من خدمة التطبيقات الأخرى.

  1. التعبير الجيني الخالي من الخلايا باستخدام قوالب الحمض النووي الخطية
    1. تنفيذ الخطوات في القسم 4، واستكمال رد الفعل مع 2.2 ميكرومتر بروتين GamS المنقى (أعرب وتنقيتها كما هو موضح12)قبل إضافة الحمض النووي الخطي.
  2. التعبير الجيني الخالي من الخلايا الذي يتضمن تدهور البروتين
    1. في الخطوة 2.1، استخدم خلايا التشحيح التلقائي التي تحتوي على pACYC-FLAG-dN6-His (انظر جدول المواد). في جميع وسائل الإعلام النمو، بالإضافة إلى ذلك تشمل 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول.
    2. في الخطوة 2.3، وتشمل 40 ميكرومتر ايزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيارانوسيد (IPTG) في المتوسط النمو للحث على التعبير من البلازميد.
    3. كرر الخطوات 3.2-3.4 (الغسيل) مرتين إضافيتين (لما مجموعه ثلاثة يغسل) لضمان إزالة كاملة من الكلورامفينيكول، وهو مثبط الترجمة. بالنسبة للغسيلين الأولين (الخطوة 3.4)، استبدل المخزن المؤقت S30A بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.4).
    4. في الخطوة 4.2, تكملة مع ATP 3M إضافية (يضاف من محلول الأسهم من ATP 100 mM في الماء, درجة الحموضة 7.2) و 4.5 mM الغلوتامات المغنيسيوم (باستخدام محلول الأسهم 1 M في الماء) (التركيزات النهائية) للتعويض عن استخدام ATP عالية من قبل ClpXP, فضلا عنchelation المغنيسيوم من قبل ATP إضافية.
  3. التعبير الجيني الخالي من الخلايا باستخدام قراءات تستند إلى LacZ (بما في ذلك colorimetric)
    1. في الخطوة 2.1، استخدم خلايا الملبد التلقائي التي لا تعبر عن LacZ (راجع جدول المواد).
  4. بدلا من ذلك، قم بإعداد اللحواف مباشرة من الخلايا المجففة بالتجميد.
    1. تنفيذ كافة الخطوات من 1.1 إلى 3.7.
    2. مزيج 8 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 8.9 ميكرولتر من بريميكس.
    3. إضافة الحمض النووي البلازميد (إذا رغبت في ذلك)، والكواشف المخصصة الأخرى، والماء للوصول إلى حجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    4. نقل رد الفعل إلى لوحة صغيرة 384 جيدا وتجميد الجافة.
      ملاحظة: يمكن تخزين عينات مجففة بالتجميد لمدة تصل إلى أسبوع وربما لفترة أطول.
    5. لبدء رد الفعل، إعادة ترطيبه مع 18 ميكرولتر من الماء deionized تكملها مع أي الحمض النووي المطلوب أو الكواشف الأخرى.
    6. اتبع ديناميات الفلورسينس في قارئ لوحة.

ملاحظة 1: تم تصميم الخلايا التلقائية للليس على دورة تجميد ذوبان الجليد، لذلك من المهم بشكل خاص لاستخدام cryoprotectant عند صنع المخزونات المجمدة. نحن جمدت الأسهم في 24٪ wt/vol glycerol وتخزينها في -80 درجة مئوية.

ملاحظة 2: أيونات المغنيسيوم و PEG 8000 حاسمة لأداء lysate. قاعدة 2.5x بريميكس، استنادا إلى البيانات المنشورة سابقا، يحتوي على 6 مليمتر الغلوتامات المغنيسيوم و 4.8٪ wt/vol PEG 8000، والتي تصبح 2.4 mM و 1.9٪، على التوالي، في رد الفعل النهائي. ال تحليل تلقائي أعدت مع البروتوكول هنا عادة ما يؤدي أفضل مع إضافية 5 مللي متر ملغ الغلوتامات و 1.5٪ PEG 8000 في رد الفعل النهائي. ومع ذلك، يمكن تحسين هذا في نطاق إضافية 0-10 مللي متر ملغ الغلوتامات وإضافية 0-3٪ PEG 8000 (مقارنة مع premix قاعدة). لإعداد بريميكس مع الموصى بها إضافية 5 مللي متر ملغ الغلوتامات و 1.5٪ PEG 8000 (التركيزات النهائية)، مزيج 380 ميكرولتر من بريميكس مع 4.75 ميكرولتر من الغلوتامات المغنيسيوم في 1 M و 36.1 ميكرولتر من PEG 8000 في 40٪ الوزن / الحجم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويمكن ملاحظة النتائج التمثيلية باستخدام autolysate للتعبير عن GFP من البلازميد التعبير التأسيسي، وهنا pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500، وتسجيل مسار زمني من مضان GFP في قارئ لوحة(الشكل 1B). وجدت سلسلة تمييع الحمض النووي البلازميد تعبيرا قويا حتى في الحمض النووي 1 nM. بالمقارنة مع lysate المتاحة تجاريا، يمكن أن تنتج autolysate عائد إجمالي أكبر وحققت معدل إنتاج أكبر الحد الأقصى، محسوبة كمشتق الوقت من الدورة الزمنية GFP(الشكل 1C،D). للحصول على نتائج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

البروتوكول الموصوف هنا ينتج lysate البكتيرية نشطة للغاية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا. المفتاح هو استخدام الخلايا التي تحمل pAD-LyseR البلازميد، الذي يعبر عن لامبدا فاج إندوليسين سيوليكالي. هذه الخلايا هي قوية لlyse أنفسهم عند permeabilization من الغشاء الداخلي، مما يسمح للاندوريسين الوصول إلى جدار الخلية، والتي تحقق هذه الطريقة من خلال دورة تجميد ذوبان بسيطة. لأن الخلايا lyse نفسها بشكل فعال، ويشار إلى المنتج كما autolysate. بعد أن يتم مسح الخلايا ، فإن الخطوات الوحيدة المتبقية هي الحضانة والطرد المركزي لمسح التخلص ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

J.H. هو المؤسس المشارك لشركة GenCirq Inc، التي تركز على علاجات السرطان. وهو عضو في مجلس الإدارة ولديه أسهم في GenCirq.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفان زاكاري صن وريتشارد موراي (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) على التكرم بتوفير جهاز P_araBAD-gamS، وكيكو كامي (معهد كيوتو للتكنولوجيا) لتكرمهم بتوفير جهاز طرد مركزي عالي السرعة للتبريد. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة ومن برنامج ARO MURI، وتم دعمه جزئيا من قبل المبادرة الرائدة للباحثين الشباب الممتازين، MEXT، اليابان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسائط 2xYTEMD Millipore4.85008أو ما يعادلها
3-PGASigma AldrichP8877أو ما يعادلها
من وحدة مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra-15 ، قطع 3 كيلو دالتونMillipore SigmaUFC900308اختياري ، يمكن استخدامها لتركيز المحللة ، وتحديد سعة المكثف المناسبة للحجم المراد تركيزه
أمبيسلينسيجما ألدريتشA0166-5Gأو كاربينيسيلين ، متغير أكثر استقرارا
ATPSigma AldrichA8937أو ما يعادله
cAMPSigma AldrichA9501أو ما يعادله
CoASigma AldrichC4282أو ما يعادله
CTPUnited States Biosciences14121أو ما يعادله
D-glucose (سكر العنب)فيشر ScientificAAA1749603أو ما يعادله
ديثيوثريتول (DTT)سيجما ألدريتشD0632-1Gأو ما يعادله
الإشريكية القولونية BL21-Gold (DE3) التي تحمل pAD-LyseRAddgene99244
الإشريكية القولونية BL21-Gold (DE3) & Delta ؛ lacZ يحمل pAD-LyseRAddgene99245
حمض الفولينيكSigma AldrichF7878أو ما يعادله
GTPUnited States Biosciences16800أو ما يعادله
HEPESSigma AldrichH3375-25Gأو ما يعادله
LB mediaFisher ScientificDF0446075أو ما يعادله
من غلوتاماتالمغنيسيومسيجما ألدريتش49605-250Gأو ما يعادله
NADSigma AldrichN6522أو ما يعادله
من غلوتامات البوتاسيومSigma AldrichG1501-100Gأو ما يعادله
من هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gلضبط درجة الحموضة
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةFisher ScientificBP363-500أو ما يعادله
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةفيشر ScientificBP362-500أو ما يعادله
SpermidineSigma Aldrich85558أو ما يعادله
Tris-HClFisher Scientific9310500GMأو ما يعادله
من مزيج الحمض النووي الريبيRoche10109541001أو ما يعادله
UTPالولايات المتحدة Biosciences23160أو ما يعادله
أو

المراجع

  1. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  2. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  3. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  4. He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  8. Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
  9. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027(2018).
  10. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).
  11. Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
  14. Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
  15. Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  16. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).
  17. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Escherichia Coli ClpX
إنتاج سريع وبأسعار معقولة وغير معقد من ليسات خالية من الخلايا البكتيرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.