Method Article

مضان المجهر لات الداخلي ATP بوساطة Macropinocytosis في خلايا الورم البشري والفئران الورم xenografted

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورنا طريقة قابلة للاستنساخ لتصور استيعاب ثلاثي الفوسفات ثلاثي الأدينوزين الفلوري غير القابل للهيدروليزين (ATP)، وهو بديل ATP، بدقة خلوية عالية. لقد أثبتنا صحة طريقتنا باستخدام المختبر المستقل وفي أجهزة قياس الجسم الحي وخطوط خلايا الورم البشرية والفئران ذات المناعة xenografted بأنسجة الورم البشري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP), بما في ذلك ATP خارج الخلية (eATP), وقد ثبت أن تلعب أدوارا هامة في جوانب مختلفة من الورم, مثل مقاومة الأدوية, الانتقال الظهاري-المتوسطي (EMT), والانبثاث. eATP داخل الرحم هو 103 إلى 104 مرات أعلى في التركيز مما كانت عليه في الأنسجة العادية. في حين أن eATP يعمل كرسول لتنشيط الإشارات التنقية لتحريض EMT ، إلا أنه يتم استيعابه أيضا من قبل الخلايا السرطانية من خلال داء الماكروبينوسيتوزية الممضوم ، وهو نوع محدد من الغدد الصماء ، لأداء مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية. وتشمل هذه الوظائف توفير الطاقة لتفاعلات البيوكيميائية ATP التي تتطلب، والتبرع مجموعات الفوسفات أثناء نقل الإشارات، وتسهيل أو تسريع التعبير الجيني كمتبرع مساعد النسخ. ATP متاح بسهولة، والدراسة في السرطان وغيرها من المجالات سوف تزيد بلا شك. ومع ذلك، لا تزال دراسة eATP في مرحلة مبكرة، ولا تزال الأسئلة التي لم يتم حلها دون إجابة قبل أن يتم كشف الأنشطة الهامة ومتعددة الاستخدامات التي يقوم بها eATP وATP الداخلية بالكامل.

وتشمل مساهمات مختبرات هؤلاء المؤلفين في هذه الدراسات eATP في وقت مبكر التصوير المجهري من ATP الفلورسنت غير القابلة للتحلل، إلى جانب عالية ومنخفضة الجزيئية الوزن الفلورسنت دكسترانس، والتي هي بمثابة مثبطات التناضح الكلي والغدد الصماء، فضلا عن مثبطات الغدد الصماء المختلفة، لرصد وتوصيف عملية الاستيعاب eATP. تم تطبيق طريقة التصوير هذه على خطوط الخلايا السرطانية وعلى الفئران ذات المناعة ، التي تم نقلها بأورام سرطان الإنسان ، لدراسة استيعاب eATP في المختبر وفي الجسم الحي. تصف هذه الورقة هذه البروتوكولات في المختبر وفي الجسم الحي ، مع التركيز على تعديل وصقل شروط الفحص بحيث يمكن إجراء اختبارات الاستيعاب eATP بوساطة macropinocytosis /endocytosis بنجاح في أنظمة مختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم مؤخرا امتصاص الانتهازية من المواد الغذائية خارج الخلية داخل الرحم (أي) اسمه السمة المميزة الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للسرطان1. واحدة من هذه العناصر الغذائية الهامة ATP، كما تركيز ieATP هو 103 و 104 مرات أعلى من تلك الموجودة في الأنسجة الطبيعية، في نطاق عدة مئات من ميكرومتر إلى mMمنخفضة 2،3،4،5. كجزيء الطاقة والإشارات الرئيسية، ATP يلعب دورا مركزيا في التمثيل الغذائي الخلوي في الخلايا السرطانية والصحية6،7،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة هنا وفقا لIACUC جامعة أوهايو ومع المعاهد القومية للصحة.

1. اختيار ATP الفلورسنت غير قابلة للهيدروليز (NHF-ATP) وديكسترانس

  1. حدد متتبعات الفلوروفورية المترافقة NHF-ATP(الشكل 1A)ومتتبعات الاندواس، والفلورسنت عالي ومنخفض الوزن الجزيئي (TMR-HMWFD و TMR-LMWFD) (الشكل 1B)،استنادا إلى أطوال الموجات الفلورية المفضلة (على سبيل المثال، نظام التصوير المجهز بفلاتر مناسبة) وعملية التنظير المحيطي المحددة التي سيتم دراستها.

2. دراسات توطين ATP، في المختبر (الشكل 2)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في المختبر دراسة
وقد تجلى الاستيعاب داخل الخلايا لNHF-ATP من خلال المشاركة في توطين NHF-ATP مع HMWFD أو LMWFD(الشكل 4). يعتمد نجاح هذا الإجراء في المقام الأول على استخدام تركيزات مناسبة من NHF-ATP و dextrans وعلى تحديد النوع (الأنواع) المناسبة من dextrans (بولي ليسين مقابل محايد). على سبيل المثال، للتحقيق macropinocytosis، تم اختيار HMWFD كما يتم استيعابها فقط من قبل macropinosomes13،14<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة للتحليل المكاني والزمني والكمي للتدخيل الخلوي ل ATP غير القابل للهيدروليز. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع للاستخدام في النظم البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك مختلف النماذج الورمية، والتي نقدم لها التعليم التقني والبيانات التمثيلية. للحصول على بيانات قابلة للتفسير أثناء دراسات استيعاب ATP في الجسم الحي (القسم 4 من البروتوكول) ، من الأهمية بمكان الحد من الوقت التجريبي المنقضي من حقن ديكتران داخل الرحم إلى تضمين التبريد. إصلاح الشرائح الأنسجة بعد الورم المقطع- هو خطوة ضرورية قبل التصوير المجه.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء عملية استئصال الأعصاب في الموقع في جامعة أوهايو علم الأمراض الهستوباثولوجية الأساسية. وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بدء التشغيل (جامعة أوهايو كلية الآداب والعلوم) إلى نيلسن C; المعاهد القومية للصحة منح R15 CA242177-01 وجائزة RSAC لX تشن.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
خلايا A549 ، ظهارة الرئة البشرية ، سرطانالمعهد الوطني للسرطانغيرأقل تكلفة
الأسيتونفيشر العلميةS25904
، رينولدزغرينجر6CHG6
وسط تركيب مائي ، كاشف طويل الذهب المضاد للبهتانThermoFisherP36930
ATP التناظريةجينا بيولوجيسNK-101
الأوتوكلاف ، معقمGrainger33ZZ40
شفرات ، ناجمد ، رفيع المستوىC.L. Sturkey، Inc.DT554550
الفرجار ، الورنيةGrainger4KU77
خلية متوسطة ، خليط المغذيات لحم الخنزير F12 ،Millipore Sigma51651C-1000ML
من المصل ، مبرد مع دوار دلو متأرجحEppendorf5810R
ChloroformAcros Organics423555000
أنبوب مخروطي الشكل ، 15 ملVWR21008-216
أنبوب مخروطي الشكل ، 50 ملVWR21008-242
أغطية ، زجاج ، 12 ممCorning2975-245
Cryost ، Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
مسح مهام دقيق ، مناديل كيم مبللةKimberly-Clark34155
Dextran، Lysine قابلة للإصلاح ، الوزن الجزيئي العالي (HMW)InvitrogenD1818ميغاواط = 70,000 ، رباعي ميثيل رودامين
ديكستران ، محايد ، الوزن الجزيئي العالي (HMW)إنفيتروجينD1819
النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) ، فيشرساينتفيك11885076
التسليم المحليطلب
نظام التصوير epifluorescent ، نيكون NiU وبرنامج اقتناء Nikon NIS Elementsنيكونطلب
الإيثانولفيشر العلميBP2818-4
مصل الأبقار الجنيني (FBS) ملقط16000044ThermoFisher
، Dumont # 7 ،أدوات العلوم الدقيقة11274-20
ملقط ، Dumont # 5 ،أدوات العلوم الدقيقةالمستقيمة 11254-20
قفازات (صغيرة ، متوسطة ، كبيرة)MicroflexN191 ، N192 ، قفازات N193
، MAPA Temp-Ice 700 Thermal (للتعامل مع الثلج الجاف)Fisher Scientific19-046-563
DaiggerEF16034F EA
Incubator ، زراعة الخلاياEppendorfGalaxy 170 S
شريط وضع العلاماتFisher Scientific159015R
قلم الوسم ، Sharpie (فائق النعومة)الدبابيس642736
الفئران ، نقص المناعة (Nu / J)مختبر جاكسون2019
طرد مركزي دقيق ، accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
أنابيب Microcentrifgue ، أنابيب Eppendorf (1.5 مل)شرائح مجهر AxygenMCT-150-C
Fisher Scientific50-751-4983
إبرة ، مقياس 27Becton-Dickinson752 0071
فرشاة الرسمGrainger39AL12
مناشف ورقيةدبابيس33550
ParaformaldehydeAcros Organics416785000
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140122
ملعقة مثقبة ، قطر 15 مم ، طول 135 ممشركة Roboz Surgical Instrument Co.RS-6162
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)نصائح ماصة فيشر ScientificBP3991
(10 & mu; L)فيشر Scientific02-707-438
نصائح Pipet (200 & mu ; L)فيشر Scientific02-707-411
نصائح Pipet (1000 & mu ; L)فيشر Scientific02-707-403
Pipets ، مصلي (10 مل)VWR89130-910
Pippetor ، Gilson P2DaiggerEF9930A
Pipettor Starter Kit ، جيلسون (2-10 & mu ؛ لتر ، 20-200 مو ؛ لتر ، 200-1000 مو ؛ L)DaiggerEF9931A
- مداري ، منضدةCole-ParmerEW-51710-23
شرائح مجهر موجبة الشحنة ، مشرط SuperfrostFisher Scientific12-550-15
، مقاس 10 ، Surgical Design، Inc.مقص فيشر Scientific22-079-707
، أدوات العلوم الدقيقة الجراحية - الحادة والمنحنية14005-12
برنامج لتحليل الصور ، برنامج نيكون Elementsنيكونللطلب
المخصص لتحليل الصور ، ImageJ (فيجي)المعاهد الوطنية للصحةبدونتنزيل عبر الإنترنت (مجانا)
قرص عينة 30 مم (حامل تشاك) ، ملحق ناظم البرد14047740044Leica Biosystems
431111أطباق المقايسة الحيوية 245
مم ، شريط309623بيكتون ديكنسون
1 سم مكعب ، مختبر ، عرض 19 ممفيشر ساينتفيك15-901-5R
مؤقتفيشر سينتيفيك14-649-17
طبق زراعة الأنسجة ، قطر100 × 15 مم08-757-100D
، 225 سم 2< / sup>159933ThermoFisher
الأنسجة 353226بيكتون ديكنسون 24
جيدا ، الفولاذ المقاومللصدأ Tissue Tek4161
وسط تجميد الأنسجة ، درجة حرارة القطع المثلى (OCT)فيشر Scientific4585
التربسين EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك) ، 0.25٪جيبكو25200072
حمام مائي ، بريسيشن GP2S ThermoFisherTSGP2S
مصدر رقائق الألومنيوم جهاز طرد مركزي الخالي وسط الجاف الخالي من المصلمخصصمخصص المنحنية جهاز صندوق شاكر منصة صينية تلطيخ ، حقنة قارورة زراعة الأنسجة فيشر Scientific لوحة زراعة الأنسجة ، قالب تضمين

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyATP InternalizationMacropinocytosisHuman Tumor CellsTumor Xenograft MiceExtracellular ATPEndocytosis TracersFluorescent DextranEpifluorescence ImagingCryosectioning Procedure

Related Articles