Method Article

مضان المجهر لات الداخلي ATP بوساطة Macropinocytosis في خلايا الورم البشري والفئران الورم xenografted

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورنا طريقة قابلة للاستنساخ لتصور استيعاب ثلاثي الفوسفات ثلاثي الأدينوزين الفلوري غير القابل للهيدروليزين (ATP)، وهو بديل ATP، بدقة خلوية عالية. لقد أثبتنا صحة طريقتنا باستخدام المختبر المستقل وفي أجهزة قياس الجسم الحي وخطوط خلايا الورم البشرية والفئران ذات المناعة xenografted بأنسجة الورم البشري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP), بما في ذلك ATP خارج الخلية (eATP), وقد ثبت أن تلعب أدوارا هامة في جوانب مختلفة من الورم, مثل مقاومة الأدوية, الانتقال الظهاري-المتوسطي (EMT), والانبثاث. eATP داخل الرحم هو 103 إلى 104 مرات أعلى في التركيز مما كانت عليه في الأنسجة العادية. في حين أن eATP يعمل كرسول لتنشيط الإشارات التنقية لتحريض EMT ، إلا أنه يتم استيعابه أيضا من قبل الخلايا السرطانية من خلال داء الماكروبينوسيتوزية الممضوم ، وهو نوع محدد من الغدد الصماء ، لأداء مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية. وتشمل هذه الوظائف توفير الطاقة لتفاعلات البيوكيميائية ATP التي تتطلب، والتبرع مجموعات الفوسفات أثناء نقل الإشارات، وتسهيل أو تسريع التعبير الجيني كمتبرع مساعد النسخ. ATP متاح بسهولة، والدراسة في السرطان وغيرها من المجالات سوف تزيد بلا شك. ومع ذلك، لا تزال دراسة eATP في مرحلة مبكرة، ولا تزال الأسئلة التي لم يتم حلها دون إجابة قبل أن يتم كشف الأنشطة الهامة ومتعددة الاستخدامات التي يقوم بها eATP وATP الداخلية بالكامل.

وتشمل مساهمات مختبرات هؤلاء المؤلفين في هذه الدراسات eATP في وقت مبكر التصوير المجهري من ATP الفلورسنت غير القابلة للتحلل، إلى جانب عالية ومنخفضة الجزيئية الوزن الفلورسنت دكسترانس، والتي هي بمثابة مثبطات التناضح الكلي والغدد الصماء، فضلا عن مثبطات الغدد الصماء المختلفة، لرصد وتوصيف عملية الاستيعاب eATP. تم تطبيق طريقة التصوير هذه على خطوط الخلايا السرطانية وعلى الفئران ذات المناعة ، التي تم نقلها بأورام سرطان الإنسان ، لدراسة استيعاب eATP في المختبر وفي الجسم الحي. تصف هذه الورقة هذه البروتوكولات في المختبر وفي الجسم الحي ، مع التركيز على تعديل وصقل شروط الفحص بحيث يمكن إجراء اختبارات الاستيعاب eATP بوساطة macropinocytosis /endocytosis بنجاح في أنظمة مختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم مؤخرا امتصاص الانتهازية من المواد الغذائية خارج الخلية داخل الرحم (أي) اسمه السمة المميزة الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للسرطان1. واحدة من هذه العناصر الغذائية الهامة ATP، كما تركيز ieATP هو 103 و 104 مرات أعلى من تلك الموجودة في الأنسجة الطبيعية، في نطاق عدة مئات من ميكرومتر إلى mMمنخفضة 2،3،4،5. كجزيء الطاقة والإشارات الرئيسية، ATP يلعب دورا مركزيا في التمثيل الغذائي الخلوي في الخلايا السرطانية والصحية6،7،8. ATP خارج الخلية لا تشارك فقط في نمو الخلايا السرطانية, ولكنه يعزز أيضا مقاومة المخدرات9. وظائف ATP لم تكن معروفة من قبل، مثل النشاط الهيدروتروبيكي، وقد تم مؤخرا تحديد، وبالتالي تورط ATP في أمراض مثل الزهايمر10. في الواقع ، يبدو أن فهمنا ل ATP ووظائفه في الخلايا السرطانية والخلايا السليمة والخلايا المريضة الأخرى أبعد ما يكون عن الاكتمال. ومع ذلك ، بسبب عدم استقرار ATP وارتفاع معدلات الدوران في الخلايا ، فمن الصعب تقنيا مراقبة حركة ATP عبر غشاء الخلية وإلى الخلية.

لمعالجة هذه المشكلة وسد الحاجة إلى هذا المجال البحثي، تم تطوير طريقة حيث تم استخدام ATP الفلورية غير قابلة للهيدروليز (NHF-ATP)(الشكل 1)كبديل لتصور استيعاب ATP ومراقبة التعريب المكاني داخل الخلية من ATP الداخلي، سواء في المختبر وفي الجسم الحي11،12 . وقد ثبت NHF-ATP لتحل محل ATP الذاتية للتحقيق في حركة ATP عبر أغشية الخلايا الحيوانية، سواء في خطوط الخلايا السرطانية وفي أنسجة الورم البشري xenografted على الفئرانالمناعية 11،12. وعلاوة على ذلك، إدارة مثبطات macropinocytosis للخلايا منعت استيعاب eATP، مما يشير إلى أن امتصاص داخل الخلايا من eATP ينطوي على آلية الماكروبينوسيتوتيك9،11،12. يسمح هذا البروتوكول بتكبيل الكولابيل القائم على المناعة ضد البروتينات الخاصة بالخلايا وبالتالي تحديد نوع الخلية الذي يستوعب NHF-ATP. باستخدام في الجسم الحي xenografts الورم والمجهر عالية الدقة، NHF-ATP يمكن تصور مكانيا عبر عينة الأنسجة وحتى داخل خلية واحدة. تسمح هذه الطرق أيضا بالتحليل الكمي ، مثل النسبة المئوية لامتصاص الخلايا ، وعدد الحويصلات الماكروبينوسيتوتيكية ، وحركية الاستيعاب. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيف يمكن استخدام NHF-ATP ، التي تعمل بمفردها أو مع dextrans الفلورية الانسطية13و14و15و16، في إعدادات تجريبية مختلفة لدراسة استيعاب ATP وتوطينها داخل الخلايا ، بعد الاستيعاب في الخلايا.

figure-introduction-1
الشكل 1: هياكل ATP الفلورسنت غير قابلة للهيدروليزابل وtetrapmethylrhodamine المسمى عالية الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran. (أ) هيكل NHF-ATP. (ب)التمثيل التخطيطي ل HMWFD. المختصرات: ATP = أدينوسين ثلاثي الفوسفات; NHF-ATP = ATP الفلورية غير قابلة للهيدروليز؛ TMR = رباعي ميثيل هودامين; HMWFD = ارتفاع الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة هنا وفقا لIACUC جامعة أوهايو ومع المعاهد القومية للصحة.

1. اختيار ATP الفلورسنت غير قابلة للهيدروليز (NHF-ATP) وديكسترانس

  1. حدد متتبعات الفلوروفورية المترافقة NHF-ATP(الشكل 1A)ومتتبعات الاندواس، والفلورسنت عالي ومنخفض الوزن الجزيئي (TMR-HMWFD و TMR-LMWFD) (الشكل 1B)،استنادا إلى أطوال الموجات الفلورية المفضلة (على سبيل المثال، نظام التصوير المجهز بفلاتر مناسبة) وعملية التنظير المحيطي المحددة التي سيتم دراستها.

2. دراسات توطين ATP، في المختبر (الشكل 2)

figure-protocol-1
الشكل 2: في إجراء المختبر لفحص استيعاب ATP. التمثيل التخطيطي للبروتوكول لتصور استيعاب ATP خارج الخلية في الخلايا السرطانية المستزرعة باستخدام المجهر الفلوري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. زراعة الخلايا وإعداد الخلايا
    ملاحظة: إجراء زراعة الخلايا في ظل ظروف معقمة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
    1. إعداد دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM)، التي تحتوي على 10٪ (v/v) مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ (v/v) البنسلين / العقدية (تسمى فيما بعد D 2000/FBS)، المالحة المعقمة العازلة بالفوسفات (PBS)، و 0.25٪ من حمض تريبسين/إيثيلينديامينتتراستيك (EDTA)، في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. زراعة الخلايا السرطانية البشرية في DMEM / FBS في طبق زراعة الأنسجة 100 ملم. الحفاظ على الخلايا في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 الغلاف الجوي.
    3. عندما تصل الخلايا إلى التقاء، مرور الخلايا عن طريق إزالة أولا الوسط الثقافة. بعد ذلك، شطف الطبق مع 5 مل من برنامج تلفزيوني عقيم، وإزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة 3 مل من 0.25٪ تريبسين. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 الغلاف الجوي لمدة 5 دقائق.
    4. استرداد الطبق، ثم إضافة 6 مل من DMEM / FBS لوقف المحاولة. نقل الخلايا في تعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا.
    5. بعد الطرد المركزي، يستنشق الناموستة واستخدام 10 مل من DMEM/FBS لإعادة إنفاق بيليه الخلية عن طريق الأنابيب.
    6. عد كثافة الخلية وقابليتها للاستمرار باستخدام مقياس الدم. استخدام DMEM / FBS لتخفيف تعليق الخلية إلى كثافة ~ 7.5 × 104 خلايا / مل.
  2. إعداد الأغطية وخلايا البذر
    1. غسل 12 مم coverslips مع الإيثانول 70٪ ومسحها بعناية مع مناديل مهمة حساسة. تعقيم الأغطية وزوج واحد من ملقط عن طريق الالاستعباد التلقائي.
    2. في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، واستخدام ملقط لوضع غطاء واحد في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا.
      ملاحظة: لاحقا، سيتم تركيب غطاء الأغطية، مع الخلايا، مباشرة على شريحة مجهر للتصوير.
    3. الاستغناء عن 300 ميكرولتر من تعليق الخلية (خلايا في DMEM / FBS)، في كثافة البذر من ~ 2.5 × 104 خلايا لكل بئر، في لوحة 24 جيدا تحتوي على الأغطية المعقمة. احتضان في ظروف معقمة في 37 درجة مئوية مع تدفق 5٪ CO2.
  3. تجويع الخلايا
    1. بعد 24 ساعة من البذر، قم بإزالة DMEM/FBS من كل بئر. إضافة فورا 300 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل قبل الحرب في كل بئر لتجويع المصل الخلايا لمدة 15-18 ساعة للحث على امتصاص المواد الغذائية خارج الخلية.
      ملاحظة: فترة المجاعة 15-18 ساعة معلمة حرجة.
  4. إعداد حلول NHF-ATP وHMWFD/LMWFD
    1. استخدم توازنا تحليليا لوزن الوزن الجزيئي العالي (70 كيلودا) الفلوري TMR-dextran (TMR-HMWFD، 1 ملغم/مل)، وهو متتبع لتصور الماكروبينوسومات، أو NHF-ATP (10 ميكرومول/لتر) في DMEM الخالي من المصل في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. ضع الأنابيب، المحمية من الضوء، في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. جهاز طرد مركزي في 12،000 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل بعناية supernatant واضحة إلى أنبوب جديد 1.5 مل الطرد المركزي الدقيق، وترك أي بيليه أو الحطام سليمة لإزالة بلورات لا ينفصم.
    3. إضافة الحلول من الخطوة 2.4.1 إلى الخلايا في كل بئر، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا كانت حلول HMWFD وNHF-ATP سيتم خلطها للحضانة المشتركة مع الخلايا ، فعد كلا الحلين عند التركيزات النهائية 2x. سيتم خلط الحلول في وقت لاحق بنسبة 1:1 لتحقيق تركيزات العمل الدقيقة النهائية. تجنب الضوء لأن الكواشف حساسة للضوء.
  5. علاج الخلايا والتثبيت
    1. في طبق جديد من 24 بئرا ، استغني عن 500 ميكرولتر من PBS قبل الحرب في كل بئر من الآبار الخمسة.
    2. بعد حضانة الخلية، التقط بعناية كل غطاء باستخدام ملقط. شطف كل coverslip عن طريق غمسه في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني prewarmed. كرر خمس مرات باستخدام الآبار الخمس المليئة ب PBS.
      ملاحظة: الغسيل اللطيف للخلايا على الأغطية أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه التجربة.
    3. بعد غسل برنامج تلفزيوني النهائي، اضغط على coverlip على مسح مهمة حساسة لاستيعاب برنامج تلفزيوني إضافي ونقل الغطاء فورا إلى الباردة (4 درجة مئوية) 3.7٪ الفورمالديهايد، محملة مسبقا في لوحة 24 جيدا. إصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. في حين يتم إصلاح الخلايا، الشرائح المجهر قبل نظيفة مع الإيثانول 70٪. إزالة coverlips من الآبار وجبل لهم على الشرائح، وذلك باستخدام 5 ميكرولتر من المتوسطة تصاعد مائي يحتوي على وصمة عار النووية 4′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)، لكل غطاء. لطخة بلطف برنامج تلفزيوني الزائدة مع منشفة ورقية أو مسح مهمة حساسة.
  6. المجهر الفلوري واكتساب الصورة
    1. بعد ساعتين إلى 24 ساعة من الخطوات المذكورة أعلاه ، التقط صورا للخلايا و/أو HMWFD و / أو NHF-ATP باستخدام نظام تصوير فائق الفلورة وبرامج الحصول على البيانات.
      ملاحظة: يصف هذا القسم الفرعي خطوات الحصول على الصور باستخدام مجهر نيكون نيو، المجهز بقدرة التصوير الفلوروري، وبرنامج نيكون NIS Elements. ومع ذلك، يمكن استخدام أنظمة تصوير أخرى قابلة للمقارنة وبرامج اقتناء. اتبع إرشادات التشغيل من الشركة المصنعة.
      1. ضع الشريحة على خشبة مسرح المجهر المستقيم في وضع المنظار. الوصول إلى برنامج التصوير.
      2. حدد الهدف 10x، وضبط المرحلة لتحديد التركيز، ومسح الشريحة من اليسار إلى اليمين بطريقة ثعبانية لتحديد المناطق ذات الاهتمام.
        ملاحظة: يختلف تحديد المناطق ذات الاهتمام بين أنواع الخلايا، مع بعض خطوط الخلايا/أنواع السرطان التي تظهر درجات متنوعة ومتميزة من امتصاص TMR-HMWFD و/أو NHF-ATP.
      3. حدد الهدف 40x، والتبديل من وضع منظار إلى وضع التقاط الصور، وذلك باستخدام تبديل على المجهر.
      4. انقر على أيقونة جودة العيش على برنامج التصوير لعرض الصور والحصول عليها في وقت لاحق.
      5. باستخدام لوحة OC على شريط أدوات التعليقات التوضيحية والقياسات، حدد معلمات التعريض الضوئي لكل مكعب فلتر أو قناة فلورية.
        ملاحظة: حدد وقت التعرض المناسب لكل قناة، حيث تختلف كثافة الإشارة. على سبيل المثال، حدد وقت التعرض 200 مللي ثانية ل DAPI، و2 ثانية ل HMWFD، و4 ثانية ل NHF-ATP. بمجرد تحديد وقت التعرض لكل قناة، استخدم هذا الإعداد لجميع الصور، لكل قناة، مع علاج أو ظروف مختلفة.
      6. بمجرد تعيين إعدادات التعريض الضوئي لكل قناة، استخدم شريط أدوات اكتساب القنوات المتعددة للحصول على صورة ثلاثية القنوات مع إعدادات التعرض المحددة.
        ملاحظة: يتيح اكتساب الصورة من خلال وضع اكتساب ND متعدد القنوات التقاط الصور تلقائيا لكل قناة من نفس مجال الرؤية. يتم إغلاق الغالق تلقائيا بين تغييرات البرج.
      7. بدلا من ذلك، الحصول على صور متعددة القنوات يدويا عن طريق تحويل بين مكعبات التصفية، وتحديد وقت التعرض، وإغلاق / فتح مصراع بين الحصول على صورة لكل قناة، وتراكب كل صورة اتخذت لقنوات فردية.
        ملاحظة: وضع اكتساب ND بأتمتة هذه العملية ويوفر الصور المدمجة.
      8. حفظ الصورة كملف .nd2 (تنسيق عناصر نيكون يحفظ البيانات الوصفية). حفظ ملفات TIF، بما في ذلك صورة القناة المدمجة وصور القناة الفردية.
        ملاحظة: يمكن استخدام ملفات TIF مع مجموعة أوسع من تطبيقات البرامج.
      9. استخدم ميزة عدد الكائنات على شريط أدوات التحليل لحساب عدد الخلايا NHF-ATP-, TMR-HMWFD-, و/أو TMR-LMWFD-إيجابية على ملف صورة .nd2 المحفوظة.
      10. تصدير البيانات إلى جدول بيانات من خلال برنامج التحليل.
  7. تقدير البيانات وتحليلها
    1. لكل حالة تم فحصها، الصورة 50 إلى 100 خلية للقياس الكمي. باستخدام برنامج تحليل البيانات (البرامج المضمنة في نظام التصوير الفلورسيوني أو برامج أخرى) ، عد وحساب متوسط عدد الحويصلات الفلورية لكل خلية.
    2. استخدام الطرق الإحصائية المناسبة لتحليل النتائج الكمية.

3. ATP استيعاب في الأورام، ex vivo (الشكل 3)

figure-protocol-2
الشكل 3: في إجراء الجسم الحي لفحص استيعاب ATP. التمثيل التخطيطي للبروتوكول لتصور استيعاب ATP خارج الخلية في الأورام xenografts باستخدام التنظير المجهري التبريد والمضان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إعداد ثقافات الخلايا للزرع
    1. تنمو الخلايا السرطانية إلى التقاء 80٪ عند 37 درجة مئوية في قارورة 225 سم2، وذلك باستخدام DMEM تستكمل FBS، إلى تركيز نهائي من 10٪ (v/v) وبينسلين / ستريبتومايسين في 1٪ (v/v).
    2. غسل الخلايا مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. قبل الحارة 0.25٪ تريبسين / EDTA إلى 37 °C. إضافة 8 مل من تريبسين / EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    3. بمجرد أن تبدأ الخلايا فصل من الجزء السفلي من القارورة، استخدم ماصة المصلية المعقمة 10 مل لإضافة 8 مل من DMEM/FBS. يستنشق مرتين لطرد أي خلايا معتنقة. استخدام ماصة لنقل الخلايا المنفصلة من القارورة إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    4. إضافة 10 مل من DMEM / FBS باستخدام ماصة 10 مل، وجمع جميع الخلايا العائمة المتبقية في نفس أنبوب مخروطي 50 مل.
    5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 600 × غرام، 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 1 مل من الجليد الباردة PBS.
    6. عد كثافة الخلية باستخدام مقياس الدم. الحفاظ على تعليق الخلية على الجليد أثناء العد.
    7. الطرد المركزي تعليق الخلية في 600 × غرام، 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. إزالة supernatant وتعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة بحيث تصبح كثافة الخلية 5 × 106 خلايا لكل 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
  2. الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية لتطوير الورم xenograft
    1. استخدم حقنة خالية من اللاتكس (1 مل) مع إبرة انزلاق دقيقة (إبرة 27 G) لحقن الخلايا السرطانية.
    2. نقل تعليق الخلية (5 × 106 في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني) إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. ارسم الخلايا في الحقنة.
    3. حدد موقع حقن على جانب فأرة (عارية) مناعية، وانظف الجلد برفق باستخدام الإيثانول بنسبة 75٪. مسح الايثانول الزائد مع مسح مهمة حساسة.
    4. للحقن تحت الجلد، أمسك الإبرة بزاوية 10 درجات تقريبا على الجلد. أدخل طرف الإبرة، الجانب شطبة، فقط تحت الجلد، بحيث فقط 1-2 مم من الإبرة مرئية خارج الجلد. الاستغناء عن الخلايا من الحقنة ببطء أكثر من 10 ق تقريبا.
    5. بعد حقن وحدة التخزين بأكملها، والاستمرار في عقد الإبرة في مكان لمدة 3-5 ثانية، ثم سحب الإبرة واستخدام إصبع لتطبيق ضغط لطيف ولكن شركة لموقع الحقن لمدة 3-5 ثوان أخرى لمنع تسرب المحتوى المحقون.
    6. رصد وقياس نمو الورم باستخدام الفرجار vernier حتى تصل الأورام إلى حجم 200-500 مم3.
  3. إعداد HMWFD وNHF-ATP الحلول لاستخدامها بعد استئصال الورم
    1. حل 300 ميكرولتر من 16 ملغم/ مل HMWFD في DMEM الخالية من المصل (متوسطة الثقافة)، واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، والطرد المركزي في 12،000 × غرام لمدة 5 دقائق على النحو المبين أعلاه. نقل الحل إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
    2. إضافة 40 ميكرولتر من المخزون التناظري NHF-ATP (1 mM) إلى 160 ميكرولتر من DMEM الخالية من المصل لإعداد محلول NHF-ATP 0.2 mM.
  4. إعداد الآبار التجريبية
    ملاحظة: هذا التصميم التجريبي سوف تقييم الاستيعاب داخل الخلايا من HMWFD + NHF-ATP، مما يدل على امتصاص من قبل macropinosomes.
    1. إعداد الآبار على النحو التالي: حسنا # 1، التحكم: 200 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل. حسنا # 2 ، التحكم : 100 ميكرولتر من 16 ملغ / مل LMWFD + 100 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل = 200 ميكرولتر من 8 ملغم / مل LMWFD ؛ حسنا # 3 ، التحكم : 100 ميكرولتر من 0.2 م م NHF - ATP + 100 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل = 200 ميكرولتر من 0.1 م م NHF - ATP ؛ حسنا # 4 ؛ 4 ؛ التجريبية: 100 ميكرولتر من 16 ملغم/مل HMWFD + 100 ميكرولتر من 0.2m NHF-ATP = 200 ميكرولتر من 0.1 مللي متر NHF-ATP و 8 ملغم/مل HMWFD.
  5. إعداد أنسجة الورم
    1. قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم أو وفقا للبروتوكول المعتمد من IACUC.
    2. استخدام حجم 10 مشرط لشريحة الأورام المعزولة في سمك ~ 500-1000 ميكرومتر.
    3. احتضان شرائح الورم في DMEM خالية من المصل تكملها مع 100 ميكرومتر NHF-ATP و / أو 8 ملغ / مل H / LMWFD في أنابيب الطرد المركزي الدقيق لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪تدفق ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظة: بعد الحضانة، يؤدي التمثيل الغذائي للأنسجة السرطانية إلى تغير لون الوسط.
    4. شطف الأنسجة في 37 درجة مئوية برنامج تلفزيوني prewarmed (2 مل لكل شطف في لوحة 24 جيدا).
    5. نقل الأنسجة إلى لوحة جديدة 24 جيدا مع برنامج تلفزيوني الطازجة prewarmed، شطف وتكرار أربع مرات مع اهتزاز لطيف.
  6. تضمين التبريد (إعداد كتل الأنسجة المجمدة)
    1. إعداد بطاقات تعريف لكل ورم يتم حصاده. قطع قطعة 2 سم من الشريط المختبري وأضعاف في النصف، والجانبين لاصقة معا، بالطول. استخدم قلم تمييز لتسمية العلامة، على سبيل المثال، برقم تعريف الماوس/الورم.
    2. إعداد القوالب تضمين عن طريق وضع قوالب الأنسجة الفولاذ المقاوم للصدأ مباشرة على الجليد الجاف.
      ملاحظة: قد يتسبب الجليد الجاف في قضمة الصقيع والحروق والاختناق. ارتداء قفازات معزولة عند التعامل مع الجليد الجاف. استخدم الثلج الجاف في منطقة جيدة التهوية. لا تخزن الثلج الجاف في حاوية محكمة الإغلاق. بدلا من ذلك، تخزين في حاوية (مثل مبرد الستايروفوم) الذي يسمح للغاز للهروب.
    3. بينما قشعريرة العفن، ضع بركة صغيرة من الأنسجة تجميد المتوسطة في لوحة زراعة الأنسجة 10 ملم. تأكد من أن حجم كافية لغمر أنسجة الورم التي سيتم حصادها.
    4. استخدم ملعقة مثقبة لاستخراج أنسجة الورم المكروبة ووضع الأنسجة على الفور في وسط متجمد ، مما يضمن غمر الأنسجة. باستخدام ملعقة مثقبة، لفة بلطف الأنسجة في المتوسط تجميد، وضمان أن المتوسط هو الاستحمام جميع أسطح الأنسجة.
    5. نقل بعناية الأنسجة في العفن تضمين تحتوي على المتوسطة تجميد. ضع علامة التسمية المقابلة عموديا في الوسط/العفن المتجمد للتجميد في مكانه. تأكد من ظهور الملصق المكتوب خارج الوسط.
    6. عندما يكتمل التجميد (يتحول متوسط التجميد إلى أبيض معتم) ، قم بإزالة كتلة الأنسجة من القالب ، ضعها على الجليد الجاف ، وكررها لكل ورم. تخزين كتل الأنسجة في -80 درجة مئوية لعدة أشهر قبل إجراء عملية استئصال الشعر.
  7. إعداد الشرائح من عينات الأنسجة
    1. لتعظيم فرصة العثور على خلايا إيجابية الاستيعاب وجود مناطق الأنسجة أكثر تمثيلا، وجمع cryosections المسلسل في -18 إلى -20 درجة مئوية باستخدام cryostat.
      1. أدوات بريستات Prechill (شفرة، شفرة حلاقة، لوحة مضادة للفة، حامل تشاك الأنسجة، فرشاة الطلاء) وتتوازن كتل الأنسجة الورم عن طريق وضعها في غرفة cryostat في -18 إلى -20 درجة مئوية. تعيين زاوية حامل النصل إلى 5-10 درجة. تقليم بعناية كتلة الأنسجة، حسب الحاجة، مع شفرة حلاقة، وجبل على حامل تشاك باستخدام الأنسجة تجميد المتوسطة باسم "الغراء".
      2. قفل حامل تشاك في الموضع الرأسي على وحدة microtome، الذي يتقدم إلى مسافة مجموعة (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر) مع كل منعطف من كرنك اليد. ضع لوحة مكافحة لفة للراحة فقط فوق ارتفاع النصل. لمنع تجعيد الأنسجة قبل التقدم في microtome، قم بتمرير الإبهام بعناية على الحافة السفلية لكتلة الأنسجة.
      3. مع تقدم الميكروتوم وسقوط قسم الأنسجة على اللوحة المعدنية، استخدم فرشاة الطلاء لتوجيه قسم الأنسجة وفك الأنسجة، إذا لزم الأمر.
      4. مرر شريحة المجهر فوق قسم الأنسجة دون لمس بحيث ينجذب القسم إلى الشريحة.
        ملاحظة: شفرات Cryostat (رفيعة المستوى، يمكن التخلص منها) حادة للغاية ويمكن أن تسبب إصابات خطيرة. استخدام الرعاية عند التعامل مع ريش وتشغيل cryostat. استخدم واقي شفرة، إذا كان متوفرا. التدريب المناسب مطلوب.
      5. شريحة الورم إلى أقسام من سمك 10 ميكرومتر. نقل على الفور أقسام شرائح على شريحة المجهر الزجاجي مشحونة إيجابيا.
        ملاحظة: بالنسبة للأقسام التسلسلية، قم أولا بتجميع مقطع سمكه 10 ميكرومترات في الزاوية اليسرى العليا لكل شريحة من الشرائح الثماني المشحونة إيجابيا. تقدم في cryostat من خلال 100-200 ميكرومتر لاحقة من الأنسجة ، والتخلص من الأنسجة. نقل جميع المقاطع شرائح فورا على الشرائح المجهر الزجاجي.
      6. بعد ذلك، اجمع قسما آخر سمكه 10 ميكرومتر، بجوار قسم الأنسجة الموضوع سابقا، لكل شريحة من الشرائح الثماني. كرر عملية التجميع التسلسلية هذه حتى تحتوي كل شريحة من الشرائح الثمانية على ثمانية أقسام من الأنسجة، يفصل بينها كل 100-200 ميكرومتر. الحفاظ على أقسام الأنسجة في الظلام للحفاظ على الفلورسينس.
        ملاحظة: يمكن تخزين مقاطع الأنسجة على الشرائح في مربع شرائح عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  8. تثبيت شرائح الأنسجة
    1. الخطوة الحرجة: إصلاح أقسام الأنسجة في الإيثانول 95٪ في -18 إلى -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. غسل القسم الثابت لمدة 5 دقائق مع PBS درجة حرارة الغرفة، ومن ثم جبل أقسام الورم الثابتة تحت غطاء زجاجي باستخدام 10 ميكرولتر من وسط تصاعد مائي مع DAPI.
    3. 12-24 ساعة بعد تصاعد, فحص أقسام الورم الثابتة عن طريق المجهر مضان والحصول على الصور, كما هو موضح للخلايا المستزرعة أعلاه.
  9. المجهر الفلوري واكتساب الصورة
    1. تحديد المناطق ذات الاهتمام والحصول على الصور، كما هو موضح في القسم 2.6.
  10. تقدير البيانات وتحليلها
    1. تحديد الخلايا وتطبيق التحليلات الإحصائية المناسبة، كما هو الحال في القسم 2.7.

4. ATP استيعاب في الأورام، في الجسم الحي

  1. إعداد ثقافات الخلايا للزرع كما هو موضح في القسم 3.1.
  2. الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية لتطوير الورم xenograft
    1. توليد الأورام xenografted كما هو موضح في القسم 3.2.
  3. ATP و / أو حقن ديكستروان في أورام xenograft
    1. إعداد حلول العلاج من DMEM (مركبة) أو 8 ملغم / مل HMWFD أو LMWFD، مع أو بدون NHF-ATP (100 ميكرومتر) في DMEM، كما هو موضح أعلاه.
    2. استخدام حقنة 1 مل لجمع 50 ميكرولتر من محلول علاج واحد وحقن الحل مباشرة في كل ورم xenograft. كرر الإجراء لأربعة تكرارات بيولوجية لكل علاج.
  4. حصاد الأنسجة وتضمينها بالتبريد
    1. إعداد بطاقات تعريف لكل ورم يتم حصاده. قطع قطعة 2 سم من الشريط المختبري وأضعاف في النصف، والجانبين لاصقة معا، بالطول. استخدم قلم تمييز لتسمية العلامة، على سبيل المثال، برقم تعريف الماوس/الورم.
    2. ما يقرب من 5 دقائق بعد الحقن، والقتل الرحيم الماوس عن طريق خلع عنق الرحم أو وفقا للبروتوكول وافق IACUC.
    3. باستخدام مشرط حجم 10، وجعل شق المتاخمة للورم وعمودي تقريبا إلى اتجاه حقن الإبرة. استخدم ملقط ومقص جراحي لاستئصال نسيج الورم من الأنسجة المحيطة.
    4. تقسيم الورم إلى قطعتين إلى أربع 1 سم2، اعتمادا على حجم الورم الكلي.
    5. إعداد القوالب تضمين وتضمين الأنسجة، كما هو موضح أعلاه في القسم 3.6. تأكد من أن وقت الحصاد، من حقن ديكستروان داخل الرحم إلى تضمين التبريد، لا يزيد عن 7-8 دقائق.
  5. إعداد الشرائح من عينات الأنسجة
    1. جمع أقسام الورم المسلسل، كما هو موضح في القسم 3.7.
  6. تثبيت شرائح الأنسجة
    1. إصلاح الأنسجة، كما هو موضح في القسم 3.8.
  7. المجهر الفلوري واكتساب الصورة
    1. تحديد المناطق ذات الاهتمام والحصول على الصور، كما هو موضح في القسم 2.6.
  8. تقدير البيانات وتحليلها
    1. تحديد الخلايا وتطبيق التحليلات الإحصائية المناسبة، كما هو موضح في القسم 2.7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في المختبر دراسة
وقد تجلى الاستيعاب داخل الخلايا لNHF-ATP من خلال المشاركة في توطين NHF-ATP مع HMWFD أو LMWFD(الشكل 4). يعتمد نجاح هذا الإجراء في المقام الأول على استخدام تركيزات مناسبة من NHF-ATP و dextrans وعلى تحديد النوع (الأنواع) المناسبة من dextrans (بولي ليسين مقابل محايد). على سبيل المثال، للتحقيق macropinocytosis، تم اختيار HMWFD كما يتم استيعابها فقط من قبل macropinosomes13،14<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة للتحليل المكاني والزمني والكمي للتدخيل الخلوي ل ATP غير القابل للهيدروليز. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع للاستخدام في النظم البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك مختلف النماذج الورمية، والتي نقدم لها التعليم التقني والبيانات التمثيلية. للحصول على بيانات قابلة للتفسير أثناء دراسات استيعاب ATP في الجسم الحي (القسم 4 من البروتوكول) ، من الأهمية بمكان الحد من الوقت التجريبي المنقضي من حقن ديكتران داخل الرحم إلى تضمين التبريد. إصلاح الشرائح الأنسجة بعد الورم المقطع- هو خطوة ضرورية قبل التصوير المجه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء عملية استئصال الأعصاب في الموقع في جامعة أوهايو علم الأمراض الهستوباثولوجية الأساسية. وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بدء التشغيل (جامعة أوهايو كلية الآداب والعلوم) إلى نيلسن C; المعاهد القومية للصحة منح R15 CA242177-01 وجائزة RSAC لX تشن.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
خلايا A549 ، ظهارة الرئة البشرية ، سرطانالمعهد الوطني للسرطانغيرأقل تكلفة
الأسيتونفيشر العلميةS25904
، رينولدزغرينجر6CHG6
وسط تركيب مائي ، كاشف طويل الذهب المضاد للبهتانThermoFisherP36930
ATP التناظريةجينا بيولوجيسNK-101
الأوتوكلاف ، معقمGrainger33ZZ40
شفرات ، ناجمد ، رفيع المستوىC.L. Sturkey، Inc.DT554550
الفرجار ، الورنيةGrainger4KU77
خلية متوسطة ، خليط المغذيات لحم الخنزير F12 ،Millipore Sigma51651C-1000ML
من المصل ، مبرد مع دوار دلو متأرجحEppendorf5810R
ChloroformAcros Organics423555000
أنبوب مخروطي الشكل ، 15 ملVWR21008-216
أنبوب مخروطي الشكل ، 50 ملVWR21008-242
أغطية ، زجاج ، 12 ممCorning2975-245
Cryost ، Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
مسح مهام دقيق ، مناديل كيم مبللةKimberly-Clark34155
Dextran، Lysine قابلة للإصلاح ، الوزن الجزيئي العالي (HMW)InvitrogenD1818ميغاواط = 70,000 ، رباعي ميثيل رودامين
ديكستران ، محايد ، الوزن الجزيئي العالي (HMW)إنفيتروجينD1819
النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) ، فيشرساينتفيك11885076
التسليم المحليطلب
نظام التصوير epifluorescent ، نيكون NiU وبرنامج اقتناء Nikon NIS Elementsنيكونطلب
الإيثانولفيشر العلميBP2818-4
مصل الأبقار الجنيني (FBS) ملقط16000044ThermoFisher
، Dumont # 7 ،أدوات العلوم الدقيقة11274-20
ملقط ، Dumont # 5 ،أدوات العلوم الدقيقةالمستقيمة 11254-20
قفازات (صغيرة ، متوسطة ، كبيرة)MicroflexN191 ، N192 ، قفازات N193
، MAPA Temp-Ice 700 Thermal (للتعامل مع الثلج الجاف)Fisher Scientific19-046-563
DaiggerEF16034F EA
Incubator ، زراعة الخلاياEppendorfGalaxy 170 S
شريط وضع العلاماتFisher Scientific159015R
قلم الوسم ، Sharpie (فائق النعومة)الدبابيس642736
الفئران ، نقص المناعة (Nu / J)مختبر جاكسون2019
طرد مركزي دقيق ، accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
أنابيب Microcentrifgue ، أنابيب Eppendorf (1.5 مل)شرائح مجهر AxygenMCT-150-C
Fisher Scientific50-751-4983
إبرة ، مقياس 27Becton-Dickinson752 0071
فرشاة الرسمGrainger39AL12
مناشف ورقيةدبابيس33550
ParaformaldehydeAcros Organics416785000
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140122
ملعقة مثقبة ، قطر 15 مم ، طول 135 ممشركة Roboz Surgical Instrument Co.RS-6162
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)نصائح ماصة فيشر ScientificBP3991
(10 & mu; L)فيشر Scientific02-707-438
نصائح Pipet (200 & mu ; L)فيشر Scientific02-707-411
نصائح Pipet (1000 & mu ; L)فيشر Scientific02-707-403
Pipets ، مصلي (10 مل)VWR89130-910
Pippetor ، Gilson P2DaiggerEF9930A
Pipettor Starter Kit ، جيلسون (2-10 & mu ؛ لتر ، 20-200 مو ؛ لتر ، 200-1000 مو ؛ L)DaiggerEF9931A
- مداري ، منضدةCole-ParmerEW-51710-23
شرائح مجهر موجبة الشحنة ، مشرط SuperfrostFisher Scientific12-550-15
، مقاس 10 ، Surgical Design، Inc.مقص فيشر Scientific22-079-707
، أدوات العلوم الدقيقة الجراحية - الحادة والمنحنية14005-12
برنامج لتحليل الصور ، برنامج نيكون Elementsنيكونللطلب
المخصص لتحليل الصور ، ImageJ (فيجي)المعاهد الوطنية للصحةبدونتنزيل عبر الإنترنت (مجانا)
قرص عينة 30 مم (حامل تشاك) ، ملحق ناظم البرد14047740044Leica Biosystems
431111أطباق المقايسة الحيوية 245
مم ، شريط309623بيكتون ديكنسون
1 سم مكعب ، مختبر ، عرض 19 ممفيشر ساينتفيك15-901-5R
مؤقتفيشر سينتيفيك14-649-17
طبق زراعة الأنسجة ، قطر100 × 15 مم08-757-100D
، 225 سم 2< / sup>159933ThermoFisher
الأنسجة 353226بيكتون ديكنسون 24
جيدا ، الفولاذ المقاومللصدأ Tissue Tek4161
وسط تجميد الأنسجة ، درجة حرارة القطع المثلى (OCT)فيشر Scientific4585
التربسين EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك) ، 0.25٪جيبكو25200072
حمام مائي ، بريسيشن GP2S ThermoFisherTSGP2S
مصدر رقائق الألومنيوم جهاز طرد مركزي الخالي وسط الجاف الخالي من المصلمخصصمخصص المنحنية جهاز صندوق شاكر منصة صينية تلطيخ ، حقنة قارورة زراعة الأنسجة فيشر Scientific لوحة زراعة الأنسجة ، قالب تضمين

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008(2008).
  3. Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101(2013).
  4. Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
  5. Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
  6. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  7. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
  8. Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
  9. Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
  10. Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
  11. Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
  12. Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
  13. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  14. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  15. Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
  16. Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
  17. Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
  18. Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
  19. Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
  20. Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
  21. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
  22. Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
  23. Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
  24. Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154(2007).
  25. Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyATP InternalizationMacropinocytosisHuman Tumor CellsTumor Xenograft MiceExtracellular ATPEndocytosis TracersFluorescent DextranEpifluorescence ImagingCryosectioning Procedure

Related Articles