1. إعداد اختبار العصي
- بعد اكتمال أي عمليات علاج، قطع الخشب الجاف إلى اختبار العصي إلى حجم 2 مم × 4 ملم × 20 ملم (الشكل 1). الهواء الجاف العصي إلى وزن ثابت، في ظل ظروف المختبر. استخدام ما لا يقل عن 5 نسخ متماثلة من كل الخشب يجري اختبارها.

الشكل 1: اختبار العصي المستخدمة في الاختبارات المختبرية قصيرة الأجل لتقييم معدلات التغذية الجرب. اختبار العصي الخشب الحجم 2 مم × 4 ملم × 20 ملم. من اليسار إلى اليمين: إيكي، التربنتين، الكستناء الحلو والزان خشب القلب والاسكتلنديين الصنوبر sapwood. شريط مقياس 4 ملم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تفريغ الفراغ
- إعداد الخشب آخر (أي، وقطع والعلاج، إذا كان ذلك ممكنا)، ووضع العصي تحت شبكة في وعاء من البلاستيك آمنة للأغذية، داخل مجفف فراغ واستبدال الغطاء ضمان وجود ختم ضيق، التي يسهلها طلاء الشحوم فراغ (الشكل 2).
- قم بإرفاق صمام ثلاثي بين الأنابيب التي تربط المجفف والمضخة، مع أنبوب ثالث يؤدي إلى الهواء الطلق (الشكل 2). تأكد من أن صمام ثلاثية مغلقة قبالة للهواء وتشغيل المضخة لتحقيق فراغ بين -0.75 إلى -1.0 شريط داخل فراغ المجفف وعقد هذا الفراغ لمدة 45 دقيقة - 1 ساعة.
- غمر الطرف المفتوح من الأنبوب الثالث في حاوية من مياه البحر. قم بإيقاف تشغيل المضخة وإغلاق الصمام المؤدي إلى المضخة، ثم افتح الصمام ببطء حتى يتم سحب مياه البحر بواسطة الفراغ إلى المجفف. السماح للماء بالتدفق حتى يملأ الحاوية البلاستيكية، فوق مستوى الشبكة.
- ثم سحب الأنبوب من مياه البحر في الحاوية، مما يسمح للهواء بالدخول، حتى يعود المجفف إلى الضغط الجوي. إبقاء العصي مغمورة تحت شبكة حتى تغرق إلى الجزء السفلي من الحاوية البلاستيكية.

الشكل 2: المعدات المستخدمة لتفريغ العصي الخشبية الملقحة بمياه البحر، استعدادا للتغذية إلى الفقاعات أثناء فحص التغذية المختبرية. أ) فراغ المجفف؛ ب) مضخة؛ ج) مقياس الضغط لمجفف فراغ؛ د) صمام ثلاثية تؤدي إلى فراغ المجفف، مضخة والهواء الطلق أو مياه البحر (أنبوب برتقالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- الرشح الخشب
- غمر العصي اختبار المشبعة بمياه البحر في مياه البحر الواردة في أنابيب 50 مل (الشكل 3). استبدال المياه بانتظام لمدة 20 يوما.
ملاحظة: تنطبق عملية الرشح على أي خشب تجريبي قيد الاختبار، بما في ذلك الغابات المعالجة أو الطبيعية.

الشكل 3: الرشح من العصي الخشبية لإعداد التغذية إلى الشجيرات خلال فحص التغذية المختبرية. الخشب الذي كان مغمورا بالكامل في مياه البحر الواردة في أنبوب فالكون 50 مل، مع تغيير المياه العادية (1-3 أيام)، أنتجت رشح الملونة بشكل واضح. من اليسار إلى اليمين رشح من خشب القلب من; الكستناء الحلو، التربنتين، إيكي، والزان والاسكتلنديين الصنوبر sapwood. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. استخراج غريبل
- استخراج عينات فردية من الجريبل من كتلة الخشب الموبوءة. استخدام زوج من ملقط غرامة ورقيقة (حجم 000/0.4 ملم أو أصغر) فرشاة الرسم. قشر بعناية مرة أخرى أي الخشب الذي يغطي جحر جريبل مع ملقط
ملاحظة: توجد الجحور على سطح الخشب ويمكن التعرف عليها بواسطة ثقوب صغيرة (الشكل 4).
- مرة واحدة وقد تعرضت gribble، واستخدام فرشاة لالتقاط بلطف الأفراد من تحت وإيداع في طبق بتري مليئة بمياه البحر. تحقق من الجريبل تحت المجهر لتحديد الأنواع وضمان عدم حدوث أي ضرر أثناء الاستخراج.
ملاحظة: الضرب pleopods هي علامة على الحيوية.
- تجاهل أي الإناث المكتئب البيض والإناث gravid لديها قدرة التغذية أقل.

الشكل 4: صورة جحر جريبل مع اثنين من فتحات التهوية النموذجية. ل. جحر رباعي الثقوب على عصا من خشب الصنوبر Radiata، بحجم 2 مم × 4 مم × 20 ملم. ويمكن رؤية اثنين من فتحات التهوية أصغر بجوار مدخل الجحر. شريط مقياس 2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تحديد ليمنيوريا رباعية ال وربونكتاتا
- تحديد Limnoria quadripunctata تحت مجسمة من قبل الدرنات الأربعة متميزة، مرتبة في نمط مربع، على pleotelson الحيوان بالإضافة إلى كارينا على شكل X على pleonite19 الخامس (الشكل 5).

الشكل 5: Limnoria رباعية البونكتاتا تحديد السمات. صورة للسطح الظهري Limnoria quadripunctata، التي اتخذت على منظار ستيريوميكروميسكوب في التكبير x20. تحديد الميزات التي تظهر بواسطة السهم الأحمر - يشير إلى كارينا على شكل حرف X والسهم الأزرق - يشير إلى أربعة درنات على pleotelson. شريط مقياس 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. إعداد لوحات الآبار
- في لوحات متعددة الآبار مع آبار قطرها 20 ملم، ضع عصا اختبار واحدة و 5 مل من مياه البحر غير المصفاة، بين 32-35 وحدة دعم المشاريع، لكل بئر (الشكل 6).
- وضع العلاجات / أنواع الخشب بشكل منهجي في جميع أنحاء لوحة البئر بحيث يتم تمثيل كل نوع من الخشب مرة واحدة على الأقل لكل لوحة. إضافة جريبل واحد لكل بئر.
ملاحظة: يجب أن تبقى درجة الحرارة مستقرة في حاضنة عند 20 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية للأنواع L. يمكن استخدام quadripunctata ، أنواع أخرى من ليمنيوريا مع تعديلات على درجة الحرارة التي تناسب الأنواع المحددة.
- احتفظ بالألواح في ظروف مظلمة ثابتة لأن الضوابير الضوئية ليس لها تأثير على معدل التغذية الجريبل15.

الشكل 6: إعداد تجريبي لإجراء فحص تغذية التجريب. مثال على 12 لوحة متعددة الآبار المستخدمة في الاختبار المختبري لمعدل التغذية الجريبل. ويحتوي كل بئر على 5 مل من مياه البحر وعصا اختبار واحدة (20 مم × 4 مم × 2 مم) من أنواع خشبية مختلفة؛ الاسكتلنديون باين سابوود وإيكي، الزان، الكستناء الحلو، والربنتين خشب القلب. شريط مقياس 20 ملم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. جمع وعد الكريات البراز وتقييم الحيوية.
- مرتين في الأسبوع، وإزالة عصا الاختبار وكل جريبل (واحد لكل بئر) من لوحة البئر ووضعها في لوحة بئر أعدت مسبقا حديثا (تحتوي على 5 مل من مياه البحر لكل بئر [32-35 وحدة دعم النظام البيئي، 18-22 درجة مئوية]).
- استخدام فرشاة الطلاء لفرشاة بلطف قبالة أي الكريات البراز من العصا قبل نقل والاحتفاظ الكريات البراز داخل البئر الأصلي.
ملاحظة: قبل نقل النبل إلى طبق بئر طازج، يمكن تقييم الحيوية على مقياس من 1-5. 1 = ميت، 2 = سلبي، وليس على الخشب، 3 = السباحة بنشاط أو الضرب pleopods، وليس على الخشب، 4 = الزحف على سطح الخشب، 5 = محفورة في الخشب.
- معالجة الصور
- استخدام فرشاة الطلاء غرامة لفصل أي كتل بحيث الكريات الفردية مرئية وفرشاة الكريات بعيدا عن حواف البئر. التقط صورة تفصيلية تحت مجهر ستيريو، عند تكبير x4 وتحميلها على جهاز كمبيوتر (الشكل 7).
ملاحظة: تأكد من أن الكريات في بؤرة التركيز والخلفية موحدة، مع عدم وجود ظلال أو انعكاسات ضوئية على سطح الماء.

الشكل 7: صورة الكريات البرازية. ل. الكريات البرازية رباعية الربوكتاتا (حبيبات صغيرة أسطوانية وبنية) من التغذية على خشب الصنوبر Radiata في بئر واحد من لوحة متعددة الآبار. اتخذت في التكبير x4. الصور قبل التلاعب لتحليل الصور (انظر الشكل 7). أ) مثال على صورة مناسبة لاستخدامها في العد الآلي في ImageJ. الكريات تنتشر بما فيه الكفاية وبعيدا عن حواف البئر. يتمركز البئر ولا توجد عوائق أو انعكاسات. ب) مثال على صورة غير مناسبة لتحليل الصور. البئر خارج المركز، يقطع النصف السفلي. تظهر الدائرة الزرقاء (المنقطة) انعكاس الضوء قبالة سطح الماء. البرتقالي (الصلبة) دائرة يظهر الكريات التي تتجمع بشكل وثيق جدا معا وقريبة جدا من حافة البئر. دائرة حمراء (متقطعة) يظهر رقاقة الخشب التي لم تتم إزالتها. شريط مقياس 10 ملم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- عملية لتوليد عدد بيليه البراز باستخدام ImageJ.
- تحميل ImageJ (أحدث إصدار اعتبارا من 03/08/21، 1.8.0_172) من https://imagej.nih.gov/ij/download.html أو تشغيل من متصفح الكمبيوتر.
- تحميل مجموعة من الصور عن طريق سحب وإسقاط أو عن طريق تحديد ملف | استيراد | | تسلسل الصور تصفح. لا تقم بتغيير أية معلمات ثم حدد موافق.
- بعد ذلك ، استخدم أداة الدائرة لتحديد القسم السفلي من البئر الذي يحتوي على الكريات البرازية. إزالة حواف البئر، حدد تحرير | واضحة في الخارج. جعل الصورة ثنائية، حدد عملية | جعل ثنائي.
- معايرة عن طريق تحديد تحليل | تعيين مقياس واختيار عدد وحدات البكسل لكل ملليمتر للصورة (على سبيل المثال 10 بكسل = 1 مم). عد الكريات، حدد تحليل | تحليل الجسيمات.
- في المربع المجاور للحجم (unit2)، حدد عتبة أقل هي نفسها أصغر بيليه حجم، وذلك باستخدام مقياس الوحدة الذي تم تعيينه سابقا (على سبيل المثال، إذا كان 10 بكسل = 1 مم وأصغر بيليه هو 0.5 مم، اختر 5-infinity).
- في المربع إظهار المنسدلة، حدد المخططات التفصيلية ثم حدد ملخص واضغط على موافق (الشكل 8).
ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات في https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html


الشكل 8: رسم تخطيطي لتدفق العملية المستخدمة في ImageJ لحساب الكريات البرازية. أ) استيراد تسلسل صورة في علامة التبويب ملف ImageJ. ب) زر الاستعراض في مربع الحوار "استيراد تسلسل الصور" لاستيراد سلسلة من الصور من جهاز محلي. ج) باستخدام أداة دائرة لتحديد المنطقة التي تحتوي على الكريات البراز D) مسح خارج زر في منطقة التبويب تحرير لإزالة خارج منطقة مختارة. E) جعل زر ثنائي في علامة التبويب عملية. F) تعيين زر مقياس في علامة التبويب تحليل. المسافة بالبكسل تعادل عدد وحدات البكسل لوحدة قياس واحدة (مم). G) زر تحليل الجسيمات في علامة التبويب تحليل. الحجم (الوحدة^2) المعين إلى العتبة السفلية لحجم الكريات البرازية، بالبكسل، إلى ما لا نهاية. يتم تحديد إظهار "المخططات التفصيلية" و"التلخيص". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
-
تحليل البيانات
- تحويل عدد الكريات إلى الكريات يوميا، والذي يعطي وقياس غير مباشر لمعدل التغذية. تجاهل البيانات من أي أفراد moulting في الأيام التي وقعت moulting (الشكل 9).
ملاحظة: يحدث Moulting على مدى 1-3 أيام ويمكن التعرف عليه عندما يمكن رؤية مولت كامل من الهيكل الخارجي.

الشكل 9: مثال على المولت الزجري. Gribble (L. quadripunctata) moulting، على عصا اختبار خشب الصنوبر Radiata الحجم 20 ملم × 4 ملم × 2 ملم. ويشار إلى مولتس من قبل الدوائر الحمراء. شريط مقياس 2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.