مقالة منهجية

التحليل الكمي لمعدل نمو النيدولانات Aspergillus باستخدام المجهر الحي والبرمجيات مفتوحة المصدر

DOI:

10.3791/62778

⸱

يوليو 24, 2021

 ,  ,  , 
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم بروتوكول التصوير الحي الخالي من التسمية باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المرسلة لالتقاط الصور وتحليل وقياس حركة النمو للفطريات الخيطية A. nidulans في كل من الثقافات المغمورة ووسائل الإعلام الصلبة. يمكن استخدام هذا البروتوكول بالتزامن مع المجهر الفلوري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن الثابت أن نمو مستعمرة من الفطريات الخيطية، تعتمد في الغالب على التغيرات في معدل النمو apical hyphae / mycelia، ويقدر بشكل كلي على وسائل الإعلام الصلبة من خلال مقارنة حجم المستعمرة. ومع ذلك ، لقياس كمي معدل نمو سلالات الفطريات المختلفة وراثيا أو سلالات في ظل ظروف بيئية / النمو المختلفة (درجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، ومصادر الكربون والنيتروجين ، والمضادات الحيوية ، وما إلى ذلك) أمر صعب. وهكذا، فإن السعي إلى اتباع نهج تكميلية لقياس حركة النمو يصبح إلزاميا من أجل فهم أفضل لنمو الخلايا الفطرية. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف جيدا أن الفطريات الخيطية، بما في ذلك أسبيرغيلوس SPP.، لديها أنماط متميزة من النمو والتمايز في ظل ظروف شبه جوية على وسائل الإعلام الصلبة أو الثقافات المغمورة. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة مجهرية كمية لتحليل الحركية النمو من الفطريات نموذج Aspergillus nidulans، وذلك باستخدام التصوير الحي في كل من الثقافات المغمورة ووسائل الإعلام الصلبة. نحن نلتقط الصور ونحلل ونتحديد معدلات نمو السلالات الفطرية المختلفة بطريقة قابلة للاستنساخ وموثوقة باستخدام برمجيات مفتوحة المصدر ومجانية للصور الحيوية (مثل فيجي) ، بطريقة لا تتطلب أي خبرة سابقة في تحليل الصور من المستخدم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفطريات الخيطية ذات أهمية اجتماعية واقتصادية وإيكولوجية كبيرة ، كونها حاسمة كأدوات صناعية / زراعية لإنتاج الإنزيمات والمضادات الحيوية1،2 وكعوامل ممرضة لنباتات المحاصيل3، حشرات الآفات4 والبشر3. وعلاوة على ذلك، تستخدم الفطريات الخيطية مثل النيدولان أسبيرغيلوس على نطاق واسع ككائنات نموذجية للبحوث الأساسية، مثل الدراسات في علم الوراثة والخلايا والبيولوجيا التطورية وكذلك لدراسة تمديد الواصلة5. الفطريات الخيطية هي كائنات شديدة الاستقطاب التي استطالة من خلال العرض المستمر من الدهون الغشائية / البروتينات وتوليف دي نوفو من جدار الخلية في طرف تمديد6. دور مركزي في نمو طرف الواصلة وصيانة القطبية هو هيكل متخصص يسمى 'Spitzenkorper' (SPK) ، وهو هيكل مرتبة للغاية تتكون في معظمها من مكونات الهيكل الخلوي والتوزيع المستقطب من غولجي6،7،8.

المحفزات البيئية / الإشارات، مثل هذه الواجهة المياه والهواء، والضوء،تركيز ثاني أكسيد الكربون، والحالة الغذائية هي المسؤولة عن القرارات التنموية التي اتخذتها هذه القوالب9. في الثقافات المغمورة (السائل) يتم قمع تمايز النيدولان A. ويحدث النمو عن طريق استطالة طرف الواصلة6. خلال النمو النباتي ، تنبت الجراثيم اللاجنسية (كونيديا) عن طريق التمديد apical ، وتشكيل شبكة غير متمايزة من الخلايا الواصلة المترابطة ، والميسيليوم ، والتي قد تستمر في النمو إلى أجل غير مسمى طالما تتوفر العناصر الغذائية والفضاء. من ناحية أخرى ، على نصائح الواصلة وسائل الإعلام الصلبة استطالة وبعد فترة محددة من النمو النباتي (الكفاءة التنموية) ، ويبدأ التكاثر اللاجنسي وسيقان conidiophore الجوية تمتد من خلايا القدم المتخصصة من الميسيليوم6. هذه تؤدي إلى هياكل متعددة الخلايا التنموية المتخصصة تسمى conidiophores، والتي تنتج سلاسل طويلة من haploid كونيديا10 التي يمكن أن تستأنف النمو في ظل ظروف بيئية مواتية.

وهناك طريقة تستخدم على نطاق واسع لقياس النمو الفطري الخيطي هو تطعيم الجراثيم على أجار المغذيات الواردة في طبق بيتري وقياس قطر المستعمرة بالمنظار بعد بضعة أيام11. القطر / منطقة المستعمرة ، والأكثر اعتمادا على التغيرات في معدل النمو mycelial وأقل على كثافة conidiophore12، ثم يستخدم كقيمة للنمو. على الرغم من أن قياس حجم السكان الفطرية (مستعمرة) تنمو على الأسطح الصلبة كافية جدا، فإنه ليس بأي حال من الأحوال مقياس الأكثر دقة للنمو. بالمقارنة مع متوسطات مستوى السكان (متوسطات حجم المستعمرة الفطرية) ، يمكن أن تلتقط قياسات الخلية الواحدة عدم التجانس في مجموعة الخلايا وتسمح بتحديد المجموعات الفرعية الجديدة من الخلايا ، والدول13، والديناميات ، والمسارات ، وكذلك الآليات البيولوجية التي تستجيب بها الخلايا للتغيرات الذاتية والبيئية14،15. يمكن القول إن رصد نمو الخلايا الفطرية والنمط الظاهري عن طريق المجهر الفاصل الزمني هو النهج الكمي الأكثر استخداما لمراقبة الخلايا المفردة.

هنا، نقوم بتفصيل بروتوكول التصوير الحي الخالي من التسميات باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المرسلة (مثل تباين المرحلة، وتباين التداخل التفاضلي (DIC)، والتنظير المجهري المستقطب) لالتقاط الصور، والتي يمكن استخدامها بشكل مستقل عن الاستخدام المشترك للتنظير المجهري الفلوري لتحليل وقياس النمو القطبي لسلالات النيدولان A. في كل من الثقافات المغمورة والوسائط الصلبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد إنكولوم

ملاحظة: يجب تنفيذ كافة الخطوات ضمن خزانة تدفق صفح.

  1. الشرائط من سلالة الفطرية من الاهتمام، من مخزون الجلسرين (-80 درجة مئوية) باستخدام حلقة تلقيح معقمة، على لوحات من الحد الأدنى من الوسائط (MM) تكملها المتطلبات الغذائية المناسبة ذات الصلة بالسلالة التي تم فحصها [MM: 10.0 غرام / لتر جلوكوز، 20 مل / لتر محلول ملحي (محلول الملح: 26 غرام/ لتر KCl، 26 غرام/L MgSO4·7H2O، 76 غرام/لتر KH2PO4،2.0 مل/لتر كلوروفورم) و1 مل/لتر عناصر تتبع (العناصر النزرة: 40 ملغم/لترنا 2ب4س7· H2O, 400 ملغم/لتر CuSO4, 8 غ/لتر ZnSO4, 800 ملغم/لتر MnSO4, 800 ملغم/ل فيبو4),ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 1 M NaOH, إضافة 1 ٪ (ث/v) أجار والمكملات المطلوبة كما هو موضح في16 و أوتوكلاف](الشكل 1).
    ملاحظة: محلول الملح، حل العناصر النزرة والمكملات الغذائية هي autoclaved.
  2. حضانة لمدة 2-3 أيام في 37 درجة مئوية.
  3. استخدام مسواك معقمة (أو حلقة تلقيح)، نقل عدد قليل من كونيديا، عن طريق لمس بلطف مستعمرة واحدة، إلى لوحات من وسائل الإعلام كاملة (CM) [CM: 10.0 غرام / لتر الجلوكوز، 2.0 غرام / لتر بيبتون، 1.0 غرام / لتر استخراج الخميرة، 1.0 غرام / لتر أحماض كازامينو، 20 مل / لتر محلول الملح، 1 مل / لتر العناصر النزرة، 5 مل / لتر محلول فيتامين (حل فيتامين: 0.1 غرام/لتر ريبوفلافين، 0.1 غرام/لتر نيكوتيناميد، 0.01 غرام/لتر من حمض البنزويك الأميني، 0.05 غرام/لتر بيريدوكسين HCl، 1.0 ملغم/لتر بيوتين)، ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 1 M NaOH، إضافة 1 ٪ (ث / v) أجار والمكملات المطلوبة على النحو المبين في16 وautclave]. أوتوكلاف وتخزين محلول فيتامين في زجاجة داكنة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: في حالة نمو الفطريات كثيفة جدا لتحديد وعزل المستعمرات الفردية، وإعادة خط على لوحة أجار جديدة للحصول على مستعمرات واحدة.
  4. حضانة لمدة 3-4 أيام في 37 درجة مئوية.
  5. الحصول على تعليق مرتبة من حوالي 2 × 106 خلايا / مل عن طريق خدش 1 سم من سطح مستعمرة الفطرية مرتبة نمت على لوحات أجار CM، وذلك باستخدام مسواك معقمة (الشكل S1).
    ملاحظة: عند الضرورة، عد كونيديا مع مقياس الدم.
  6. حصاد كونيديا من النيدولانات A. في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل مع 1.0 مل من الماء المقطر autoclaved تحتوي على 0.05٪ (v/v) توين 80 للحد من عدد كتل كونيديا.
    ملاحظة: يمكن تخزين كونيديا لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع عند 4 درجات مئوية دون فقدان ذي صلة بقابلية البقاء (أ. أثاناسوبولوس و ف. صوفيانوبولو، بيانات غير منشورة). ومع ذلك، فمن المستحسن لتصفية و / أو لغسل تعليق المخروطية لإزالة الأجزاء والمواد المغذية mycelial، من أجل منع تورم conidial.

2. التحضير لتصوير الفطريات الخيطية تنمو على أجار (الصلبة) وسائل

ملاحظة: يتم استخدام إصدار معدل من 'المقلوبة أجار الطريقة17،18.

  1. في البداية، بقعة 10 ميكرولتر aliquots من conidial دوامة بقوة (حوالي 2 × 104 خلايا / مل) في عدة نقاط على أطباق بيتري (Ø9 سم) 15 مل من MM مع 1٪ (ث / v) أجار (الشكل 2).
    ملاحظة: باستخدام النسخة المعدلة من "طريقة أجار مقلوبة"، فمن الممكن لتصوير عينات الفطرية لعدة ساعات دون آثار ضارة واضحة على hyphae المتنامية.
  2. احتضان الثقافة التجريبية وفقا للمرحلة التنموية التي يعتزم التحقيق فيها.
  3. قطعة من كتلة ≈0.8 ملم2 من أجار تحتوي على مستعمرة باستخدام مشرط معقم.
    ملاحظة: أبعاد كتلة أجار إلى شرائح يعتمد على أبعاد المعدات التي سيتم وضعها بعد ذلك. في العمل الحالي، يتم استخدام 8 شرائح μ جيدا (انظر أدناه).
  4. عكس ووضع كتلة أجار في بئر من الشريحة μ أو ما شابه ذلك 8 coverglass غرف مع coverlip مناسبة للتصوير الحي.
    ملاحظة: في حالة استخدام المجهر الخفيف المنقول بالاقتران مع المجهر الفلوري (وضع العلامات) ، يمكن عكس كتلة أجار على قطرة من الوسط السائل تحتوي على صبغة تلطيخ الخلية الحية ، قبل التصوير مباشرة.

3. التحضير لتصوير الفطريات الخيطية تنمو على المتوسط السائل

  1. نقل 10 ميكرولتر aliquots من تعليق كوني دوامة بقوة (حوالي 2 × 104 خلايا / مل) في آبار بئر 8 μ الشريحة التي تحتوي على 200 ميكروغرام من (السائل) MM مع المكملات المناسبة (انظر أعلاه).
  2. حضانة الوقت المطلوب في درجة الحرارة المطلوبة (الشكل 3).
    ملاحظة: إذا تم استخدام المجهر الخفيف المنقول بالاقتران مع المجهر الفلوري (وضع العلامات) ، فإن الثقافات السائلة لها ميزة كبيرة تتمثل في إمكانية إضافة الأصباغ الفلورية في أي نقطة زمنية مرغوبة أثناء التجربة19.

4. التقاط الصور

ملاحظة: اختيار المجهر يعتمد على المعدات المتاحة. على أي حال يجب أن يتضمن إعداد المجهر مرحلة مقلوبة أو غرفة بيئية أو على الأقل غرفة مع تحكم دقيق في درجة حرارة الهواء.

  1. سخني غرفة المجهر الحراري عند 37 درجة مئوية (ما لم يذكر خلاف ذلك أو مناسب للأنواع الفطرية المستخدمة) لتثبيت درجة الحرارة قبل البدء. تسمح هذه الغرفة بتعديل درجة حرارة مجهر البصريات ونماذج المرحلة خلال التجارب الفاصل الزمني. كن على علم بأن الانحرافات البصرية20 يتم إدخالها عند استخدام زيوت الغمر العادية (المصممة للاستخدام عند 23 درجة مئوية) في 37 درجة مئوية أو أكثر.
    ملاحظة: على ميزانية ضيقة، يمكن إجراء غرف الحضانة من الورق المقوى ومواد التعبئة العازلة21 أو باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد22.
  2. قم بتشغيل المجهر وطاقة الماسح الضوئي وطاقة الليزر والكمبيوتر، ثم قم بتحميل برنامج التصوير. ضع الشريحة μ (التي تم إعدادها مسبقا) في مرحلة المجهر والتركيز.
  3. ابحث عن مجالات الرؤية التي تحتوي على خلايا معزولة/غير متداخلة (أو على الأقل غير مكتظة)، من أجل تسهيل قياسات النمو أثناء تحليل الصورة. التقاط ما لا يقل عن 50 خلية متنامية لكل عينة للسماح بإجراء تحليل إحصائي قوي.
  4. حدد نهج المجهر الضوئي الذي يتم نقله. تقليل وقت التعرض أو قوة الليزر وبكسل يسكن الوقت و / أو زيادة أقطار الثقب، من أجل تقليل photobleaching من الخلايا الفطرية، كما هو موضح في مكان آخر 23،24.
  5. تعيين المجهر للحصول على الصور في فترات زمنية المطلوبة وبدء الحصول على سلسلة زمنية.
    ملاحظة: لتصحيح الانجراف البؤري بمرور الوقت (خاصة للتجارب الطويلة)، بسبب الانجراف الحراري، وأحجام الخلايا المتنوعة، وحركة الخلية استخدم استراتيجية التركيز البؤري التلقائي إذا كانت متوفرة في برنامج المجهر الخاص بك.

5. تحليل الصور

ملاحظة: يصف هذا القسم الخطوات الرئيسية لمعالجة صور المجهر الفاصل الزمني لقياس معدل نمو النيدولانات A. يتم إنجاز فتح وتصور ومعالجة الصور مع المصدر المفتوح ImageJ / فيجي البرمجيات25.

  1. استيراد الصور إلى فيجي باستخدام الإضافات | | التنسيقات الحيوية Bio-Formats المستورد من القائمة فيجي مع الإعدادات الافتراضية (الشكل 4A).
    ملاحظة: تحقق ما إذا كان مستورد التنسيقات الحيوية يتعرف بشكل صحيح على معايرة الصورة. يجب أن يكون بعد الصورة المعروض في إطار صورة حقل المعلومات العلوي مساويا لأبعاد الصورة الأصلية(الشكل 4B). اضغط على Shift + P لعرض وتغيير خصائص الصورة في برنامج ImageJ/Fiji.
  2. عند الحاجة، استخدم الرسم البياني المطابق26 لتصحيح الإضاءة بين الإطارات المختلفة (image | ضبط | | تصحيح التبييض مطابقة الرسم البياني) (الشكل 4C).
  3. عند الحاجة ، استخدم خوارزمية SIFT(الإضافات | | التسجيل محاذاة المكدس الخطي مع SIFT) لمحاذاة أو مطابقة مداخن الصور (الشكل 4D). اختيار"الترجمة"من قائمة التحول المتوقع ينبغي أن يكون كافيا لتصحيح أي الانجراف س ص.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المكونات الإضافية الأخرى لمحاذاة مجموعة من شرائح الصور، مثل مثبت الصور (https://imagej.net/Image_Stabilizer) أو StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
  4. حدد hyphae التي تنمو بالتوازي مع coverslip، وتجنب تلك التي تميل. تأكد من تحديد hyphae التي تنتشر عن طريق التمديد القطبي وتجنب الهيجة تقديم الجانبية و / أو المتفرعة apical.
  5. استخدام MTrackJ (الإضافات | MTrackJ) البرنامج المساعد لتتبع تزايد نصائح واصلة (الشكل 4E)27. لإضافة مسار، حدد الزر إضافة في شريط الأدوات ووضع النقطة الأولى في طرف واصلة باستخدام النقرة اليسرى للفأرة. سيتم نقل السلسلة الزمنية تلقائيا إلى الإطار التالي. لإكمال عملية التتبع، انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس على النقطة الأخيرة (أو اضغط على مفتاح Esc)(الشكل 4F). الانتقال إلى نقطة أخرى من الاهتمام (أي، تزايد تلميح واصلة) في الإطار الزمني الأولي وإعادة تشغيل الإجراء عن طريق قياس معدل النمو من hypha آخر.
    ملاحظة: لتثبيت MTrackJ اتبع الإرشادات المقدمة في https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
  6. انقر فوق الزر قياس في مربع الحوار MTrackJ (الشكل 4G) لفتح جدول الإخراج. حفظ قياسات المسار (ملف | حفظ ك)إلى تنسيق الملف المطلوب (على سبيل المثال، csv)، تحليل ورسم لهم(الشكل 4H).
    ملاحظة: عن طريق تحديد الزر فيلم، يتم إنتاج فيلم يعرض الصورة وتتبع التقدم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد هذا البروتوكول ، التقطنا وحللنا صورا مختلفة تتوافق مع مراحل النمو / النمو المختلفة للفطريات الخيطية A. nidulans. وقد تم تجهيز وتحليل البيانات المقدمة في هذه الدراسة باستخدام برنامج فيجي. تم حفظ القياسات كملفات csv ، وتحليلها إحصائيا وإعدادها كرسم بياني باستخدام البرامج الإحصائية التجارية و / أو لغة برمجة Python باستخدام مكتبات البرامج مثل الباندا ، والنومبى ، والإحصائيات ، والماتوبلوتليب والمولود. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل في المنشورات الأصلية المذكورة.

من أجل تفسير استجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مراقبة نمو الخلايا الفطرية والنمط الظاهري عن طريق المجهر الفاصل الزمني هو نهج قوي لتقييم السلوك الخلوي في الوقت الحقيقي وكميا ودقيقا تحديد ما إذا كان علاج المخدرات معينة و / أو التدخل الجيني يؤدي إلى نمو الخلايا التي يمكن الكشف عنها أو الاختلافات الظاهري مع مرور الوقت.

في هذه الدراسة ، وصفت منهجية تصوير موثوقة للخلايا الحية لقياس وتحليل التطور الفطري كميا ، بما في ذلك ديناميكيات الأنبوب الجرثومي ونمو طرف الواصلة في النيدولانات A.. رصد التغيرات المورفولوجية مع مرور الوقت، وذلك باستخدام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل جزئيا مشروع "بنية تحتية للبحوث اليونانية لتصور ورصد العمليات البيولوجية الأساسية (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) الذي ينفذ في إطار عمل "تعزيز البنية التحتية للبحوث والابتكار"، بتمويل من البرنامج التشغيلي "القدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار" (NSRF 2014-2020) والذي تشارك في تمويله اليونان والاتحاد الأوروبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
µ-Slide 8 WellIbidi80826شرائح التصوير
4-حمض أمينوبنزويكMerckA9878
azhAΔ ngnAΔالنمط الجيني: zhA & Delta ؛::p yrGAf ؛ ngnA & Delta ؛::p yrGAf ؛ pyroA4 pantoB100 / المراجع: مجموعة المختبر ، Athanasopoulos et al. ، 2013
Bacto Casamino AcidsGibco223030
BiotinMerckB4639
ChloroformMerck67-66-3
كبريتات النحاس (II) خماسي هيدراتMerckC8027
GlucoseMerckG8270
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareImageJ
معالجة وتحليل الصور
برنامج التلقيحMerckI8263-500EA
الحديد (III) الفوسفاتMerck1.03935
Leica Application Suite XLeica Microsystemsبرنامج المجهر
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدراتميرك63138
كبريتات المنغنيز (II) أحادي الهيدراتميركM7899
مجهر Leica TCS SP8Leica Microsystems
نيكوتيناميد (نياسيناميد)Supelco47865-U
PeptoneMillipore68971
أطباق بتري لزراعة علم الأحياء الدقيقةKISKERG090
كلوريد البوتاسيومMerckP4504
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةMerckP5655
هيدروكلوريد البيريدوكسينMerckP6280
Quali - أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1,7 مل ، DNase ، RNase وخالية من البيروجين ، معقمةKISKERG052-S
Quali - أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 2.0 مل ،KISKERG053-S
Quali معقمة - أطراف قياسية ، مشطوفة ، 100-1000 & micro ؛ LKISKERVL004G
Quali - أطراف قياسية ، مشطوفة ، 1-200 & LKISKERVL700G
Quali Microvolume Tips ، DNase - ، RNase ، 0،1-10 & micro ؛ L / واضحKISKERGC. النصائح. ب
ريبوفلافين (B2)Supelco47861
شفرات مشرط رقم 11OdontoMed2011S2771
كلوريد الصوديومMerckS7653
هيدروكسيد الصوديومMerckS8045
رباعي هيدرات الصوديومMerckS9640
VS151 (PilA-GFP و H1-mRFP)النمط الجيني: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA :: mrfp :: Afribo + riboB2 / المراجع: مجموعة المختبر ، Biratsi et al. ، 2021
WTالنمط الجيني: nkuA & Delta ؛ :: argB ؛ pyrG89 ؛ pyroA4 ؛ pyrG89 / المراجع: TN02A3 -FGSC A1149
مستخلص الخميرةMillipore70161
ZnSO4< / sub>
برنامج حلقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
  2. Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
  3. Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
  4. Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
  5. Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
  6. Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
  7. Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
  8. Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
  9. Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
  10. Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
  11. Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
  12. Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
  13. Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
  14. Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
  15. Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
  16. Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
  17. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
  18. Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
  19. Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613(2019).
  20. Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
  21. Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
  22. Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
  23. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494(2020).
  27. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  28. Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
  29. Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391(2021).
  30. Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
  31. Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
  32. Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
  33. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  34. Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705(2017).
  35. Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
  36. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  37. Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  38. Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
  39. Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ImageJ Fiji

مقالات ذات صلة