مقالة منهجية

قياس مجمعات نقل الإلكترونات الميتوكوندريا في الأنسجة القلبية المجمدة سابقا من ذرية سو: نموذج لتقييم التغيرات في الجيوجيات الحيوية الميتوكوندريا الناجمة عن ممارسة الرياضة

DOI:

10.3791/62809

⸱

أغسطس 16, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وسمح إعداد عينات غنية بالميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة المحفوظة المجمدة سابقا للمحققين بإجراء تقييمات وظيفية وتحليلية على حد سواء للميتوكوندريا في مختلف الطرائق التجريبية. توضح هذه الدراسة كيفية إعداد الاستعدادات المخصبة بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة وإجراء تقييمات تحليلية للميتوكوندريا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تعديل ملف تعريف مجمع نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) في أنسجة القلب للنسل المولود لبذر ممارس. كانت الفرضية المقترحة والمختبرة هي أن ممارسة الأمومة المنتظمة للبذر أثناء الحمل من شأنها أن تزيد من كفاءة الميتوكوندريا للذرية الحيوية للقلب. تم اختبار هذه الفرضية عن طريق عزل الميتوكوندريا باستخدام إجراء عزل خفيف لتقييم الميتوكوندريا ETC وملامح supercomplex. سمح الإجراء الموصوف هنا بمعالجة أنسجة القلب المحفوظة المجمدة سابقا وقضى على ضرورة إعداد الميتوكوندريا الطازج لتقييم مجمعات الميتوكوندريا ETC ، والتكتل الفائق ، وملامح النشاط المعقدة ETC. يصف هذا البروتوكول القياس الأمثل لمجمع بروتين ETC في الانتفاخ المناعي متعدد الأجسام المضادة والتقييم المعقد للغاية باستخدام الكهربائي الهلامي الأزرق الأصلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خطوات مفصلة للحصول على إعداد غني بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة سابقا مع تقنية جديدة من الاضطراب الميكانيكي منخفض الطاقة للأنسجة التي تحسن تحلل الأنسجة واستخراج الميتوكوندريا. مع هذه الطريقة، وتحسين كفاءة استخراج دون توليد إجهاد القص عالية أو ارتفاع درجة الحرارة ووقت التجانس قصيرة (10-12 ق) تصبح قابلة للتحقيق1.

للحصول على الميتوكوندريا من الأنسجة المجمدة المؤرشفة هو رصيدا قيما لإجراء كل من functional2 والدراسات الكيميائية الحيوية3 خلاف ذلك لا يمكن تكرارها بسهولة في ظل الظروف التجريبية الدقيقة. وقد استخدمت الكلاسيكية بوتر-Elvehjem تفلون حشرات الزجاج المتجانس أو Dounce المتجانس ولا يزال يستخدم في مختبرات البحوث لتجانس الأنسجة الرخوة مثل الكبد والكلى والدماغ. ومع ذلك، يتطلب تجانس الأنسجة الصلبة مثل العضلات والقلب المزيد من الوقت للتجانس، وعلاج الإنزيم، والتجانس عالي السرعة، وخبرة واسعة للمستخدم. هذا غير مؤات لاستخراج العضيات سليمة مثل الميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة مثل العضلات والقلب. تستخدم الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول للحصول على إعداد عالي الغلة غني بالميتوكوندريا لتحليل مجمعات البروتين في سلسلة نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) وتكوينها الفائق في أنسجة القلب التي يتم حصادها من النسل المولود لزرع التمارين الرياضية والمستقرة ، والمجمدة فلاش في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. تسمح هذه الطريقة للمستخدم بعزل إعداد الميتوكوندريا المخصب عن الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا.

يمكن أن يؤثر التعرض الخارجي للمواد النانوية للقوارض الحامل سلبا على وظيفة القلب والتنفس الميتوكوندريا والجيوجيات الحيوية على السلف أثناء الحمل4. ومع ذلك، لم يتم بعد توثيق التغيرات الإيجابية الناجمة عن التمارين الهوائية في الجيوجيات الحيوية للخلايا العضلية الجنينية أثناء الحمل. ومع ذلك، تقدم الدراسات الناشئة أدلة على أن التمارين الهوائية الأمومية أثناء الحمل لها تأثير إيجابي على وظيفة قلب الجنين5. ومن أجل تقديم المزيد من الأدلة، تم إجراء تحليل للآثار الطولية لممارسة الأمهات على مجمعات سلسلة الميتوكوندريا القلبية للنسل (أي المجمع 1 من خلال المجمع الخامس) أثناء الحمل.

هذه الدراسة لها أهمية صحية كبيرة لأن النتائج قد تشير إلى أن ممارسة الأم يحسن كفاءة إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا القلبية للذرية. في هذه الدراسة، تم استخدام البذرات (أنثى الخنزير) كنموذج حيواني لسببين: (1) فسيولوجيا القلب مشابهة ل human6، و (2) حصاد أنسجة القلب من النسل من نقاط زمنية مختلفة ممكن بموجب موافقة IACUC المؤسسية. تهدف الدراسة المقترحة إلى الإجابة على العديد من الأسئلة الأساسية التي تربط بين ممارسة الأم وآثارها الإيجابية المحتملة على التركيب الخلوي والكيميائي الحيوي لأنسجة قلب النسل. يتطلب هذا النهج تقنيات عزل الميتوكوندريا اللطيفة والفعالة من أنسجة القلب المجمدة سابقا التي تم الحصول عليها من الدراسات الطولية الطويلة والمكلفة التي تناولت قضايا التغيرات الحيوية داخل خلايا قلب الجنين أثناء الحمل. تسمح الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة باستخدام مبالغ كبيرة من الأنسجة المؤرشفة المجمدة سابقا لإعداد الميتوكوندريا المخصب لكل من الدراسات التحليلية والوظيفية. وستساعد الدراسة أيضا على سد الفجوة المعرفية في هذا المجال من خلال توفير بيانات أولية، مما قد يؤدي إلى دراسات مستقبلية تحدد آثار ممارسة الأمهات على صحة القلب في الرحم وخارجه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تلقي أنسجة القلب الذرية المجمدة من الدكتور شون الوافد الجديد جنبا إلى جنب مع رسالة موافقة IACUC المؤسسية. تم الحصول على أنسجة القلب من دراسة طولية طويلة الأجل، مجمدة فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. اتبعت جميع البروتوكولات المتعلقة بمعالجة أنسجة قلب النسل المبادئ التوجيهية للجان جامعة كانساس سيتي IBC و IACUC.

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

ملاحظة: تحضير كافة العينات وفقا إرشادات الشركة المصنعة. استخدم المياه فائقة النقاء أو ما يعادلها في جميع الوصفات وخطوات البروتوكول. ارتداء معدات الحماية الشخصية (الشماتة المختبر، قناع الوجه، قفازات، ونظارات واقية / درع الوجه) خلال هذا الإجراء. أحجام المخزن المؤقت مناسبة لمعالجة ست عينات من الأنسجة.

  1. إعداد 1.5 L الأنسجة العازلة الغسيل عن طريق الجمع بين 154.035 غرام من السكروز (0.3 M النهائي), 3.904 غرام من HEPES (10 MM النهائي), 0.111 غرام من EDTA (0.2 mM النهائي). إضافة المكونات إلى 1.0 لتر من الماء بينما على لوحة اثارة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع HCl المخفف، والماكياج إلى الحجم النهائي إلى 1.5 لتر.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ما يقرب من 200 مل من المخزن المؤقت للغسيل لكل عينة (50-300 ملغ). يمكن معالجة ست عينات من الأنسجة في يوم واحد. استخدم المخزن المؤقت المتبقي للغسيل لإنشاء مخزن مؤقت للعزل.
  2. قم بإعداد العازل العزل من المخزن المؤقت للغسيل الموصوف سابقا في الخطوة 1.1 بإضافة 210 ملغ من BSA في 210 مل من مخزن الغسيل المؤقت. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع محلول NaOH المخفف.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ما يقرب من 35 مل من العازلة العزل لكل عينة من الأنسجة; لذلك، مطلوب 210 مل من العزل المؤقت لست عينات. إعداد هذا المخزن المؤقت بإضافة حل BSA جديدة (1mg/mL النهائي) في يوم التحضير. يستخدم BSA لعزل الميتوكوندريا لأنه يحسن خصائص الميتوكوندريا عن طريق إزالة uncouplers الطبيعية مثل الأحماض الدهنية الحرة. وقد وجد أن BSA نشاط مضاد للأكسدة عن طريق زيادة معدل الأكسدة من الركائز، وخاصة succinate، في الدماغ Mitochondria7. بدلا من ذلك، يمكن استبدال الألبومين مصل البقري من قبل أقل تكلفة التناظرية خالية من الحمض مثل ovalbumin.
  3. إعداد 150 مل من العازلة إعادة الإنفاق عن طريق الجمع بين 0.011 غرام من EDTA (التركيز النهائي من EDTA 0.2 m M أو استخدام 150 ميكرولتر من 200 MM الأسهم EDTA حل ل 200 150 مل من احتياطي إعادة الإنفاق)، 12.836 غرام من السكروز (0.25 M تركيز السكروز النهائي)، و 0.236 غرام من تريس (10 mM تريس-HCl النهائي). ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 مع 0.1 N NaOH. أضف 60 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات البروتيز قبل الاستخدام مباشرة.
  4. إعداد الحل تريبسين عن طريق حل 7.5 ملغ من تريبسين في 3.0 مل من 1 مل HCl (2.5 ملغ من تريبسين / مل النهائي). هذا المبلغ يكفي لعينة واحدة.
    ملاحظة: إعداد الحل تريبسين استنادا إلى عدد عينات الأنسجة المخطط معالجتها.
  5. إعداد حل مثبط تريبسين من فول الصويا عن طريق الجمع بين 13.0 ملغ من مثبط تريبسين في 20 مل من العازلة العزلة التي تحتوي على BSA (0.65 ملغ / مل من التربسين مثبطات النهائي).
    ملاحظة: إعداد محلول مثبط التربسين الطازجة.
  6. إعداد كاشف كبريتات الأمونيوم بإضافة 0.1 غرام من كبريتات الأمونيوم في 1 مل من الماء (10٪ نهائي كبريتات الأمونيوم).
    ملاحظة: يجب أن يكون كاشف كبريتات الأمونيوم إما معد طازجا أو يمكن أن يتم اقتباس حجم كبير والاحتفاظ به في ثلاجة -20 درجة مئوية.
  7. إعداد محلول حمض أمينوكابرويك (ACA) عن طريق الجمع بين 0.131 غرام من حمض الكابرويك الأميني 6 في 1.0 مل من المياه فائقة النقاء وتخزينها في 4 درجة مئوية (1 M 6-aminocaproic حمض النهائي).
  8. إعداد محلول الصبغة الزرقاء الرائعة Coomassie عن طريق حل 1 غرام من كوماسي G-250 في 0.5 مل من الماء، و 0.5 مل من 1 M حمض أمينوكابرويك (10٪ صبغ حل التركيز النهائي).
  9. إعداد 5٪ Digitonin ل الأزرق الأصلي الصفحة (BN-PAGE). حساب تقريبا كم هو مطلوب digitonin في إعداد العينة بالإضافة إلى بعض حجم إضافي لتعويض أخطاء ماصة (المبالغة من قبل 10 ملغ). ل 15 ملغ: أولا, تمييع 15 ملغ من digitonin في 30 ميكرولتر من 100٪ DMSO. دوامة لمساعدة digitonin للوصول الى الحل. بعد ذلك، أضف المتبقية 90٪ ddH2O (270 ميكرولتر). سخني بلطف لخلط المحلول (الدوامة)، ثم قم بتبريده على الجليد.
  10. تحضير المخزن المؤقت الأصلي PAGE anode. إضافة 50 مل من 20x الصفحة الأصلية تشغيل المخزن المؤقت إلى 950 مل المياه لجعل حجم النهائي من 1 L. إعداد العازلة أنود الطازجة للاستخدام الفوري. استخدم هذا كحاجز تشغيل 1x.
  11. قم بإعداد المخزن المؤقت للكاثود الأزرق الداكن. حل 0.0160 غرام من Coomassie الأزرق الرائع G-250 في 80 مل من العازلة أنود PAGE الأصلية; مزيج جيدا.
    ملاحظة: تحضير المخزن المؤقت الكاثود الطازج للاستخدام الفوري. قد تكون هناك حاجة فقط 60 مل ولكن جعل 20 مل إضافية في حالة حدوث أي تسرب.
  12. قم بإعداد المخزن المؤقت للكاثود الأزرق الفاتح. إضافة 20 مل من العازلة الكاثود الأزرق الداكن في 180 مل من العازلة أنود PAGE الأصلية وتخلط جيدا.
    ملاحظة: يمكن استخدام هذا المخزن المؤقت مرة واحدة فقط.
  13. إعداد 5٪ كوماسي G-250 كمادة مضافة عينة. تمييع 200 ميكرولتر من 10٪ أسهم Coomassie بالفعل (الخطوة 1.8) مع 200 ميكرولتر من 1 M ACA وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  14. إعداد 4x الأصلي PAGE عينة المخزن المؤقت عن طريق الجمع بين 40٪ الجلسرين، 0.04٪ بونسو S، 25 mM تريس-HCl (pH 6.8)، 192 mM الجليسين في 10 مل من الحجم النهائي. Aliquot لهم وتخزينها في -20 درجة مئوية في الثلاجة.

2. عزل الميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة

ملاحظة: إجراء عملية عزل الميتوكوندريا في غرفة باردة 4 درجة مئوية. ومع ذلك، في حالة عدم توفر الغرفة الباردة، استخدم حمام جليدي كبير الحجم لإجراء العملية.

  1. أخرج عينات أنسجة القلب المجمدة سابقا من الفريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تتم معالجة أربع عينات من الأنسجة كحد أقصى بشكل مريح لعزل الميتوكوندريا في يوم معين.
  2. وزن الأنبوب الذي يحتوي على عينة أنسجة القلب وتسجيل الوزن. إعداد ثلاثة أكواب (كل 50 مل) تحتوي على 40 مل من العازلة الغسيل. يبرد كل كوب في حمام الملح الجليدي بكميات متساوية من الثلج والملح الممزوج لمدة 3-5 دقائق قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. وضع أشرطة التحريك المغناطيسي في كل كوب وتعيين stirrer لسرعة متوسطة.
    ملاحظة: لا تفرط في تجميد الأكواب واستخدامها مباشرة بعد أن تبدأ سحب بلورات الثلج في الظهور.
  3. ضع أنسجة القلب المجمدة مباشرة في محلول البرد الجليدي في الكأس الأول. انتظر حوالي 5 دقائق أثناء تحريك وتطبيق ضغط طفيف على الأنسجة باستخدام ملاقط للخروج من الدم قدر الإمكان.
  4. وزن أنبوب فارغ وطرح من الوزن الأصلي (الخطوة 2.2) للحصول على وزن صافي من أنسجة القلب.
  5. أخرج الأنسجة باستخدام ملقط واعصر القلب بمنشفة ورقية نظيفة من ورق التصفية لإزالة الدم. ثم ضع الأنسجة في الكأس الثاني. انتظر حوالي 5 دقائق أثناء التحريك لإزالة الدم الزائد.
  6. جفف الأنسجة برفق على منشفة ورقية. إزالة جميع الدهون والدم المتخثر والأوريسيل واللفافة (الأنسجة البيضاء). ثم، تجمع الأنسجة البطينية.
  7. أجاد عينات الأنسجة باستخدام التقطيع باتباع الخطوات 2.7.1-2.7.9.
    1. ضع أنسجة القلب (~ 50-300 ملغ) في غرفة تقطيع الأنسجة من جانب الكبش.

figure-protocol-1
الشكل 1: غرفة تقطيع الأنسجة (أنبوب) للاستخدام مع التقطيع. يتطلب تجانس الأنسجة في أنبوب التقطيع حوالي 10-12 ق لكل عينة من الأنسجة. يتم الانتهاء من تجانس الأنسجة بمجرد مرور الأنسجة المتجانسة عبر القرص المثقب إلى الغرفة العليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إضافة ~ 0.2-0.8 مل من العازلة الغسيل إلى جانب الغطاء من الأنبوب.
    ملاحظة: تأكد من أن الحجم الإجمالي للعينة وحاجز الغسيل المدمج أثناء التقطيع لا يتجاوز 0.7-0.8 مل.
  2. استخدام أداة أنبوب لسقف غرفة التقطيع مع غطاء التقطيع بشكل مريح.
    ملاحظة: لا تزيد من تشديد غطاء التقطيع.
  3. ضع غرفة التقطيع في وحدة حامل التقطيع مع جانب الكبش لأسفل. سوف الكبش إشراك المناسب في حامل التقطيع.
  4. إدراج بت من برنامج تشغيل التقطيع؛ دع البتة تتعامل مع غطاء التقطيع. تأكد من أن يتم تأمين بت بشكل مريح في مكانها.
    ملاحظة: استخدم دائما برنامج تشغيل التقطيع المشحون بالكامل.
  5. تطبيق الضغط يدويا إلى أسفل إلى التقطيع سائق وغرفة التقطيع حتى مؤشر الضغط على حامل التقطيع تصل إلى إعداد ما يقرب من 2 على حامل التقطيع.
    ملاحظة: يمكن أن يكون الإعداد على مستوى أعلى إذا كان تمزيق الأنسجة أكثر ليفية.
  6. تشغيل برنامج تشغيل التقطيع لحوالي 10-12 ق عن طريق الضغط على الزناد من سائق التقطيع، مع الحفاظ على الإعداد في 2.
  7. انظر إلى الأنبوب للتحقق مما إذا كان يتم تمزيق كل أو معظم الكتلة الصلبة للأنسجة من خلال قرص التحلل وتمريرها إلى الغرفة العليا من غرفة التقطيع من خلال النظر إلى الأنبوب.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري تمزيق عينة الأنسجة لفترة أطول. ببساطة العودة أنبوب إلى حامل التقطيع ومواصلة العملية. معظم أنواع عينات الأنسجة تتطلب فقط 10-12 ق من تمزيق. في حين أن جميع التقطيع سوف تنتج بعض الحرارة بسبب الاحتكاك، وهذا الوقت معالجة قصيرة لا تسخين العينة بشكل كبير.
  8. بعد تمزيق العينة، ارفع غرفة التقطيع من وحدة الحامل. استخدم أداة الأنبوب لإزالة غطاء التقطيع ووضعه على سطح نظيف للاستخدام لاحقا.
    ملاحظة: يجب اعتبار غطاء التقطيع ملوثا باستخراج العينة، وقد يكون ملوثا بمواد معدية اعتمادا على نوع العينة. لا تستخدم نفس غطاء التقطيع لأي عينات أخرى من الأنسجة لمنع التلوث المتبادل.
  1. نقل أنسجة القلب الممزقة إلى الكأس الثالث مع 40 مل من العازلة الغسيل ويحرك شريط ويحرك الأنسجة لمدة 5 دقائق بسرعة متوسطة بينما على لوحة اثارة.
  2. تصفية تعليق من خلال شبكة النايلون monofilament (74 ميكرومتر حجم المسام) وتجاهل filtrate. غسل الأنسجة الممزقة على مرشح 3x مع 10 مل من العازلة الغسيل.
    ملاحظة: تأكد من أن شبكة النايلون monofilament هو قبل الرطب بالماء.
  3. نقل الأنسجة المغسولة والممزقة إلى كوب 50 مل مع 20 مل من العازلة الغسيل ووضع الكأس في حمام الجليد على stirrer المغناطيسي. إضافة 0.5 مل من محلول تريبسين في حين اثارة باستمرار لمدة 15 دقيقة. في منتصف الطريق تقريبا من خلال الحضانة (في حوالي 7.5 دقيقة)، نقل تعليق الأنسجة إلى متجانس الزجاج على الزجاج المحمولة فضفاضة التي سوف تعقد 0-15 مل من حجم.

figure-protocol-2
الشكل 1: غرفة تقطيع الأنسجة (أنبوب) للاستخدام مع التقطيع. يتطلب تجانس الأنسجة في أنبوب التقطيع حوالي 10-12 ق لكل عينة من الأنسجة. يتم الانتهاء من تجانس الأنسجة بمجرد مرور الأنسجة المتجانسة عبر القرص المثقب إلى الغرفة العليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تجانس بلطف مع 4-5 السكتات الدماغية لتفريق التعليق دون إنتاج زبد. ضعي المتجانس في كوب سعة 50 مل واخلطيه برفق على طبق تحريك لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. بعد 15 دقيقة من الحضانة، أضف 10 مل من حاجز العزل الذي يحتوي على مثبط التريبسين في الكأس الذي يحتوي على المتجانسة واحتضان لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجة مئوية أثناء التحريك بلطف.
  3. تصفية تعليق مرة أخرى من خلال مرشح النايلون وحفظ filtrate في أنبوب مخروطي 50 مل.
  4. جمع جزء الجسيمات اليسار على مرشح النايلون ووضعه في التجانس الزجاج على الزجاج. إضافة 15-20 مل من العازلة الغسيل وتجانس بلطف باليد لمدة 25-30 ثانية.
    ملاحظة: تدفقات الشعيرات ببطء شديد في هذه الخطوة. لزيادة تدفق الخيوط، ضع طرف القمع الذي يلمس داخل الأنبوب المخروطي.
  5. الجمع بين المتجانسة مع filtrate، وتحقيق التوازن بين الأنابيب، والطرد المركزي في 600 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  6. تصفية supernatant الناتجة في أنبوب مخروطي جديد باستخدام مرشح النايلون لتجنب التلوث من قبل بيليه. تشغيل الطرد المركزي مرة أخرى في 8500 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدام ماصة نقل البلاستيك لإزالة supernatant والتضحية 0.2 مل من supernatant من الجزء العلوي من بيليه رقيق.
  7. تجاهل supernatant وشطف بيليه 2-3 مرات مع 1 مل من العازلة العزلة. تأكد من تجاهل طبقة الحافة الخارجية البيضاء المنفوشة في كل مرة.
    ملاحظة: غسل بيليه بإضافة العازلة العزل باستخدام ماصة مع تلميح 1 مل، أو ماصة نقل جديدة. إضافة العازلة إلى جانب الأنبوب، وليس مباشرة على بيليه، لمنع كسر بيليه ومنع تلوث supernatant. بعد ذلك، يستنشق المخزن المؤقت مع ماصة نقل وتكرار العملية مرتين أكثر.
  8. إضافة 5 مل من العازلة العزل إلى كل أنبوب وتفتيت بيليه باستخدام ماصة مع تلميح 1 مل، أو ماصة نقل جديدة.
  9. تمييع التعليق مع 20 مل من العازلة العزل إضافية وتشغيل الطرد المركزي مرة أخرى في 8500 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  10. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 5 مل من العازلة إعادة تعليق. ثم أضف 15 مل إضافية من العازلة لما مجموعه 20 مل، والطرد المركزي عند 8500 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل الناتنات الفائق. بيليه البني الناتج يحتوي على الميتوكوندريا المغسولة سليمة.
  11. إعادة إنفاق بيليه الميتوكوندريا المخصب في 250 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق, بما في ذلك مثبطات البروتيز. Aliquot في 25 ميكرولتر، وتجميد سريع في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية الفريزر العميق لعدة سنوات.
    ملاحظة: الغيار 5 ميكرولتر من إعداد الميتوكوندريا المخصب لتحليل البروتين المقايسة. لدراسة BN-PAGE (الأزرق الأصلي الصفحة)، aliquot بيليه resuspended في 50 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 8500 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يستنشق بعناية supernatant وتخزين بيليه الميتوكوندريا (50 ميكروغرام البروتين / aliquot) في الفريزر العميق -80 درجة مئوية لعدة سنوات.

3. تقييم مجمع نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC)

ملاحظة: يمكن تقييم بروتينات الميتوكوندريا ETC الفردية (أي Complex-I و II و III و IV و V) عن طريق الفحص المناعي القياسي. نظرا لمجموعة متنوعة من العينات (أربع نقاط زمنية: 48 ساعة، 3 أشهر، 6 أشهر، 9 أشهر)، شرطين تجريبيين (تمارس والمستقرة)، وعدد من الأجسام المضادة المناعية (خمسة أجسام مضادة)، ويوصى ببلوتينج المناعي متعددة. إجراء متعددة المناعة الانتفاخ على النحو التالي.

  1. حل 50 ميكروغرام من الميتوكوندريا المخصب عينة البروتين / جيدا في 4٪ -20٪ التدرج البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (100 V، 90 دقيقة).
  2. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF (75 فولت؛ 60 دقيقة)
  3. كتلة الغشاء في حل عازلة حجب لمدة لا تقل عن 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تمديد فترة الحظر حتى ليلة واحدة عند 4 درجات مئوية. يحتوي حاجز الحجب (جدول المواد) على مكونات غير ثديية (أي بروتينات الأسماك) التي يقل احتمال أن يكون لها تفاعلات ملزمة محددة مع الأجسام المضادة وكذلك بروتينات الثدييات الأخرى الموجودة بطرق نموذجية.
  4. التحقيق في الغشاء مع كوكتيل الأجسام المضادة بما في ذلك المضادة للمجمع الأول والثاني والثالث والرابع والخامس والأجسام المضادة واحتضان بين عشية وضحاها على شاكر المدارية في 4 درجة مئوية.
  5. في اليوم التالي، اغسل الغشاء والتحقيق مع الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالأشعة تحت الحمراء لمدة 2 ساعة على شاكر مداري في RT (درجة حرارة الغرفة).
  6. اغسل خمس مرات باستخدام 1x TBS-T (TBS يحتوي على توين 20)، ومرة واحدة مع 1x TBS (Tris المخزنة بالمحلول الملحي).
    ملاحظة: بالنسبة للغسيل الأخير، لا تقم بتضمين المنظفات في المخزن المؤقت TBS.
  7. صورة لطخة في محلل الصور.

4. تقييم supercomplex الميتوكوندريا من قبل الأزرق الأصلي بولي أكريلاميد جل Electrophoresis (BN-PAGE)

ملاحظة: يمكن أيضا تقييم ملف تعريف supercomplex من ETC باستخدام تقنية BN-PAGE.

  1. إعداد كوكتيل العازلة عينة ل20 ميكرولتر لكل 50 ميكروغرام الميتوكوندريا المخصب بيليه البروتين (7 ميكرولتر من الماء + 5 ميكرولتر من 4x الأصلي البولي أكريلاميد هلام الكهربائي عينة تحميل العازلة + 8 ميكرولتر من 5٪ Digitonin + 2 ميكروغرام من Coomassie G-250).
    ملاحظة: جعل كوكتيل المخزن المؤقت عينة المخزون اعتمادا على عدد العينات المتاحة (50 ميكروغرام البروتين / عينة). اختر كميات ال digitonin المناسبة استنادا إلى تركيز البروتين في بيليه الميتوكوندريا المخصب (الجدول 1)8.
  2. سخني مرقة digitonin عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، واخلطيها، وتبرد على الجليد قبل صنع المزيج الرئيسي.
  3. أضف إضافة عينة Coomassie G-250 قبل تحميل العينات في الجل.
  4. إضافة 20 ميكرولتر من كوكتيل العازلة عينة في أنبوب يحتوي على 50 ميكروغرام من بيليه البروتين الميتوكوندريا. Solubilize / resuspend بيليه عن طريق خلط بلطف بيليه مع ماصة دون توليد زبد.
  5. احتضان الخليط على الجليد لمدة 20 دقيقة لتحقيق أقصى قدر من التشحيم من بيليه الميتوكوندريا المخصب. من وقت لآخر، نفض الغبار بلطف أنابيب لتعزيز solubilization.
  6. أثناء انتظار الحضانة، قم بإعداد المخزن المؤقت ل PAGE anode/1x الذي يعمل بالمخزن المؤقت وحاجز الكاثود الأزرق الداكن اللون.
  7. الطرد المركزي بيليه الميتوكوندريا المخصب solubilized في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  8. بعد الطرد المركزي، جمع 15 ميكرولتر من supernatant في أنابيب جديدة وضعت على الجليد.
  9. إضافة المبلغ المناسب من 5٪ كوماسي G-250 كاشف إلى supernatant التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.8 (راجع الجدول 1).
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم 5٪ Coomassie G-250 بحيث يكون التركيز النهائي للصبغة هو تركيز المنظفات. قم بتنفيذ هذه الخطوة قبل تحميل العينات في الجل.
بروتينديجينتونين/بروتين4x عينة المخزن المؤقت5٪ ديجينتونينالماءالمجلد النهائي5٪ كوماسي جي-250
النسبة (g/g)عينة المضافة
50 ميكروغرام8587202
50 ميكروغرام45411201

الجدول 1: إعداد كوكتيل مخزن العينة مع اثنين من المنظفات المختلفة / نسب البروتين. لتحقيق أقصى قدر من التشحيم من البروتينات الغشائية من تعليق الميتوكوندريا، يجب تعديل تركيز بروتين التعليق الرقمي / الميتوكوندريا إلى ما بين 4-8 غرام من ال digitonin / غرام من البروتين. في أنسجة القلب، تم استخدام 400 ميكروغرام من الديجنتونين مقابل 50 ميكروغرام من بروتينات تعليق الميتوكوندريا (أي 8 جرام من بروتين الميتوكوندريا) لتعظيم قابلية الذوبان للتكتل الفائق من تعليق الميتوكوندريا.

  1. صب هلام التدرج 3٪-8٪، وإزالة المشط، وغسل آبار هلام مع 1x تشغيل العازلة ثلاث مرات.
    ملاحظة: هلام أفضل البوليمرات إذا سكب قبل يوم واحد.
  2. إعداد نظام الكهربائي ووضع الجل في الجهاز.
  3. ملء الآبار عينة مع العازلة الكاثود الأزرق الداكن اللون.
  4. تحميل 10 ميكرولتر من معيار البروتين غير الملون كعلامة الوزن الجزيئي الأصلي على البئر الأول والأخير من الجل.
  5. تحميل كامل كمية من عينة supernatant + Coomassie عينة المضافة المعدة في الخطوة 4.9 أعلاه في الآبار باستخدام رأس مسطح هلام تحميل تلميح.
  6. ملء بعناية سد العازلة الخلية المصغرة مع ما يقرب من 60 مل من العازلة الكاثود الأزرق الداكن اللون دون إزعاج العينات في الآبار، ومن ثم ملء خزان العازلة مع الصفحة الأصلية 1x تشغيل العازلة.
  7. بدوره على امدادات الطاقة وكهروفوريز العينات في 150 V لمدة 30 دقيقة تقريبا.
  8. إزالة العازلة الكاثود اللون الأزرق الداكن من السد العازلة (الغرفة الداخلية) مع ماصة نقل أو يستنشق الآبار عينة. ملء الغرفة الداخلية مع 150-200 مل من العازلة الكاثود الأزرق الفاتح اللون وتشغيل الكهربائي في 250 V لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن تحديد وقت الكهرومورفوريس عن طريق التحقق من متى تهاجر جبهة الصبغة فقط 0.5 سم فوق الجزء السفلي من كاسيت الجل.
  9. إزالة هلام من كاسيت ووضعه في وعاء من البلاستيك نظيفة. غسل هلام مع نوعية جيدة الماء المقطر لمدة 15 دقيقة على الروك / شاكر المدارية.
    ملاحظة: لإزالة الجل المتدرجة من كاسيت، التعامل مع كاسيت من أسفل، وهو أقوى، لتقليل فرص الكسر.
  10. صب قبالة الماء، وتزج هلام في كمية كافية من كوماسي GelCode الأزرق وصمة عار كاشف، واحتضان لمدة 1 ساعة على المداري / الروك في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: اخلط محلول كاشف البقع الأزرق (جدول المواد) قبل الاستخدام عن طريق تدوير الزجاجة برفق عدة مرات.
  11. Decant حل صبغ، إضافة الماء المقطر، شطف عدة مرات بالماء، ومن ثم وضعت على المداري / الروك لإزالة النباتات.
    ملاحظة: إدراج قطعة من الإسفنج (~ 3 سم × 0.5 سم) في حاوية هلام إزالة التانينج وترك هلام لإزالة التين بين عشية وضحاها. الإسفنج يدهس جزيئات الصبغة دون الحاجة إلى تغييرات المياه متعددة.
  12. تحليل الجل في محلل الصور.

5. تقييم الميتوكوندريا supercomplex عن طريق تحليل لطخة المناعة

  1. تنفيذ مجموعة جديدة من BN-PAGE دون تلطيخ هلام في نهاية الكهربائي.
  2. اتبع نفس الإجراء كما هو الحال في القسم 3 (تقييم مجمع نقل الإلكترونات الميتوكوندريا (ETC) لإكمال الانتفاخ المناعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد البروتوكول، تم إعداد غلة جيدة من خليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا من أنسجة القلب. تم الحصول على ما يقرب من 15 ملغم / مل من خليط البروتين المخصب بالميتوكوندريا من متوسط 1.2 غرام من أنسجة القلب المجمدة التي تم حصادها من ذرية البذر. كانت كمية إعداد الميتوكوندريا كافية لإجراء (1) تحليل مناعة قياسي لتقييم مجمعات نقل الإلكترونات الفردية (ETC) (أي Complex-I و II و III و IV و Complex-V) ، (2) تقييم supercomplex الميتوكوندريا من قبل تحليل BN-PAGE و immunoblot ، و (3) المقايسات الأنزيمية المحدودة للمجمع المحدد. مزيج من الأج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتم الإشارة إلى الخطوات الهامة لهذا البروتوكول هنا. أولا، ينبغي التعامل مع تجانس الأنسجة بعناية بحيث لا يتم تطبيق الآثار المفرطة خلال عملية تجانس الأنسجة. وينبغي استخدام التقطيع الأنسجة، وهو جزء من تكنولوجيا ركوب الدراجات الضغط (PCT) لتجانس الأنسجة الأولي9. هذه الخطوة سوف تقلل من دورة السكتة الدماغية المفرطة من التجانس الزجاج على الزجاج (الشكل 1B) التي قد تدمر المزيد من الميتوكوندريا الهشة بالفعل بسبب ظروف الأنسجة المجمدة. ثانيا، وزن الأنسجة المجمدة سوف تكون مهمة للحص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من خلال منحة جامعة كانساس سيتي الداخلية لعبد الباقي أغباس وزمالة أبحاث الصيف لدانيال باريرا. المؤلفون ممتنون لعمل الدكتور جان تالي التحريري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الكابرويك الأمينيسيجما / ألدريتشA2504-100G
مجموعة معقدة مضادة للهو توتال أوكسفوسInvitrogen458199
الأجسام المضادة المضادةVDAC abcamab15895استخدام 1 & جم / مل
Coomassie G-250ThermoSientific20279
Coomassie GelCode BlueThermoScientific24592
DigitoninCabiochem300410
خالط مدقة زجاجيVWRKT885451-0020
استوديو الصورLICOR
IR-Dye مترافق مضاد للأرانب AbLICORLC0725
قارئ لوحة MultiwellBioTekSynergy HT
علامة الوزن الجزيئي الأصليةThermoFisherBN2001
شعيرات أحادية شبكة النايلونجزء صغير IncCMN-74
شاكر مداريThermoScientfic
PCT التقطيعالضغط Bioscience Inc
SEA المخزن المؤقت لحجب الكتلةThermoScienctific37527
التقطيع PULSE TubePressure Bioscience IncFT500-PS
جهاز طرد مركزي سطح الطاولةEppendorf5418
TrypsinAmrescoM150-1G
مثبط التربسينAmrescoM191-1Gيتطلب تحضيرا جديدا
ل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).
  3. Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73(2019).
  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
  5. May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095(2020).
  6. Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
  7. Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  9. Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
  10. McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).
  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
  12. Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mitochondrial Electron TransferCardiac Tissue MitochondriaFrozen Tissue MitochondriaMitochondrial BioenergeticsMaternal Exercise ModelBlue Native ElectrophoresisMultiplexed ImmunoblottingSupercomplex AssessmentComplex I II ActivityMitochondria Isolation

مقالات ذات صلة