تساهم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في البيولوجيا الخلوية والاتصالات بين الخلايا. هناك حاجة إلى إجراء فحوصات عملية لتصور وقياس امتصاص المركبات الكهربائية من قبل الخلايا. يقترح البروتوكول الحالي فحص امتصاص EV من خلال استخدام التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد عبر المجهر الكونفوكوكال ، بعد عزل EV بواسطة جهاز microfluidic قائم على الترشيح النانوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خارج الخلية Vesicle امتصاص المقايسة عبر تحليل التصوير المجهر Confocal
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هناك حاجة إلى إجراء فحوصات عملية لتصور وقياس امتصاص الحويكل خارج الخلية (EV) للخلايا. يلعب امتصاص EV دورا في التواصل بين الخلايا في مختلف مجالات البحث؛ علم الأحياء السرطان، وعلم الأعصاب، وتسليم المخدرات. وقد تم الإبلاغ عن العديد من المقايسات EV امتصاص في الأدب; ومع ذلك، هناك نقص في المنهجية التجريبية العملية والمفصلة. يمكن تقييم امتصاص EV عن طريق وضع علامات فلورية على المركبات الكهربائية للكشف عن مواقعها داخل الخلايا. من الصعب التمييز بين المركبات الكهربائية الداخلية في الخلايا والمركبات الكهربائية السطحية على الخلايا ، ولكنها حاسمة ، لتحديد امتصاص EV بدقة. لذلك، يقترح في هذا العمل إجراء تقييم يحدد كفاءة امتصاص EV من خلال المجهر المفلور ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد). تم إعداد المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية باستخدام جهاز ميكروفلويدي قائم على الترشيح النانوي ، تم تصوره بواسطة المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد ، ثم تم تحليله من خلال برامج معالجة الصور المتقدمة. يوفر البروتوكول منهجية قوية لتحليل المركبات الكهربائية على المستوى الخلوي ونهجا عمليا للتحليل الفعال.
المقدمة
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جزيئات ذات حجم نانوي، ومرتبطة بالغشاء الدهني يتم تصنيفها حسب أحجامها: ectosomes (100-500 نانومتر) والإكسوسومات (50-150 نانومتر)1. تحتوي المركبات الكهربائية على الجزيئات الحيوية المختلفة، مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون. هذه الجزيئات الحيوية تنشأ من الخلايا قبل أن يتم تغليفها كشحنة والإفراج عنها في الفضاء خارج الخلية عن طريق EVs1,2,3.
نظرا لمجموعة متنوعة من حمولتها، ويعتقد أن المركبات الكهربائية تلعب دورا نشطا في الاتصالات بين الخلايا. إطلاق المركبات الكهربائية واستيعابها من قبل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. EV العزلة وعلى رقاقة المناعة الفلورسنت EV وضع العلامات
- مجموعة من وسائط ثقافة الخلية (CCM) والمعالجة المسبقة ل CCM لعزل EV
- خلايا البذور PC3 في التقاء 30٪ في قارورة ثقافة الخلية 75 سم2 . السماح للخلايا التحكم في النمو إلى التقاء 90٪ (~ 48 ساعة) في وسائل الإعلام القياسية والمكملات الخاصة بخط الخلية.
ملاحظة: لمنع المكونات المحتوية على EV من التأثير على امتصاص الخلوية (أي مصل الأبقار الجنين)، استخدم الوسائط والمكملات الغذائية المنضبة. - حصاد CCM.
- الطرد المركزي CCM في 1000 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) بيليه أي خلايا غير مرتبطة والحطام الكبير حصادها مع وسائل الإعلام. نقل supernatant إلى أنبوب مخرو....
- خلايا البذور PC3 في التقاء 30٪ في قارورة ثقافة الخلية 75 سم2 . السماح للخلايا التحكم في النمو إلى التقاء 90٪ (~ 48 ساعة) في وسائل الإعلام القياسية والمكملات الخاصة بخط الخلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وباستخدام جهاز ميكروفلويدي قائم على الترشيح النانوي، تم عزل المركبات الكهربائية من PC3 CCM وسمت بأجسام مضادة خاصة ب EV (CD63) مرتبطة بالفلوروفوري (الشكل 1). تم تصور المركبات الكهربائية المسماة بنجاح من خلال المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد (الشكل 2). تم احتضان المركبات الكهربائية المسماة بخلايا لعدة ساعات في الوسائط المستنفدة للاكسوسوم. بعد الحضانة، تم غسل الخلايا مع وسائل الإعلام المنضب exosome. تم استيعاب المركبات الكهربائية المتبقية أو الالتزام بها في الخلايا أثنا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر فحص امتصاص EV استنادا إلى التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد عبر المجهر البؤري منهجية فعالة وتحليلا حساسا. يسهل وضع العلامات الفلورية EV هذا تصور المركبات الكهربائية ويؤدي بنجاح فحص امتصاص EV دقيق. تم الإبلاغ عن الطرق السابقة لتسمية المركبات الكهربائية وإزالة الصبغة المتبقية عن طريق إزالة هطول الأمطار باستخدام الطرد الفائق (UC)؛ ومع ذلك، قد تشارك UC في تسريع المركبات الكهربائية، وقد تؤدي الصبغة المشلودة إلى إشارة إيجابية خاطئة12,13. أجهزة microfluidic ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
Y.-K. تشو هو مخترع براءات الاختراع على جهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي ، Exodisc ، المرخصة ل Labspinner (أولسان ، كوريا). جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل NCI منحة لا. U54CA143803، CA163124، CA093900، وCA143055 إلى K. J. P. وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكورية من خلال المعهد الكوري لتنمية الصناعة الصحية (KHIDI)، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (رقم المنحة: HI19C1122). عمل ج. كيم وY.-K. وتحظى تشو بدعم معهد العلوم الأساسية (IBS-R020-D1)، الذي تموله الحكومة الكورية. يشكر المؤلفون الأعضاء الحاليين والماضيين في معهد برادي للمسالك البولية، ولا سيما أعضاء مختبر بينتا-Amend، على القراءة النقدية للمخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 المضاد للإنسان CD63 الأجسام المضادة | Biolegend | 353038 | صبغة الفلورسنت مترافقة مع الأجسام المضادة الخاصة بالمركبات |
| الكهربائية CellTracker البرتقالي CMTMR صبغ | Thermo Fisher Scientific | C2927 | الخلية الحية (السيتوبلازم) كاشف وضع العلامات على الفلورسنت |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | نيكون | MRD77400 | الهدف للتصوير متحد البؤر ، NA = 1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | نيكون | MRD70200 | الهدف للتصوير متحد البؤر ، NA = 0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | جهاز ميكروفلويدي قائم على الترشيح النانوي لعزل المركبات الكهربائية |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | جهاز تشغيل ل Exodisc |
| المستنفد من Exosome FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | المغذيات لوسائط زراعة الخلايا لمجموعة EV المشتقة من خط خلايا PC3 |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) VWR | 1500-500 | المغذيات لزراعة الخلايا | |
| الماعز المضادة للفأر IgG H& L ممتص مسبقا | abcam | ab7063 | الجسم المضاد IgG للفأر للتحكم في وضع العلامات على المركبات الكهربائية |
| Ibidi USA & nbsp ؛ طبق U DISH & mu 35 مم | Ibidi | 81156 | طبق ثقافة للتصوير متحد البؤر |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | برنامج معالجة ما بعد الصور |
| نظام حاضنة + CO2< / sub> / O2< / sub> / N2< / sub> خلاط غاز | أداة الخلية الحية | TU-O-20 | نظام حاضنة للتصوير الخلوي |
| نيكون A1 HD25 / A1R HD25 | نيكون | NA | للتصوير متحد البؤر |
| مجهر نيكون Eclipse Ti | نيكون | مجهر مقلوب للتصوير متحد البؤر | |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | نيكون | 4.50.00 | برنامج معالجة الصور لمجهر نيكون |
| NTA ، NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | جهاز قياس لتركيز EV |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | برنامج الرسوم البيانية |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | المضادات الحيوية لزراعة الخلايا |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | وسائط زراعة الخلايا لزراعة خط خلايا PC3 |
| SYTO RNAاختيار صبغة الخلايا الفلورية الخضراء - محلول 5 ملي مولار في DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | صبغة الفلورسنت تلطيخ الحمض النووي الريبي لوضع العلامات على المركبات الكهربائية |
المراجع
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
