Method Article

قياس تكوين CD95 الموت المسببة للإشارات المعقدة ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يتم تقديم سير عمل تجريبي يمكن من الكشف عن معالجة caspase-8 مباشرة في مجمع الإشارات المسببة للوفاة (DISC) ويحدد تكوين هذا المجمع. هذه المنهجية لها تطبيقات واسعة النطاق، من كشف الآليات الجزيئية لمسارات موت الخلايا إلى النمذجة الديناميكية لشبكات موت الخلايا المبرمج.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التوسط في موت الخلايا المبرمج ال extrinsic عن طريق تنشيط مستقبلات الموت (DRs) مثل CD95/Fas/APO-1 أو الليغاند المسبب لداء موت الخلايا المبرمج المرتبط بعامل الورم (TRAIL) - مستقبلات 1/مستقبلات 2 (TRAIL-R1/R2). تحفيز هذه المستقبلات مع ليغاندس cognate يؤدي إلى تجميع مجمع الإشارات المسببة للموت (DISC). القرص يتكون DR، البروتين المحول Fas المرتبطة مع مجال الموت (FADD)، procaspases-8/-10، والخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتينات المثبطة للإنزيم (c-FLIPs). القرص بمثابة منصة لمعالجة procaspase -8 والتنشيط. يحدث هذا الأخير عن طريق التعتيم / oligomerization في مجال تأثير الموت (DED) خيوط تجميعها في القرص.

ويتبع تنشيط procaspase-8 معالجتها، والذي يحدث في عدة خطوات. في هذا العمل ، يتم وصف سير عمل تجريبي ثابت يسمح بقياس تكوين DISC ومعالجة procaspase-8 في هذا المجمع. ويستند سير العمل على تقنيات التكفير المناعي المدعومة بتحليل البقع الغربية. هذا سير العمل يسمح رصد دقيق لخطوات مختلفة من procaspase-8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها، وهي ذات صلة عالية للتحقيق في الآليات الجزيئية للخلايا المبرمج extrinsic.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من مستقبلات الموت الأكثر دراسة (DRs) هو CD95 (Fas, APO-1). يبدأ المسار الأبوبتوتيكي extrinsic مع تفاعل DR مع ليغند cognate لها، أي CD95L يتفاعل مع CD95 أو تريل يربط تريل-Rs. وهذا يؤدي إلى تشكيل القرص في القرص DR. المقابلة يتكون من CD95، FADD، procaspase-8/-10، وC-FLIP البروتينات1،2. وعلاوة على ذلك، يتم تجميع القرص عن طريق التفاعلات بين مجال الموت (DD) التي تحتوي على البروتينات، مثل CD95 و FADD، والبروتينات المحتوية على DED مثل FADD، procaspase-8/-10، وc-FLIP (الشكل 1). Procaspase-8 يخضع لoligomerization عن طريق جمعية من DEDs لها، مما أدى إلى تشكيل خيوط DED، تليها تنشيط procaspase-8 وتجهيزها. وهذا يؤدي إلى سلسلة كاسباس، مما يؤدي إلى موت الخلية (الشكل 1)3،4. وهكذا، procaspase-8 هو caspase البادئ المركزي للمسار الخلايا المبرمج extrinsic بوساطة CD95 أو تريل-Rs، تفعيلها في منصة الجزيئية الكلية المقابلة، القرص.

اثنين من isoforms من procaspase -8 ، وهي procaspase - 8a (p55) و -8b (p53) ، ومن المعروف أن يتم تجنيدهم في القرص5. كلا isoforms تتألف من اثنين من DEDs. يقع DED1 و DED2 في الجزء N-terminal من procaspase-8a/b متبوعا بنطاقي p18 و p10 الحفازين. كشف التحليل التفصيلي المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ل procaspase-8 DEDs عن تجميع بروتينات procaspase-8 في هياكل خيوط تسمى خيوط DED4،6. ومن اللافت للنظر أن سلاسل procaspase-8 الخطية اقترحت في البداية للمشاركة في التعتيم يليه تنشيط procaspase-8 في DISC. الآن، ومن المعروف أن تلك السلاسل ليست سوى بنية فرعية من خيوط بروكاسباس-8 DED، وهذا الأخير يتألف من ثلاث سلاسل تجميعها في الحلزون الثلاثي3،4،6،7.

عند التعتيم في خيوط DED ، تؤدي التغييرات التشكيلية في procaspase-8a /b إلى تشكيل المركز النشط للبروكاسباس -8 وتفعيله3،8. ويتبع ذلك معالجة procaspase-8 ، والتي يتم التوسط فيها عبر مسارين: الأول يمر عبر توليد منتج شق p43/p41 والثاني عبر الجيل الأولي من منتج الانقسام p30. يبدأ مسار p43/p41 من خلال انشقاق procaspase-8a/b في Asp374 ، مما أدى إلى منتجات الانقسام p43/p41 و p12 (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يتم قطع هذه الشظايا تلقائيا بشكل تحفيزي في Asp384 و Asp210/216، مما أدى إلى تشكيل التروتروترمر caspase-8 النشط، p102/p1829،10،11. وبالإضافة إلى ذلك، تبين أنه بالتوازي مع مسار p43/p41 للمعالجة، procaspase-8a/b هو أيضا مشقوق في Asp216، مما يؤدي إلى تشكيل المنتج C-محطة الانقسام p30، تليها بروتيوليسيس إلى p10 و P1810 (الشكل 2).

Procaspase-8a/b التنشيط في خيوط DED ينظم بدقة من قبل البروتينات المسماة c-FLIPs12. تحدث بروتينات c-FLIP في ثلاثة أشكال متساوية: c-FLIPLong (c-FLIPL)،c-FLIPShort (c-FLIPS)،وc-FLIPRaji (c-FLIPR). تحتوي جميع الأشكال الثلاثة على اثنين من DEDs في منطقة N-terminal الخاصة بهم. ج-فليبL أيضا C-محطة نشطة بشكل حفاز caspase مثل المجال12,13. كل isoforms قصيرة من C-FLIP-C-FLIPS و C-FLIPR-العملبطريقة مضادة للapoptotic عن طريق تعطيل تشكيل خيوط DED في القرص6,14,15. وبالإضافة إلى ذلك، C-FLIPL يمكن تنظيم caspase-8 التنشيط بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يمكن أن يؤدي إلى كل من الموالية ومكافحة apoptotic آثار16,17,18. من خلال تشكيل procaspase-8/c-FLIPL heterodimer النشطة تحفيزيا، c-FLIPL يؤدي إلى استقرار المركز النشط من procaspase-8 وتفعيله. تعتمد الدالة المؤيدة أو المضادة للأبوبتوتيك ل c-FLIPL بشكل مباشر على مقدارها في خيوط DED والمبلغ اللاحق من procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. تركيزات منخفضة أو متوسطة من C-FLIPL في DISC يؤدي إلى كميات كافية من التروديمرات procaspase-8/c-FLIPL في خيوط DED، والتي تدعم تنشيط caspase-8. في المقابل، زيادة كميات C-FLIPL يؤدي مباشرة إلى آثارها المضادة لل أبوتوبوتيك في القرص20.

معا، وتنشيط وتجهيز procaspase-8a/b في القرص هو عملية منظمة للغاية تنطوي على عدة خطوات. تناقش هذه الورقة قياس معالجة procaspase-8 مباشرة في DISC بالإضافة إلى تحليل تكوين هذا المجمع. وسيتم تقديم هذا باستخدام CD95 DISC كمجمع DR المثالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء تجارب الخلايا التائية وفقا للاتفاق الأخلاقي 42502-2-1273 Uni MD.

1. إعداد الخلايا للتجربة

ملاحظة: متوسط عدد الخلايا لهذا التكفير المناعي هو 1 × 107. يجب أن تزرع الخلايا الملتصقة قبل يوم واحد من التجربة بحيث يكون هناك 1 × 107 خلايا في يوم التجربة.

  1. إعداد الخلايا الملتصقة للتجربة
    1. البذور 5-8 × 106 خلايا معتنقة في 20 مل من المتوسط (انظر جدول المواد لتكوين) لكل شرط في أطباق 14.5 سم قبل يوم واحد من بدء التجربة.
    2. في يوم التجربة ، تأكد من أن الخلايا هي التقاء بنسبة 80-90 ٪ وتمسك الطبق. تجاهل المتوسط وإضافة وسط جديد إلى الخلايا الملتصقة.
  2. إعداد خلايا التعليق للتجربة
    1. ضع بعناية 1 × 107 خلايا تعليق في 10 مل من متوسط الثقافة (انظر جدول المواد للتكوين) لكل حالة في أطباق 14.5 سم قبل بدء التجربة مباشرة.
    2. إذا كنت تستخدم الخلايا الأساسية، قم بعزل الخلايا التائية الأساسية وفقا للإجراء21الموصوف سابقا. علاج الخلايا التائية الأولية مع 1 ميكروغرام / مل phytohemagglutinin لمدة 24 ساعة، تليها 25 U / مل IL2 العلاج لمدة 6 أيام.
    3. ضع بعناية 1 × 108 خلايا تي الأولية في 10 مل من المتوسطة الثقافة (انظر جدول المواد لتكوين) لكل شرط في أطباق 14.5 سم مباشرة قبل بدء التجربة.
      ملاحظة: ينصح بهذا العدد الأعلى من الخلايا التائية الأساسية، حيث أن هذه الخلايا أصغر.

2. CD95L التحفيز

  1. تحفيز الخلايا مع CD95L (المنتجة كما هو موضح سابقا20 أو المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد)).
    ملاحظة: تركيز CD95L ووقت التحفيز هي خلية نوع تعتمد13,15,22,23,24,25. إعداد شرط تحفيز واحد مرتين لتوليد عينة "التحكم في حبة" بالتوازي.
    1. تحفيز الخلايا الملتصقة بتركيز محدد من CD95L. عقد لوحة في زاوية وماصة ليغاند في الوسط دون لمس الخلايا الملتصقة.
    2. تحفيز خلايا التعليق مع CD95L عن طريق pipetting الحل ليغاند في تعليق الخلية.

3. حصاد الخلية وتحلل

  1. ضع أطباق الزنزانة على الثلج.
    ملاحظة: لا تجاهل الوسيطة. تطفو الخلايا المحتضرة في الوسط وهي مهمة للتحليل.
  2. إضافة 10 مل من المالحة الباردة الفوسفات المخزنة (PBS) إلى تعليق الخلية وكشط الخلايا المرفقة قبالة لوحة. جمع تعليق الخلية في أنبوب 50 مل.
  3. غسل طبق الخلية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة مرتين ووضع محلول الغسيل في نفس أنبوب 50 مل. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية.
  4. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل.
  5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
  6. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من العازلة تحلل (تحتوي على 4٪ كوكتيل مثبطات البروتيز). احتضنه لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  7. الطرد المركزي lysate في أقصى سرعة (~ 17000 × غرام)لمدة 15 دقيقة ، 4 درجة مئوية.
  8. نقل supernatant (lysate) إلى أنبوب نظيف. تجاهل بيليه. خذ 50 ميكرولتر من اللذوب في أنبوب آخر. تحليل تركيز البروتين من قبل برادفورد المقايسة واتخاذ كمية من التحلل المقابلة ل25 ميكروغرام من البروتين في قارورة. أضف مخزن التحميل المؤقت (راجع جدول المواد للتركيب) إلى القارورة. تخزينه في -20 درجة مئوية كما lysate التحكم.

4. التكفير المناعي (IP)

  1. إضافة 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة APO-1 و 10 ميكرولتر من البروتين حبات سيفاروز (أعدت على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) إلى lysate. أضف 10 ميكرولتر فقط من الخرز إلى أنبوب منفصل يحتوي على lysate (عينة محفزة) لتوليد "عنصر تحكم حبة".
    ملاحظة: استخدام نصائح pipet مع فتحات واسعة إما عن طريق قطع النصائح أو شراء نصائح خاصة للملكية الفكرية أثناء التعامل مع البروتين حبات سيفاروز.
  2. احتضان خليط من اللحواف مع الأجسام المضادة / البروتين حبات سيفاروز مع خلط لطيف بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. الطرد المركزي ليسات مع الأجسام المضادة / البروتين حبات سيفاروز في 500 × غرام لمدة 4 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى الخرز، وتكرار هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل.
  3. تجاهل الناتنات الفائق. يستنشق الخرز ويفضل مع حقنة هاملتون 50 ميكرولتر.

5. بقعة الغربية

  1. أضف 20 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 4x (انظر جدول المواد للتركيب) إلى الخرز والحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. سخني عناصر التحكم في التسليك عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تحميل الليزات، IPs، ومعيار البروتين على 12.5٪ هلام كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) (انظر جدول المواد لإعداد هلام) وتشغيل مع الجهد المستمر من 80 V.
  3. نقل البروتينات من هلام SDS إلى غشاء النيتروسليلوز.
    ملاحظة: هنا، تم استخدام تقنية شبه جافة، الأمثل للبروتينات ذات الفائدة، لنقل أكثر من 12 دقيقة (25 V؛ 2.5 A = ثابت). نقع غشاء النيتروسليلوز واثنين من مداخن نقل صغيرة الحجم في العازلة الكهربائي (انظر جدول المواد لتكوين، وإعداد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) لبضع دقائق قبل النشاف الغربي.
  4. ضع الغشاء الملطخ في صندوق وحجبه لمدة ساعة واحدة في محلول الحجب (0.1٪ توين-20 في PBS (PBST) + 5٪ حليب). احتضان الغشاء مع حل حجب تحت التحريض لطيف.
  5. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.

6. غرب كشف لطخة

  1. إضافة أول الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المشار إليها (انظر جدول المواد)إلى الغشاء واحتضانه بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع التحريض لطيف.
  2. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.
  3. احتضان الغشاء مع 20 مل من الأجسام المضادة الثانوية (المخفف 1:10،000 في PBST + 5٪ الحليب) مع اهتزاز لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.
  5. تجاهل PBST وإضافة ما يقرب من 1 مل من ركيزة البيروكسيديز الفجل إلى الغشاء.
  6. الكشف عن إشارة كيمولومينسنت (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يعتمد وقت التعرض وعدد الصور الملتقطة على كمية البروتين في الخلية وخصوصية الأجسام المضادة المستخدمة. يجب أن يتم إنشاؤه تجريبيا لكل الأجسام المضادة المستخدمة للكشف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحليل caspase -8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها في القرص CD95 ، هذه الورقة يصف سير العمل الكلاسيكية ، الذي يجمع بين الملكية الفكرية للقرص CD95 مع تحليل لطخة الغربية. وهذا يسمح للكشف عن العديد من السمات الرئيسية لتفعيل caspase-8 في DISC: تجميع منصة caspase-8-activating الجزيئية، وتجنيد procaspase-8 إلى القرص، ومعالجة هذا caspase البادئ (الشكل 1 والشكل 2). يتضمن سير العمل هذا معالجة الخلايا الحساسة مع CD95L بطريقة تعتمد على الوقت ، تليها تحللها ، وسرعة المناعة باستخ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وصف هذا النهج في البداية كيشكل وآخرون27 وقد طورته بنجاح منذ ذلك الحين عدة مجموعات. ويتعين النظر في عدة مسائل هامة من أجل كفاءة معالجة الكاسباس -8 في هذا المجمع.

أولا، من الضروري اتباع جميع خطوات الغسيل أثناء التكفير المناعي. أهمية خاصة هي الخطوات النهائية لغسل حبات سيفاروز وتجفيف حبات سيفاروز. يجب أن يتم ذلك بشكل صحيح لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء من السبق المناعي ، مما يسمح بالكشف عن تجنيد caspase-8 ومعالجته في DISC. والأهم من ذلك ، بالنسبة للتقنيات التحليلية الح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعترف بمؤسسة فيلهلم ساندر (2017.008.02)، ومركز الأنظمة الديناميكية (CDS)، الممول من قبل صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي) وبرنامج DFG (LA 2386) لدعم عملنا. نشكر كارينا غوتيك لدعمها تجاربنا. نحن نعترف البروفيسور ديرك راينهولد (OvGU، ماغديبورغ) لتوفير لنا الخلايا التائية الأولية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12.5٪ جل SDSمصنوعلاثنين من المواد الهلامية المنفصلة:
3.28 مل H2< / sub>O
2.5 مل Tris ؛ درجة الحموضة 8.8 ؛ 1.5 M
4.06 مل أكريلاميد
100 & micro ؛ L 10٪ SDS
100 & micro; L 10٪ APS
7.5 & micro ؛ L TEMED

لاثنين من المواد الهلامية التجميع:
3.1 مل H2< / sub>O
1.25 مل Tris ؛ درجة الحموضة 6.8 ؛ 1.5 م < br / > 0.5 مل أكريلاميد < br / > 50 & micro ؛ L 10٪ SDS
25 & micro; L 10٪ APS
7.5 & micro ؛ أطباق خلية L TEMED
مقاس 14.5 سمGreiner639160
أكريلاميدCarl RothA124.1
أطراف ماصة مرشح الهباء الجوي مع مرشح استرداد عالي وفتحة عريضةVWR46620-664 (أمريكا الشمالية) أو 732-0559 (أوروبا)تستخدم لسحب الخرز إلى المخفف
المضاد للأكتين AbSigma AldrichA2103: 1: 4000 في PBST + 1: 100 NaN3
anti-APO-1 Abالمقدمة في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤها بواسطة EnzoALX-805-038-C100المستخدمة فقط لترسيب المناعة
المضاد للكاسباز -10 AbBiozolMBL-M059-3التخفيف: 1: 1000 في PBST + 1: 100 NaN3< / sub>
anti-caspase-3إشارات خليةAb 9662 Sالتخفيف: 1: 2000 في PBST + 1: 100 NaN3< / sub>
مضاد للكاسباز -8 Ab C15مقدم في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤه عن طريق تخفيف ENZOALX-804-242-C100: 1:20 في PBST + 1: 100 NaN3< / sub
>anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715التخفيف: 1: 2000 في PBST + 1: 100 NaN3< / sub>
anti-c-FLIP NF6 Abالمقدمة في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤها بواسطة ENZOALX-804-961-0100التخفيف: 1:10 في PBST + 1:100 NaN3< / sub>
anti-FADD 1C4 Abالمقدمة في هذه التجارب بواسطة البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤها عن طريق تخفيف ENZOADI-AAM-212-E: 1:10 في PBST + 1: 100 NaN3< / sub>
anti-PARPإشاراتالإشارات 9542التخفيف: 1: 1000 في PBST + 1: 100 NaN3< / sub>
APSكارل روث9592.3
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
برادفورد الحل
مركز كاشف صبغة فحص البروتين 450 مل		Bio Rad500-0006المستخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
CD95Lالمقدم في هذه التجارب من قبل البروفيسور P. Krammer أو يمكن شراؤه بواسطة ENZOALX-522-020-C005
كاشف التلألؤ الكيميائي
Chem Doc XRS +		Bio Rad
كوكتيل مثبط البروتيز (الموافقة المسبقة عن علم)سيجما ألدريتش11 836 145 001محضر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
DPBS (10x) بدون Ca ، MgPAN BiotechP04-53500التخفيف 1:10 مع H2< / sub>O ، التخزين في الثلاجة
عازلة etrophoresisذاتية الصنع10x المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي:
60.6 جم Tris
288 جم جلايسين
20 جم SDS
ad 2 L H2< / sub>O
1:10 التخفيف قبل الاستخدام
جلايسينكارل روث3908.3
الماعز المضاد للفأر IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05التخفيف 1: 10.000 في PBST + 5٪ حليب
الماعز المضاد للفأر IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05التخفيف 1: 10.000 بوصة PBST + 5٪ حليب
الماعز المضاد للأرانب IgG-HRPSouthernBiotech4030-05التخفيف 1: 10.000 في PBST + 5٪ حليب
إنترلوكين -2 الإنسان (hIL-2)Merckgroup /Roche 11011456001لتنشيط الخلايا التائية
KClCarl Roth6781.2
KH2< / sub>PO4< / sub>Carl Roth3904.1
تحميل العازلة
4x Laemmli عينة عازلة ، 10 مل		Bio Rad161-0747محضرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
Luminata Forte Western HRP الركيزةMilliporeWBLUFO500
محلول التحلل العازلةذاتي الصنع13.3 مل Tris-HCl ؛ درجة الحموضة 7.4 ؛ 1.5 M
27.5 مل كلوريد الصوديوم ؛ 5 م
10 مل EDTA ؛ 2 ملم
100 مل Triton X-100
إضافة 960 مل H2< / sub>O
متوسط للخلايا الملتصقة DMEM F12 (1: 1) ث الجلوتامين المستقر ،   ؛ 2،438 جم / لترPAN BiotechP04-41154إضافة 10٪ FCS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 0.0001٪ بوروميسين إلى الوسط المتوسط
للخلايا التائيةالأولية gibco بواسطة Life Technologie21875034إضافة 10٪ FCS و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين إلى
مسحوق الحليبCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTذاتي الصنع20x PBST:
230 جم كلوريد الصوديوم
8 جم KCl
56.8 جم Na2HPO4
8 g KH2PO4< / sub>
20 مل Tween-20
ad 2 L H2< / sub>O
التخفيف 1:20 قبل الاستخدام
PBST + 5٪ حليبذاتي الصنع50 جرام حليب مجفف + 1 لتر PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801 لتنشيط الخلايا التائية
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373استخدام بين 3-5 & micro; L
بروتين A Sepharose CL-4B حباتNovodirect / Th.GeyerGE 17-0780-01حبات راتنج التقارب المحضرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
مكشطةVWR734-2602
SDSكارل روث4360.2
شاكرهايدولف
أزيد الصوديومكارل روثK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo مداخن نقل صغيرة الحجمBio Rad170-4270المستخدمة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBioRad 10026938التحضير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
TransBlot Turbo غشاء نيتروسلولوز صغير الحجمBio Rad170-4270تستخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8،08،51،000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974،1000
ذاتيا Ab المتوسط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Death Inducing Signaling ComplexProcaspase 8 ProcessingCD95 DISC FormationExtrinsic ApoptosisImmunoprecipitation TechniqueWestern BlotCaspase 8 ActivationFADD Recruitmentc FLIP ProteinsCaspase 8 Activity Assay

Related Articles