يوضح هذا البروتوكول تصوير ديكستران في الخلايا الحية باستخدام الامتصاص المستمر والصور العكسية لتحسين تصور الكشكشة ونضج الماكروبينوسوم وتحليل ديكستران وملصقات الخلايا الأخرى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التألق الحي ، والتصوير العكسي لكشكشة الخلايا ، وكثرة الخلايا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كثرة الخلايا العصبية هي عملية محفوظة للغاية ولكنها لا تزال غير مفهومة تماما وهي ضرورية لامتصاص وابتلاع السوائل والمغذيات في الطور السائل والمواد الأخرى في الخلايا. يعد الامتداد الدراماتيكي للكشكشة على سطح الخلية ، وإغلاقها لتشكيل الماكروبينوسومات ، ونضج الماكروبينوسومات الداخلية أحداثا رئيسية في هذا المسار قد يكون من الصعب التقاطها باستخدام التصوير متحد البؤر التقليدي القائم على تتبع بلعة من البضائع الفلورية. تستخدم دكسترونات الفلورسنت بشكل شائع تجريبيا كعلامات طور السوائل للماسروبينوسومات وللمسارات الداخلية الأخرى. تتضمن الطريقة التي اعتمدها المختبر لتحسين تصوير امتصاص ديكستران استخدام التصوير الحي للخلايا المغمورة بتركيزات عالية من ديكستران الفلورسنت في الوسط ، مع ظهور الخلايا غير المسماة بارزة (باللون الأسود). يتم تمييز كشكشة الخلية لتصور إغلاق الكشكشة ، وتظهر الماكروبينوسومات الداخلية على شكل فجوات فلورية في داخل الخلية. هذه الطريقة هي الأمثل لتصور ميزات الماكروبينوسوم وتسمح بسهولة التجزئة والقياس الكمي. تصف هذه الورقة الملصقات المزدوجة للمسارات ذات الديكستران ذات الأحجام المختلفة والتعبير المشترك عن مجسات الدهون وبروتينات الغشاء الفلوري لتمييز الماكروبينوسومات والجسيمات الداخلية الأخرى. كما تم توضيح اكتشاف ديكستران الداخلي على مستوى البنية التحتية باستخدام الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني (CLEM). يمكن تصوير هذه العمليات الخلوية باستخدام طرق تصوير حية متعددة ، بما في ذلك ثلاثية الأبعاد. مجتمعة ، تعمل هذه الأساليب على تحسين تصوير الماكروبينوسوم للعديد من الإعدادات والأنظمة التجريبية المختلفة.
المقدمة
تشترك معظم أنواع الخلايا الفقارية في القدرة الفطرية على الامتصاص غير الانتقائي للسوائل مع أسلافها طوال التطور ، والتي يعود تاريخها إلى الأميبا أحادية الخلية1. تستخدم الأميبا هذه العملية المحفوظة للغاية لامتصاص طور السوائل عن طريق كثرة الخلايا الكبيرة (الشرب الكبير) في المقام الأول لاكتساب المغذيات1 ، بينما في الخلايا الفقارية ، يمكن أن تكون بالمثل طريقا للإمداد للحصول على العناصر الغذائية تحت الضغط ، وتستخدمها الخلايا المناعية لأخذ العينات ومراقبة بيئات الأنسجة2. يتميز كثرة الخلايا العصبية بميزات تميزه عن الأشكال الأخرى للالتقام الخلوي ، بما في ذلك الماكروبينوسوما....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير الخلايا على أطباق ذات قاع زجاجي 35 مم (اليوم 0)
- الحفاظ على خطوط الخلايا وتمريرها في وسط كامل مكمل بنسبة 10٪ معطل حراريا (ل RAW264.7) أو مصل ربلة الساق الجنينية العادي و 1٪ L-glutamine ، عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب 5٪ CO2 .
- قم بلوحة العدد المناسب من الخلايا لتحقيق التقاء بنسبة 60٪ في 24 ساعة ، على أطباق ذات قاع زجاجي 35 مم.
ملاحظة: تتراوح كثافة الخلايا الموصى بها بين 2 مل من 0.15 × 106 خلايا / مل إلى 0.25 × 106 خلايا / مل لخلايا سرطان الثدي RAW264.7 و BV2 microglial و MDA-MB 231 خلايا سرطان الثدي الموضحة هنا.
2. تعداء بلازميد الحمض ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إن نهج تصوير الخلايا الحية غير المسماة المغمورة في تركيز عال من ديكستران الفلورسنت له العديد من المزايا مقارنة بتقنيات التصوير التقليدية لتتبع كثرة الخلايا الكبيرة. من خلال تقديم الصور بشكل مريح ، تظهر أجسام الخلايا باللون الأسود وتسمح بتصور محسن لسطح الخلية الدراماتيكي الذي يتدحرج على خلفية فلورية مشرقة ، متبوعا باستيعاب طور السائل للماكروبينوسومات المملوءة ب TMR dextrann (70 kDa) كما هو موضح في الشكل 1 أ. في هذا الإسقاط الشديد الشدة ، يتم تسجيل خلية سرطانية مع دخول الماكروبينوسومات إلى الخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تصف هذه الورقة الاختلافات في الطرق الأكثر تقليدية لاستخدام ملصقات ديكستران لتتبع كثرة الخلايا الكبيرة ، بناء على التصوير الحي للخلايا المغمورة باستمرار في ديكستران (ديكستران) الفلورسنت وتصور الامتصاص على الخلفية السوداء للخلايا غير المصنفة. يوفر البروتوكول المحسن وسيلة للتمييز بين الحويصلات المختلفة داخل الخلايا ويسمح بالتتبع المكاني والزماني للعديد من الشحنات والبروتينات الكبيرة والخلية الداخلية. تم عرض طريقة غمر الخلايا في وسط ديكستران لمراقبة العملية الديناميكية لامتصاص طور السوائل لأ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفان تاتيانا خروميخ على مساعدتها الفنية المتخصصة. تم إجراء التصوير الفلوري في الفحص المجهري IMB الذي يتضمن مرفق البنية التحتية والوظيفة للسرطان الممول من المؤسسة الأسترالية لأبحاث السرطان. تم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني في مركز الفحص المجهري والتحليل المجهري بجامعة كوينز. تم تلقي التمويل من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (JLS APP1176209) ومجلس البحوث الأسترالي (DP180101910). يتم دعم NDC كعالم تصوير CZI من خلال المنحة رقم 2020-225648 من مبادرة Chan Zuckerberg DAF ، وهو صندوق استشاري لمؤسسة مجتمع وادي السيليكون. تم دعم YH من خلال منحة دكتوراه من الحكومة الأسترالية وبتمويل من برنامج أبحاث Yulgilbar Alzheimer. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2٪ أوزميوم رباعي أكسيد | ProSciTech | EMS19192 | |
| 647-Transferrin | المجسات الجزيئية ، Invitrogen | ؛ T23366 | |
| BV2 خلايا | هدية مقدمة لنا من قبل الدكتور ليفيو بوديا (معهد كوينزلاند للدماغ) | - | |
| CpG (الفئة ب) ب | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | طلب | |
| ديكستران أليكسا فلور 488 ؛ في 10 كيلو دالتون MW | Life Technology Australia Pty Ltd | D22910 | |
| Dextران Alexa Fluor 647 ؛ في 10 كيلو دالتون MW | Life Technology Australia Pty Ltd | D22914 | |
| ديكستران أوريغون جرين 488 بسعر 70 كيلو دالتون ميجاوات | لايف تكنولوجي أستراليا بي تي واي المحدودة | D1818 | |
| ديكستران تتراميثيل رودامين بسعر 70 كيلو دالتون ميجاوات | لايف تكنولوجي أستراليا بي تي واي المحدودة | D7173 | |
| DMEM وسط مع بيروفات الصوديوم و L-جلوتامين | جيبكو إنفيتروجين | # 11995 | |
| مصل عجل الجنين | خدمات البتروث بي تي واي المحدودة | SFBS-F | |
| محلول مائي من الجلوتارالديهايد ، EM Grade 25٪ | ProSciTech | C002 | |
| Jeol 1011 مجهر إلكتروني | JEOL-L-Glutamine | ||
| Gibco Invitrogen | 25030081 | ||
| Lipofectamine 2000 | Gibco Invitrogen | 11668019 | |
| MatTek & nbsp ؛ طبق زجاجي سفلي 35 مم ، شبكة غير مطلية | MatTek Corporation | P35G-2-14-CGRD | |
| أطباق قاع زجاجية MatTek 35 مم غير مطلية | MatTek Corporation | P35G-1.5-14C | |
| MDA-MB 231 خلية | ATCC | HTB-26 | |
| Opti-MEM مصل مخفض متوسط | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| بلازميد mCherry-2XFYVE | هدية تفضل قدمها لنا الدكتور فريدريك مونييه (جامعة كوينزلاند) | - | |
| البلازميد mCherry-PLC & delta ؛ - هدية PH | تفضل قدمها لنا الدكتور فريدريك مونييه (جامعة كوينزلاند) | - | |
| Raw264.7 خلايا | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI المتوسطة 1640 ، بدون L-glutamine | Gibco Invitrogen | # 21870 | |
| Ultrapure LPS | Jomar Life Research Pte Ltd | TLR-3PELPS | |
| أسيتات اليورانيل | ProSciTech | C079 | |
| Zeiss مقلوب LSM880 مجهر متحد البؤر | Zeiss | - |
المراجع
- King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
- Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
