تلعب التفاعلات الانتقالية المشتركة دورا حاسما في تعديلات السلسلة الوليدة واستهداف مسارات الطي والتجميع. هنا ، نصف التنميط الريبوسومي الانتقائي ، وهي طريقة للتحليل المباشر لهذه التفاعلات في الجسم الحي في نموذج حقيقيات النوى Saccharomyces cerevisiae.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحديد العالمي لشبكات التفاعل الانتقالي المشترك عن طريق التنميط الريبوسومي الانتقائي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في السنوات الأخيرة ، أصبح من الواضح أن الريبوسومات لا تقوم فقط بفك تشفير الحمض النووي الريبي المرسال لدينا ولكن أيضا توجه ظهور سلسلة الببتيد المتعدد في البيئة الخلوية المزدحمة. توفر الريبوسومات منصة للربط الذي يتم التحكم فيه مكانيا وحركيا لعوامل استهداف الأغشية ، وتعديل الإنزيمات ، والمرافقين القابلة للطي. حتى التجميع في مجمعات قليلة الجودة عالية الترتيب ، وكذلك خطوات تكوين شبكة البروتين والبروتين ، تم اكتشافه مؤخرا ليتم تنسيقه مع التوليف.
هنا ، نصف التنميط الريبوسومي الانتقائي ، وهي طريقة تم تطويرها لالتقاط التفاعلات الانتقالية المشتركة في الجسم الحي. سنقوم بتفصيل مختلف خطوات تنقية التقارب المطلوبة لالتقاط مجمعات سلسلة الريبوسوم الوليدة جنبا إلى جنب مع التفاعلات الانتقالية المشتركة ، بالإضافة إلى استخراج الحمض النووي الريبي المرسال ، واستبعاد الحجم ، والنسخ العكسي ، والتسلسل العميق ، وخطوات تحليل البيانات الضخمة ، المطلوبة لفك رموز التفاعلات الانتقالية المشتركة بدقة قريبة من الكودون.
المقدمة
Selective Ribosome Profiling (SeRP) هي الطريقة الوحيدة ، حتى الآن ، التي تلتقط وتميز التفاعلات الانتقالية المشتركة ، في الجسم الحي ، بطريقة مباشرة1،2،3،4،5،6. يتيح SeRP التنميط العالمي للتفاعلات لأي عامل مع ترجمة الريبوسومات بدقة قريبة من الكودون 2,7.
تعتمد هذه الطريقة على التجميد المفاجئ للخلايا المتنامية والحفاظ على الترجمة النشطة. ثم يتم التعامل مع محللات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليد سلالات لتنميط الريبوسوم الانتقائي
ملاحظة: Selective Ribosome Profiling (SeRP) هي طريقة تعتمد على تنقية التقارب لعوامل الاهتمام ، لتقييم طريقة تفاعلها مع مجمعات سلسلة الريبوسومات الوليدة. يتم استخدام إعادة التركيب المتماثلة 9 ، بالإضافة إلى الطرقالمستندة إلى CRISPR / Cas910 لدمج مختلف العوامل ذات الأهمية مع علامات لتنقية التقارب. هذه العلامات هي GFP ، لتنقية تقارب GFP-trap ، و TAP-tag لتنقية حبات IgG-Sepharose بالإضافة إلى AVI-Tag التي تم تنقيتها بواسطة avidin أو streptavidin ، لسرد بعض الأمثلة الناجحة من السنوات الأخيرة.
- قم بإجراء فحوصات النمو أو الفحص ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كما هو موضح في مخطط التدفق لهذا البروتوكول (الشكل 1) ، نمت الخلايا إلى مرحلة التسجيل ، ثم تم جمعها بسرعة عن طريق الترشيح وحلها عن طريق الطحن المبرد. ثم تم تقسيم الليزات إلى قسمين: أحدهما لإجمالي آثار أقدام الحمض النووي الريبوزي المرسال المحمية من الريبوسوم والآخر لآثار أقدام الحمض النووي الريبوزي المرسال المحمية من الريبوسوم المختارة ، والتي أجرينا عليها تنقية التقارب لسحب مجمعات سلاسل البروتين الريبوسوم الوليدة الموسومة بالبروتين. لقد ضمنا التعبير عن البروتين الموسوم ونجاح السحب لأسفل من خل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، يفصل البروتوكول نهج التنميط الريبوسومي الانتقائي لالتقاط التفاعلات الانتقالية المشتركة بدقة قريبة من الكودون. مع ارتفاع الريبوسوم كمركز لتنسيق ظهور السلسلة الوليدة في السيتوبلازم المزدحم ، تعد هذه طريقة حاسمة لتحديد وتوصيف مختلف التفاعلات الانتقالية المشتركة المطلوبة لضمان وجود بروتين وظيفي ، وكذلك لدراسة الأمراض المختلفة. حتى الآن ، SeRP هي الطريقة الوحيدة التي يمكنها التقاط وتوصيف هذه التفاعلات ، بطريقة مباشرة ، في الجسم الحي14،15،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نشكر جميع أعضاء المختبر على المناقشات المثمرة ومحمد مخزومي على القراءة النقدية للمخطوطة. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة ISF (مؤسسة العلوم الإسرائيلية) 2106/20.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3'-فسفرة 28 nt التحكم في الحمض النووي الريبي قليل النوكليوتيد | IDT | طلب مخصص | تنقية HPLC خالية من RNase ؛ 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCC GACGCGA / 3Fos / -3'Absolute |
| ethanol | VWR | 20821 | |
| حمض الفينول &ndash ؛ الكلوروفورم | أمبيون | AM9722 | |
| الجسم المضاد: الفأر أحادي النسيلة المضاد ل HA | Merck | 11583816001 | 12CA5 |
| أبروتينين | روث | A162.3 | |
| ATP * | NEB | P0756S | 10 ملي مولار |
| باكتو أجار | BD | 214030 | |
| بكتو الببتون | BD | 211820 | |
| باكتو تريبتون | BD | مستخلص | |
| Bacto | BD | 212720 | |
| بيستاتين هيدروكلوريد | روث | 2937.2 | |
| كلوروفورم | ميرك | 102445 | |
| CircLigase II ssDNA Ligase * | مركز الزلزال | CL9025K | 100 U/&mu ؛ L |
| محلول تلطيخ Coomassie الغروي | Roth | 4829 | |
| cOmplete ، أقراص كوكتيل مثبطات البروتياز الخالية من EDTA | Roche Diagnostics | 29384100 | |
| Cycloheximide | Biological Industries | A0879 | |
| DEPC المياه المعالجة والمعقمة المفلترة * | Sigma | 95284 | |
| D-Glucose اللامائي | Merck | G5767-500G | |
| ثنائي إيثيل بيروكربونات | روث | K028 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد * | سيجما ألدريتش | 276855 | |
| سلم الحمض النووي ، 10 نقطة أساس O'RangeRuler * | صبغة تحميل الحمض النووي Thermo Fisher Scientific | SM1313 | |
| * | Thermo Fisher Scientific | R0631 | 6 & مرات ؛ |
| DNase I ، | Roche 4716728001 | RNAse | |
| * | NEB | N0446S | |
| EDTA * | Roth | 8043 | |
| Glycerol | VWR | 24388.260. | |
| محلول جلايسين | سيجما ألدريتش | 67419-1ML-F | 1 م |
| جليكو بلو | أمبيون | AM9516 | 15 مجم / مل |
| هيبس | روث | HN78.3 | |
| HF فوسيون بوليميراز * | NEB | M0530L | |
| هونج كونج من S. cerevisiae | Sigma-Aldrich | H6380-1.5KU | |
| حمض الهيدروكلوريك | AppliChem | A1305 | |
| الأيزوبروبانول | سيجما ألدريتش | 33539 | |
| الأيزوبروبيل بيتا ؛ -D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد | روث | CN08 | |
| كاناميسين | روث | T832.4 | |
| KCl | روث | 6781.1 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Roth | 3904.1 | |
| Leupeptin | Roth | CN33.4 | |
| Linker L (rt) | IDT | طلب | |
| النيتروجين | |||
| MgCl 2< / sub> | Roth | KK36.3 | |
| Na2< / sub>HPO4< / sub> | Roth | P030.2 | |
| Na2< / sub>HPO4< / sub>· 2H2O | Roth | T879.3 | |
| NaCl* | Invitrogen | AM97606 | 5 M |
| NaH2PO4· H2< / sub>O | Roth | K300.2 | |
| سيفاروس المنشط من NHS 4 حبات سريعة التدفق | GE علوم الحياة | 17090601 | |
| Nonidet P 40 بديل | سيجما | 74385 | |
| بيبستاتين إيه | روث | 2936.2 | |
| فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد | روث | 6367 | |
| المواد الهلامية مسبقة الصب | Bio-Rad | 5671034 | 10٪ و 12٪ |
| RNase I | Ambion | AM2294 | |
| SDS ، 20٪ | Ambion | AM9820 | RNase |
| خالية من أسيتات الصوديوم * | Ambion | AM9740 | 3 M ، درجة الحموضة 5.5 |
| أزيد الصوديوم | Merck | S8032-100G | |
| كلوريد الصوديوم | روث | 9265 | |
| هيدروكسيد الصوديوم * | Sigma | S2770 | 1 N |
| السكروز | سيجما ألدريتش | 16104 | |
| مثبط RNase SUPERase-In | Ambion | AM2694 | |
| Superscript III Transciptase العكسي * | Invitrogen | 18080-044 | |
| SYBR Gold * | Invitrogen | S11494 | |
| T4 عديد النوكليوتيدات كيناز * | NEB | M0201L | |
| T4 RNA ligase 2 * | NEB | M0242L | |
| جل بولي أكريلاميد TBE * | Novex | EC6215BOX | 8٪ |
| TBE &ndash ؛ جل بولي أكريلاميد اليوريا * | Novex | EC68752BOX | 10٪ |
| TBE &ndash ؛ جل بولي أكريلاميد اليوريا * | Novex | EC6885BOX | 15٪ |
| TBE &ndash ؛ المخزن المؤقت لعينة اليوريا * | Novex | LC6876 | 2 & مرات ؛ |
| تريس | روث | 4855 | |
| تريس * | أمبيون | AM9851 | 1 م ، درجة الحموضة 7.0 |
| تريس * | أمبيون | AM9856 | 1 م ، درجة الحموضة 8.0 |
| فائقة النقاء 10 مرات ؛ عازلة TBE * | Invitrogen | 15581-044 | |
| * - لحشية إعداد | |||
| المكتبة ومشبك زنبركي ، 90 مم ، | Millipore | ؛ XX1009020 | |
| قارورة مفصل أرضية 1 لتر ، | ميليبور | XX1504705 |
المراجع
- Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryo....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
