مقالة منهجية

تحليل الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية الفئرانية باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية

DOI:

10.3791/62880

⸱

سبتمبر 17, 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في عضويات الفئران المعوية باستخدام التصوير النوعي ومقايسات قياس الخلايا الكمية. يمكن توسيع هذا العمل ليشمل مجسات الفلورسنت الأخرى لاختبار تأثير المركبات المختارة على ROS.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أدوارا أساسية في التوازن المعوي. ROS هي منتجات ثانوية طبيعية لعملية التمثيل الغذائي للخلايا. يتم إنتاجها استجابة للعدوى أو الإصابة على مستوى الغشاء المخاطي لأنها تشارك في الاستجابات المضادة للميكروبات والتئام الجروح. كما أنها رسل ثانويون مهمون ، ينظمون العديد من المسارات ، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. من ناحية أخرى ، تؤدي مستويات ROS المفرطة إلى الإجهاد التأكسدي ، والذي يمكن أن يكون ضارا بالخلايا ويفضل الأمراض المعوية مثل الالتهاب المزمن أو السرطان. يوفر هذا العمل طريقة مباشرة للكشف عن ROS في عضويات الفئران المعوية عن طريق التصوير الحي وقياس التدفق الخلوي ، باستخدام مسبار فلوروجيني متاح تجاريا. هنا يصف البروتوكول فحص تأثير المركبات التي تعدل توازن الأكسدة والاختزال في المواد العضوية المعوية وتكشف عن مستويات ROS في أنواع محددة من الخلايا المعوية ، ويتضح هنا من خلال تحليل الخلايا الجذعية المعوية المصنفة وراثيا مع GFP. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع مجسات الفلورسنت الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي منتجات ثانوية طبيعية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. كما يمكن إنتاجها بنشاط بواسطة مجمعات إنزيمية متخصصة مثل NADPH-Oxidases المرتبط بالغشاء (NOX) و Dual Oxidases (DUOX) ، والتي تولد أنيون فائق الأكسيد وبيروكسيد الهيدروجين 1. من خلال التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة وكاسحات ROS ، يمكن للخلايا ضبط توازن الأكسدة والاختزال بدقة ، وبالتالي حماية توازن الأنسجة 2. على الرغم من أن ROS يمكن أن يكون شديد السمية للخلايا ويتلف الحمض النووي والبروتينات والدهون ، إلا أنها جزيئات إشارة حاسمة2. في الظهارة المعوية ، هناك حاجة إلى مستويات ROS معتدلة لانتشار الخلايا الجذعية والسلف 3 ؛ مستويات ROS العالية تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج 4. يرتبط الإجهاد التأكسدي المزمن بالعديد من أمراض الجهاز الهضمي ، مثل أمراض الأمعاء الالتهابية أو السرطان. على سبيل المثال ، في نموذج الفأر لسرطان الأمعاء الذي يحركه Wnt ، وجد أن إنتاج ROS المرتفع من خلال تنشيط NADPH-oxidases مطلوب لفرط انتشار الخلايا السرطانية5,6. إن تحديد كيفية إدارة الخلايا المعوية، وخاصة الخلايا الجذعية، والخلايا الجذعية للإجهاد التأكسدي وكيف يمكن للبيئة الخلوية أن تؤثر على هذه القدرة أمر ضروري لفهم مسببات هذا المرض بشكل أفضل7.

في الأنسجة ، تقدم أنواع الخلايا المختلفة حالة أكسدة قاعدية قد تختلف وفقا لوظيفتها والتمثيل الغذائي والتعبير عن مستويات متفاوتة من جزيئات المؤكسدة ومضادات الأكسدة4,7. مراقبة ROS في الجسم الحي أمر صعب للغاية. تم تطوير أصباغ نفاذية للخلايا تنبعث منها التألق وفقا لحالة الأكسدة والاختزال الخاصة بها لتصور وقياس ROS الخلوي في الخلايا الحية والحيوانات. ومع ذلك، تعتمد فعاليتها على انتشارها داخل الأنسجة الحية وقراءتها السريعة، مما يجعل من الصعب استخدامها في النماذج الحيوانية8.

في الماضي ، تم إجراء دراسة تأثير المركبات على توليد ROS باستخدام خطوط الخلايا ، ولكن هذا قد لا يعكس الوضع في الجسم الحي . النموذج العضوي المعوي ، الذي طورته مجموعة Clevers9 ، يمكن من نمو الخلايا الأولية المعوية خارج الجسم الحي. تؤدي زراعة الخبايا المعوية في المصفوفات ، في وجود عوامل نمو محددة ، إلى هياكل ثلاثية الأبعاد ، تسمى المواد العضوية (الأمعاء الصغيرة) ، والتي تعيد إنتاج تنظيم الزغابات ، مع خلايا من سلالات ظهارية مختلفة تبطن تجويفا داخليا ، والخلايا الجذعية المعوية الموجودة في نتوءات صغيرة تشبه الخبايا.

هنا ، بالاستفادة من هذا النموذج ، يتم وصف طريقة بسيطة لدراسة الإجهاد التأكسدي في الخلايا المعوية الأولية بدقة خلية واحدة عن طريق إضافة صبغة حساسة ل ROS متاحة تجاريا إلى وسط الثقافة العضوية.

غالبا ما تستخدم قارئات اللوحات للكشف عن إنتاج ROS في إجمالي عدد السكان. يستخدم هذا البروتوكول قياس التدفق الخلوي أو فحص التصوير للكشف عن ROS في نوع معين من الخلايا مع خلايا معدلة وراثيا أو تلطيخ معين للأجسام المضادة. يتضمن هذا العمل زراعة الأعضاء المعوية للفئران وتصور ROS عن طريق التصوير البؤري والقياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي. باستخدام Lgr5-GFP من الفئران العضوية المعوية الصغيرة المشتقة ، من الممكن تحليل مستوى الإجهاد التأكسدي في الخلايا الجذعية المعوية على وجه التحديد بناء على علاجات مختلفة. يمكن تكييف هذا البروتوكول لاختبار تأثير الجزيئات الخارجية ، مثل موراميل ثنائي الببتيد المشتق من الميكروبات (MDP)10 ، على توازن ROS ، بعد تحفيز المواد العضوية مع المركبات المختارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بعد موافقة لجنة استخدام معهد باستور ووزارة الزراعة الفرنسية رقم 2016-0022. يتم تنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء محرك السيارة لزراعة الأنسجة.

1. إعداد الكواشف والمواد اللازمة لزراعة المواد العضوية المعوية

  1. لإعداد وسط زراعة النمو ، امزج DMEM / F-12 المتقدم المكمل بمحلول 1x glutamine ، محلول 1x penicillin / streptomycin (P / S) ، 10 mM من HEPES ، 50 نانوغرام / مل من الفئران EGF ، 20 ميكروغرام / مل من الفئران Noggin 500 نانوغرام / مل من الفأر R-Spondin1 (انظر جدول المواد). اترك الوسط في درجة حرارة الغرفة (RT) أثناء استخراج السرداب.
    ملاحظة: قم بتجميد الوسط غير المستخدم في الأليكوتس عند -20 درجة مئوية. تجنب التجميد والذوبان.
  2. املأ أنبوبا سعة 50 مل ب 40 مل من DMEM / F-12 المتقدم واحتفظ به على الجليد.
    ملاحظة: حافظ على الوسط غير المستخدم عند 4 درجات مئوية. سيتم استخدامه لتمرير المواد العضوية.
  3. قم بتسخين ألواح زراعة الخلايا مسبقا (μ-Slide 8 غرف بئر و / أو قاع دائري 96 بئرا) في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  4. إذابة مصفوفة الغشاء السفلي (BMM) (انظر جدول المواد) aliquots على الجليد (قبل بدء البروتوكول أو على الأقل 1 ساعة قبل طلاء الخبايا).
    ملاحظة: سوف يتصلب BMM بسرعة إذا لم يتم الاحتفاظ به باردا.
  5. تحضير محلول الغسيل / التنظيف بإضافة محلول البنسلين والستربتومايسين بنسبة 1٪ إلى DPBS (DPBS-P / S).
  6. املأ طبق بتري 100 مم ب 10 مل من DPBS-P/S. املأ ستة أنابيب سعة 15 مل ب 10 مل من DPBS وقم بتصنيفها من F1 إلى F6.
  7. تحضير 30 مل من محلول EDTA 10 mM عن طريق التخفيف من 0.5 M EDTA في DPBS. املأ أنبوبين سعة 15 مل ب 10 مل من 10 مللي متر EDTA ، وقم بتسميتهما E1 و E2.
  8. حافظ على تبريد جميع المحاليل مسبقا عند 4 درجات مئوية واحتفظ بها على الجليد أثناء الإجراء.

2. ثقافة المواد العضوية المعوية

  1. التضحية بفأر Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) عمره 8-10 أسابيع وفقا للقواعد واللوائح الوطنية.
  2. جمع 5-8 سم من الصائم الذي يشمل المنطقة الواقعة بين الاثني عشر (5 سم من المعدة) والدقاق (10 سم من الأعور) والاحتفاظ بها في DPBS-P / S الباردة على الجليد.
  3. تنظيف محتوى الأمعاء عن طريق التنظيف مع 5-10 مل من DPBS-P / S الباردة.
    ملاحظة: يمكن الحصول على محاقن التنظيف محلية الصنع عن طريق توصيل طرف 200 ميكرولتر بفوهة حقنة 10 مل.
  4. افتح الأمعاء طوليا باستخدام مقص طرف الكرة (انظر جدول المواد) (لمنع إتلاف الأنسجة).
  5. باستخدام الملقط ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على DPBS-P / S بارد في درجة حرارة الغرفة ورجه للشطف.
  6. باستخدام ماصة باستور البلاستيكية ، أمسك بالأمعاء عن طريق الشفط وانقلها إلى أنبوب 15 مل يحمل علامة E1 يحتوي على 10 مل بارد 10 مللي متر EDTA.
  7. اقلب الأنبوب 3 مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق.
  8. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، انقل الأنسجة في أنبوب F1 يحتوي على 10 مل DPBS. دوامة لمدة 2 دقيقة (على دوامة طبيعية ، وعقد الأنبوب باليد وضمان أن الأمعاء تدور بشكل جيد).
  9. ضع 10 ميكرولتر من الكسر في طبق بتري وقم بتقييم جودة الكسر تحت المجهر.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الدوامة بأقصى سرعة، ويجب تقييم جودة كل جزء تحت المجهر (الشكل 1).
  10. باستخدام ماصة باستور البلاستيكية ، أمسك بالأمعاء عن طريق الشفط وانقلها في أنبوب F2 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة دقيقتين.
  11. كرر الخطوة 2.10 ، ونقل الأنسجة في أنبوب F3 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة دقيقتين.
  12. كرر حضانة EDTA كما في الخطوة 2.6 ، ونقل الأنسجة في أنبوب E2 يحتوي على 10 mM EDTA.
  13. اقلب الأنبوب 3 مرات واحتضنه على الثلج لمدة 5 دقائق.
  14. كرر الخطوة 2.10 ، ونقل الأنسجة في أنبوب F4 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة 3 دقائق.
  15. كرر الخطوة 2.14 ، ونقل الأنسجة في أنبوب F5 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة 3 دقائق.
  16. كرر الخطوة 2.15 ، ونقل الأنسجة في أنبوب F6 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة 3 دقائق.
  17. اجمع بين أفضل الكسور التي يتم ترشيحها حسب الجاذبية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل (على الجليد) للقضاء على الزغب والحطام الكبير.
    ملاحظة: عادة ما تكون F5 و F6 هي الكسور التي تحتوي على العديد من الخبايا وحطام أقل.
  18. تدور الخبايا عند 150 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
  19. أفرغ الأنبوب ، وقم بتعطيل الكريات ميكانيكيا ، وأضف 5 مل من DMEM / F12 البارد.
  20. ضع 10 ميكرولتر من التعليق في طبق بتري واحسب عدد الخبايا الموجودة في الأليكوت يدويا تحت المجهر.
    ملاحظة: لا تحسب الخلايا المفردة أو الحطام الصغير.
  21. احسب الحجم (V) لتعليق الخبايا المطلوب ب μL ، مع الأخذ في الاعتبار أن 300 سرداب مطلية لكل بئر ، W هو عدد الآبار ، و N هو عدد الخبايا التي تم حسابها من أصل 10 ميكرولتر من التعليق. انقل الخبايا إلى أنبوب جديد بسعة 15 مل.
    ملاحظة: V = 300 × العرض × 10/N. إذا تم استخدام حجم صغير في التجربة المخطط لها ، فيمكن استخدام أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  22. تدور الخبايا عند 200 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
  23. قم بإزالة supernatant بعناية باستخدام ماصة.
  24. قم بتعطيل الكريات ميكانيكيا وأضف بلطف وسط ثقافة النمو للحصول على تركيز 90 سكراب / ميكرولتر.
  25. أضف 2 مجلدات من BMM غير المخفف للحصول على تركيز نهائي من 30 سكرابت / ميكرولتر.
    ملاحظة: احتفظ دائما بالأنبوب على الجليد لتجنب تصلب BMM.
  26. لوحة 10 ميكرولتر من الخبايا / BMM مزيج في كل بئر. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، استخدم لوحات 96 بئرا مستديرة القاع. توزيع 10 ميكرولتر في وسط كل بئر وقبة. للتصوير ، استخدم μ 8 جيدا (انظر جدول المواد) وقم بإيداع 10 ميكرولتر كطبقة رقيقة.
    ملاحظة: قم بلوحة المواد العضوية كطبقة رقيقة لفحص التصوير لتمكين تصويرها المتعمق.
  27. اترك اللوحة لمدة 5 دقائق عند RT للسماح ل BMM بالتصلب. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 15 دقيقة.
  28. أضف 250 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر ، مع الحرص على عدم فصل BMM.
  29. ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  30. قم بإجراء تحليل ROS بين اليومين 4 و 6 من الثقافة. خلاف ذلك ، قم بتغيير الوسط وتقسيم المواد العضوية بعد ظهور العديد من الهياكل الناشئة الطويلة وعندما تتراكم الخلايا الميتة في لومينات العضوية.

3. مرور المواد العضوية

  1. ابدأ في تمرير المواد العضوية المعوية الصغيرة من اليوم 6th من الثقافة ، عندما تشكلت هياكل ناشئة كبيرة ، وأصبحت لومن المواد العضوية مظلمة.
    ملاحظة: يصبح تجويف العضو العضوي مظلما بسبب تراكم الخلايا الميتة والحطام والمخاط. تجنب ترك المواد العضوية تنمو قبل الانقسام. تعتمد نسبة الانقسام على نمو المواد العضوية. يوصى بتمرير المواد العضوية بنسبة 1: 2 في اليوم 6 و 1: 3 في اليوم 10.
  2. املأ أنبوبا سعة 15 مل ب 4 مل من DMEM / F-12 المتقدم البارد واحتفظ به على الجليد.
    ملاحظة: هنا ، يتم توفير مجلدات للوحة ثقافة 96 بئرا. إذا تم استخدام تنسيق مختلف ، فاضبط مستوى الصوت وفقا لذلك.
  3. استنشق الوسط بعناية باستخدام ماصة أو مضخة تفريغ من الآبار دون لمس قباب BMM ، وتخلص منها.
  4. أضف 100 ميكرولتر من DMEM / F-12 المتقدم البارد لكل بئر. ماصة لأعلى ولأسفل لكسر BMM ونقل محتوى البئر إلى أنبوب 15 مل.
  5. اغسل البئر ب 200 ميكرولتر بارد متقدم DMEM / F-12 وقم بجمعه في نفس الأنبوب.
    ملاحظة: في حالة تمرير آبار متعددة من نفس الحالة التجريبية ، يمكن تجميع محتويات الآبار في نفس أنبوب التجميع سعة 15 مل.
  6. قم بتدوير أنبوب التجميع سعة 15 مل عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. تخلص من السوبرناتانت وأضف 1 مل من DMEM / F-12 المتقدم البارد إلى الكرية. باستخدام طرف P1000 ، تناول طرف P10 (بدون فلتر) وماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة على الأقل.
  8. أضف 4 مل من DMEM / F-12 المتقدم البارد إلى الأنبوب. تدور على 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. شفط supernatant مع ماصة أو مضخة فراغ دون إزعاج الكرية. ثم ، تعطيل الكريات ميكانيكيا.
  10. أضف BMM المخفف في وسط ثقافة النمو (نسبة 2: 1). ماصة بعناية لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات الهواء في المزيج.
  11. لوحة 10 ميكرولتر من الخبايا / BMM مزيج في كل بئر.
  12. احتفظ باللوحة لمدة 5 دقائق في RT للسماح ل BMM بالتصلب. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 15 دقيقة.
  13. أضف 250 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر.
    ملاحظة: احرص على عدم فصل BMM.
  14. ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

4. إعداد الكواشف والمواد لتقييم الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية

  1. قم بإعداد محلول مخزون 250 mM من مثبط N-acetylcysteine (NAC) (انظر جدول المواد) ، أعد تعليق 10 ملغ مع 245 ميكرولتر من DPBS. يستخدم عند التركيز النهائي 1 ملليمتر.
  2. تحضير محلول مخزون 50 mM من الهيدروبيروكسيد Tert-butyl المحث (tBHP) ، 70 ٪ في الماء ، وتخفيف 3.22 ميكرولتر مع 496.8 ميكرولتر من DPBS. يستخدم عند التركيز النهائي 200 ميكرومتر.
  3. بالنسبة لدراسة قياس التدفق الخلوي ، قم بإعداد حل عمل 250 ميكرومتر لمسبار فلوروجيني (انظر جدول المواد) عن طريق تخفيف محلول المخزون 1/10 في DMSO. يستخدم عند التركيز النهائي 1 ميكرومتر.
    ملاحظة: كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة ، فإن المسبار الفلوروجيني حساس للضوء والأكسجين. يجب ألا تكون الأسهم و aliquots مفتوحة ومغلقة عدة مرات.
  4. بالنسبة لدراسة التصوير ، قم بإعداد حل عمل 1.25 mM للمسبار الفلوري عن طريق تخفيف محلول المخزون 1/2 في DMSO. يستخدم عند التركيز النهائي 5 ميكرومتر.
  5. قم بإعداد حل نهائي من 0.1 ميكروغرام / مل DAPI في DPBS ، لاستخدامه في تمييز الخلايا الميتة في فحص قياس التدفق الخلوي.
  6. تمييع Hoechst 33342 إلى 1.25 ملغ / مل في DPBS. استخدم بتركيز نهائي 5 ميكروغرام/مل لاستخدامه للتلطيخ النووي في فحص التصوير.
  7. دافئ DMEM دون الفينول الأحمر عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تصف هذه الخطوات استخدام عناصر التحكم السلبية والإيجابية التي يجب تضمينها في أي مقايسات ، باستخدام الشروط الموضحة في الشكل 2A. يمكن استخدام الفحص لاختبار المركبات المضادة للأكسدة أو المؤيدة للأكسدة. الخطوات هي نفسها ، والفرق الوحيد هو عندما تضاف المركبات قبل استخدام الصبغة الفلوروجينية.

5. تصور الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية 3D عن طريق المجهر البؤري

  1. خذ المواد العضوية المطلية في غرف البئر μ-Slide 8 وأضف محلول مخزون NAC 1 ميكرولتر في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي قدره 1 mM.
  2. احتضن لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  3. أضف محلول مخزون tBHP 1 ميكرولتر في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر.
  4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  5. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من تخفيف 1.25 ملليمتر للمسبار الفلوروجيني للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر.
  6. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من تخفيف 1.25 ملغم / مل من Hoescht للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل.
  7. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  8. قم بإزالة الوسط دون إزعاج BMM. بلطف ، أضف 250 ميكرولتر من DMEM الدافئ دون أحمر الفينول.
    ملاحظة: إذا تم التخطيط لعملية استحواذ طويلة الأجل ، فأضف مركبات عوامل النمو إلى DMEM بدون أحمر الفينول.
  9. قم بتصوير المواد العضوية باستخدام مجهر بؤري مجهز بغرفة حرارية وإمدادات غاز تكتشف المسبار الفلوروجيني (ROS).
    ملاحظة: الإثارة / الانبعاث (ex / em) للمسبار الفلوروجيني هو 644/665 ، و ex / em ل Hoechst (النوى) هو 361/486 ، و ex / em ل GFP (الخلايا الجذعية المعوية من الفئران Lgr5-GFP) هو 488/510. يستخدم هدف غمر الزيت 63x للكشف عن الإشارات في الخلايا الجذعية. لا تقم بتغيير إعدادات الليزر بين العينات. يمكن استخدام هدف 20x للسماح بنظرة عامة على إنتاج ROS.
  10. استخدم عنصر التحكم الإيجابي لإعداد شدة الليزر والتعرض للوقت لإشارة ROS وتحقق من أن هذه الإشارة أقل في التحكم السلبي.
  11. باستخدام شاشة العدسة ، الشريحة لتحديد المواد العضوية GFP التي تعبر عن كثافة الليزر وضبطها.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة يدويا.
  12. حدد المواضع للحصول على صورة مخيطة للعضوي بأكمله. قم بإعداد مكدس z من 25 ميكرومتر (حجم الخطوة 5 ميكرومتر) للحصول على قسم من المواد العضوية يعرض طبقة واحدة من الخلايا.
    ملاحظة: ارجع إلى دليل مستخدم المجهر لتحسين الإعداد. باستخدام الخلايا الحية ، يجب أن يتم الاستحواذ في غضون 1 ساعة بعد نهاية الحضانة.
  13. افتح الصور في برنامج معالجة صور مفتوح المصدر (انظر جدول المواد).
  14. انتقل إلى مكدس z واختر القسم الذي يتم فيه تمثيل منتصف المواد العضوية بشكل جيد وإنشاء صورة جديدة مع المنطقة المحددة.
  15. حدد كمية الصور وفقا للخطوات 5.15.1 - 5.15.5.
    1. حدد أداة الخط الحر.
    2. ارسم خطا يتبع النوى.
      ملاحظة: حدد فقط المناطق التي تعرض الخلايا الإيجابية GFP إذا تم تحليل الخلايا الجذعية فقط.
    3. قم بزيادة عرض الخط لتغطية طبقة الخلية بالخط دون تضمين الحطام المضيء.
    4. حدد قناة إشارة ROS وقم بقياس شدة التألق في المنطقة المحددة وقم بالتعليق التوضيحي على القيم.
    5. ارسم خطا لا توجد فيه إشارة وقم بقياس كثافة الفلورسنت للخلفية التي سيتم طرحها إلى القيمة السابقة للحصول على الكثافة النهائية.

6. القياس الكمي للإجهاد التأكسدي على المواد العضوية المنفصلة باستخدام مقياس التدفق الخلوي

  1. أضف محلول مخزون NAC 1 ميكرولتر في الآبار للحصول على ضوابط سلبية للحصول على تركيز نهائي قدره 1 mM.
    ملاحظة: استخدم المواد العضوية المطلية في الألواح ذات القاع المستدير البالغ عددها 96 بئرا.
  2. احتضن لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  3. أضف محلول مخزون tBHP 1 ميكرولتر في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر.
  4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  5. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة الوسط دون إزعاج BMM المرفق ونقله إلى لوحة سفلية مستديرة أخرى بسعة 96 بئرا. احتفظ بهذه اللوحة جانبا.
  6. أضف 100 ميكرولتر من التربسين ، ومع ماصة متعددة القنوات ، ماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل لتدمير BMM.
  7. احتضان لمدة لا تزيد عن 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  8. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل لفصل المواد العضوية.
  9. تدور بسرعة 300 × جم لمدة 5 دقائق على RT.
  10. تخلص من السوبرناتانت عن طريق عكس اللوحة. أضف مرة أخرى الوسط الذي تم جمعه في الخطوة 6.3 إلى الآبار المقابلة وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات.
  11. أضف المسبار الفلوروجيني عند التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من تخفيف 250 ميكرومتر واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة المسبار الفلوروجيني إلى الآبار اللازمة لإعدادات الجهاز (الشكل 2B).
  12. تدور بسرعة 300 × جم لمدة 5 دقائق على RT.
  13. أعد تعليق الخلايا باستخدام محلول DAPI سعة 250 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام/مل. انقل العينات في أنابيب قياس التدفق الخلوي المناسبة ، واحتفظ بالأنابيب على الجليد ، واستمر في التحليل.
    ملاحظة: أضف PBS بدلا من DAPI إلى الآبار اللازمة لإعدادات الأداة (الشكل 2B).
  14. قم بتحسين إعدادات جهد التشتت الأمامي والجانبي على التحكم غير الملون وفولتية الليزر لكل فلوروفور باستخدام عينات أحادية اللون.
  15. باستخدام استراتيجية بوابات مناسبة (الشكل 4A) ، اجمع ما لا يقل عن 20000 حدث.
    ملاحظة: يفضل تنظيم 50,000 حدث. تختلف إعدادات الاقتناء التفصيلية وفقا للأداة المستخدمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكدليل على مفهوم البروتوكول الموصوف، استخدمت الخبايا التي تم الحصول عليها من خط الفأر Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 حيث تعرض الخلايا الجذعية المعوية تعبير GFP الفسيفسائي، الذي أنشأه باركر وآخرون، لتوصيف الخلايا الجذعية المعوية10 في البداية والسماح برسم خريطة لهذه الخلايا بناء على تعبيرها عن GFP. وبالتالي يتم توفير نموذج لمقارنة مستويات ROS في مجموعة معينة من أنواع الخلايا بناء على علاجات مختلفة. تم استخدام مثبط ROS (NAC) ، ومحفز (tBHP) ، المعروف بالعمل على ROS الخلوي لتصور التغيرات في مستوياتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا العمل بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل سراديب الفئران الصولجان ، وزراعتها في عضويات 3D ، وتحليل ROS في المواد العضوية من خلال الجمع بين مسبار فلوروجيني حساس ل ROS مع تصوير مجهري نوعي للعضويات الكاملة وقياس ROS الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي على الخلايا المفردة بعد التفكك العضوي.

الخطوة الحاسمة الأولى في هذه الطريقة هي إجراء استخراج الخبايا. في الواقع ، فإن جودة إعداد الخبايا هي المفتاح لتشكيل عضويات ناجحة. لذلك من الضروري الحصول على كسور ذات سراديب غنية وعدد قليل من الحطام الخلوي أو الخلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >الفئران < / قوي >
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)مختبر
<قوي > ثقافة النمو متوسط< / قوي >
متقدم DMEM F12 (DMEM / F12)ThermoFisher12634010
B-27 ، مطروحا منه فيتامين أThermoFisher12587010تركيز المخزون: 50x
GlutaMAX (glutamine< / em>) تركيزThermoFisher35050038: 100x
HepesThermoFisher15630056تركيز المخزون: 1 متر
من Murine EGFR & D2028-EG-200تركيز المخزون: 500 & جم / مل في PBS
الفئران NogginR & D1967-NG / CFتركيز المخزون: 100 & جم / مل في PBS
Murine R-spondin1R & D3474-RS-050تركيز المخزون: 50 & micro; جم / مل في مكمل PBS
N-2ThermoFisher17502048تركيز المخزون: 100x
البنسلين الستربتومايسين (P / S)مخزون 15140122ThermoFisher: 100x (10,000 وحدة / مل من البنسلين و 10,000 ميكرو ؛ جم / مل من الستربتومايسين)
< قوي > مادة < / قوي >
70 وميكرو ؛ مصفاة الخلية mCorning352350
96 بئر جولة القاعCorning3799
مقص طرف الكرةأدوات العلوم الدقيقة GMBH14086-09
CellROX & reg ؛ كاشف أحمر غامقThermoFisherC10422
DAPI (4',6-diamidino-2-phé نيليندول ، ثنائي كلورهيدرات) (مسبار الفلورجيني< / em>) مخزونThermoFisherD1306بسعر 10 مجم / مل
DPBS 1x بدون كالسيوم بدون مغنيسيوم (DPBS)ThermoFisher14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM لا فينول أحمر< / em>)مخزون ThermoFisherA1896701
Hoechst 33342ThermoFisherH3570عند 10 مجم / مل
تم تقليل عامل نمو Matrigel ، خالية من الفينول الأحمر ( مصفوفة الغشاء القاعدي < / em>)Corning356231بمجرد تلقي ذوبان الجليد في الثلاجة ، واحتفظ بها لمدة 1 ساعة على الثلج ، وجعل 500 مل aliquots وتخزينها عند -20 درجة ؛ C
& micro ؛ - الشريحة 8 غرف الآبار المرجعنفسه80826
N-acetylcysteine (NAC)SigmaA9165
هيدروبيروكسيد ثلاثي البوتيل (tBCHP) (70٪ بالوزن. في H2O2)Sigma458139
TrypLE Express Enzyme (1X) ، لا يوجد فينول أحمر (trypsin< / em>) ThermoFisher12604013
UltraPure 0.5 M EDTA ، pH8.0ThermoFisher15575020
Y-27632SigmaY0503مثبط الصخور لاستخدامه لتقليل موت الخلايا عند تفكك الأنسجة
<قوي>البرامج والمعدات
Attune NxT (مقياس التدفق الخلوي)محلل مقياس التدفقThermoFischer
Fiji/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsتوليد
الصور FlowJoBD Bioscienceتحليل FACS
Observer.Z1زايسمتحد البؤر
Opterra (كونفوكال المجال المكتسح)نظام متحد البؤربروكر
كاميرا EMCCD عالية السرعة Evolve Delta 512نظام متحد البؤر
القياسات الضوئية التحليلالإحصائيلبرنامج
جاكسون مكمل مخزون تركيز محلول نظام Prism GraphPad

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
  2. Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  3. vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949(2021).
  4. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  5. Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
  6. Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
  7. Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
  8. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
  11. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
  12. Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
  13. Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
  14. Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
  15. Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316(2010).
  16. Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450(2018).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة