Method Article

تصميم وتطوير نموذج لدراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم مجرى الهواء التليف الكيسي

DOI:

10.3791/62888

⸱

August 3rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير نظام نموذجي لتأثير فرط الأكسجين على المجتمعات الميكروبية التليف الكيسي مجرى الهواء. المتوسط البلغم الاصطناعي يحاكي تكوين البلغم، وظروف زراعة فرط الأكسجين نموذج آثار الأكسجين التكميلي على المجتمعات الميكروبية الرئة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتقد أن المجتمعات الميكروبية مجرى الهواء تلعب دورا هاما في تطور التليف الكيسي (CF) وغيرها من الأمراض الرئوية المزمنة. وقد تم تصنيف الميكروبات تقليديا على أساس قدرتها على استخدام الأكسجين أو تحمله. الأكسجين التكميلي هو العلاج الطبي المشترك تدار للأشخاص الذين يعانون من التليف الكيسي (pwCF); ومع ذلك ، ركزت الدراسات القائمة على الأكسجين والميكروبيوم مجرى الهواء على كيفية نقص الأكسيجة (انخفاض الأكسجين) بدلا من فرط الأكسجين (الأكسجين العالي) يؤثر على المجتمعات الميكروبية الرئة الهوائية والكلية في الغالب. ولمعالجة هذه الفجوة المعرفية الحرجة، تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام وسيط البلغم الاصطناعي الذي يحاكي تكوين البلغم من pwCF. استخدام تعقيم المرشحات، الذي ينتج وسيلة شفافة، يسمح للطرق البصرية لمتابعة نمو الميكروبات وحيدة الخلية في ثقافات التعليق. لخلق ظروف فرط الأكسجين، يستفيد هذا النظام النموذجي من تقنيات الاستزراع اللاهوائي الراسخة لدراسة الظروف المفرطة الأكسجين. بدلا من إزالة الأكسجين، يضاف الأكسجين إلى الثقافات عن طريق التجنيب اليومي من زجاجات المصل مع خليط من الأكسجين المضغوط والهواء. خضع البلغم من 50 pwCF التجنيب اليومي لفترة 72 ساعة للتحقق من قدرة هذا النموذج للحفاظ على ظروف الأكسجين التفاضلية. تم إجراء تسلسل بندقية metagenomic على عينات البلغم المستزرعة وغير المستزرعة من 11 pwCF للتحقق من قدرة هذه الوسيلة على دعم نمو الميكروبات كومينسال ومسببات الأمراض الموجودة عادة في البلغم التليف الكيسي. تم الحصول على منحنيات النمو من 112 عزلة تم الحصول عليها من pwCF للتحقق من قدرة هذا المتوسط البلغم الاصطناعي لدعم نمو مسببات الأمراض التليف الكيسي المشتركة. نجد أن هذا النموذج يمكن أن ثقافة مجموعة واسعة من مسببات الأمراض وcommensals في البلغم CF، يستعيد مجتمع مشابهة إلى حد كبير إلى البلغم غير المستزرعة في ظل ظروف normoxic، ويخلق الأنماط الظاهرية ثقافة مختلفة في ظل ظروف الأكسجين متفاوتة. وقد يؤدي هذا النهج الجديد إلى فهم أفضل للآثار غير المتوقعة الناجمة عن استخدام الأكسجين في البيو سي إف على المجتمعات الميكروبية في مجرى الهواء ومسببات الأمراض التنفسية الشائعة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التليف الكيسي (CF) هو مرض وراثي يتميز بعدم القدرة على إزالة المخاط السميك من الرئتين ، مما يؤدي إلى التهابات متكررة وانخفاض وظائف الرئة التدريجي الذي يؤدي في كثير من الأحيان إلى الحاجة إلى زرع الرئة أو الوفاة. الميكروبيوم مجرى الهواء من الناس مع التليف الكيسي (pwCF) ويبدو أن تتبع نشاط المرض1, مع انخفاض في التنوع الميكروبي المرتبطة النتائج السلبية على المدى الطويل2,3. في الدراسات السريرية من pwCF, وقد ارتبط العلاج بالأوكسجين التكميلي مع مرض أكثر تقدما 4,5, علىالرغممن تقليديا, وقد ينظر إلى استخدام العلاج بالأوكسجين باعتباره مجرد علامة لشدة المرض6. وقد أظهرت الدراسات الحديثة من التجارب السريرية للمرضى الذين يعانون من فشل في الجهاز التنفسي أن ارتفاع مستويات الأكسجين المريض ترتبط بشكل متناقض مع زيادة في الالتهابات البكتيرية الخطيرة وارتفاع معدل الوفيات7, مما يشير إلى أن الأكسجين التكميلي قد تسهم في مرض الإمراض. لم يتم دراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم الرئة التليف الكيسي والمجتمعات الميكروبية الرئة والمجرى الهوائي المرتبطة بها بشكل جيد.

غالبا ما لا يمكن إجراء الدراسات الميكانيكية مباشرة على البشر بسبب الصعوبات اللوجستية والقضايا الأخلاقية المحتملة المرتبطة بالتدخلات ذات الفائدة الطبية غير المعروفة أو الضرر. ويمكن للنهج التحويلية التي تدمج البكبيمنات البيولوجية البشرية في النظم النموذجية أن تقدم رؤى بيولوجية هامة في هذه الحالات. في حين أن القدرة على استخدام الأكسجين أو تحمله كانت تقليديا مكونا مهما في التصنيف الميكروبي ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن كيفية إدخال الأكسجين التكميلي العلاجي إلى البيئة قد يؤدي إلى اضطراب المجتمعات الميكروبية في مجرى الهواء. لإلقاء الضوء على الآثار غير المعروفة للأوكسجين التكميلي على ميكروبيومات مجرى الهواء من pwCF، كنا بحاجة إلى معالجة اثنين من التحديات الرئيسية؛ أولا ، إنشاء وسيط الثقافة التي تقارب من الناحية الفسيولوجية تكوين البلغم CF ؛ ثانيا، إنشاء نظام نموذجي يسمح بالحفاظ على تركيزات الأكسجين المرتفعة في الثقافة على مدى فترات طويلة من الزمن.

وتستخدم وسائل الإعلام البلغم الاصطناعي (ASM) على نطاق واسع لمحاكاة الرئة البلغم ex vivo8,9,10, ولكن ليس هناك توافق واضح في الآراء على وصفة محددة. يصف هذا البروتوكول وصفة متوسطة البلغم الاصطناعي واستراتيجية إعداد مصممة بعناية لتقريب البلغم من الناحية الفسيولوجية من pwCF. يحدد الجدول 1 قيم الوصفة المختارة استنادا إلى الأدبيات المنشورة. تمت مطابقة المكونات الكيميائية الأساسية وhh للقيم التي حددتها دراسات البلغم CF البشري11،12،13. أضيفت العناصر الغذائية الفسيولوجية منخفضة التركيز باستخدام صفار البيض، والتي تم تضمينها على أنها 0.25٪ من المجلد النهائي10، وكذلك فيتامين وتتبع يمزج المعدن14،15. تم تضمين موسين ، المكون الرئيسي للسبغم16، في 1 ٪ ث / الخامس14. على الرغم من أن أكثر كثافة العمالة، تم اختيار تعقيم مرشح على الممارسة التقليدية أكثر من التعقيم الحراري للحد من المشاكل المحتملة من التشبع الناجم عن الحرارة من مكونات وسائل الإعلام الأساسية10. فائدة إضافية من تعقيم التصفية هو أنه يولد وسائل الإعلام التي هي شفافة (التعقيم الحراري يمكن أن تخلق وسائل الإعلام العكر بسبب هطول الأمطار وتخثر الأملاح والبروتينات)، مما يسمح لهذا الوسائط البلغم الاصطناعي لاستخدامها لمتابعة النمو الميكروبي على أساس الزيادات في العكر.

ويستند هذا النظام النموذجي لثقافة hyperoxic على تقنيات زراعة اللاهوائية حيث يتم إضافة الأكسجين بدلا من إزالتها، وخلق نموذج لتأثير استخدام الأكسجين التكميلي لpwCF. ويبين الشكل 1 وبروتوكول تجنيب الأكسجين المرتبط به مكونات نظام تجنيب الأكسجين، الذي يمكن الحصول عليه بتكلفة منخفضة من موردي المختبرات العامة والمستشفيات. هذا النظام يتيح خلط الأكسجين المضغوط والهواء لتركيزات ثابتة تتراوح بين 21٪ -100٪ الأكسجين. يسمح دمج مستشعر الأكسجين بالتحقق من تركيز خليط غاز الإنتاج ، بالإضافة إلى التحقق من تكوين غاز التدفق الخارجي زجاجات المصل التي تم تجنيبها سابقا للتحقق من الحفاظ على ظروف الأكسجين ضمن النطاق المطلوب.

يحدد هذا البروتوكول الإجراءات لإنشاء وسيط البلغم الاصطناعي ، وبناء واستخدام نظام تجنيب الأكسجين ، وتطبيق كليهما على زراعة البلغم CF في ظل ظروف الأكسجين التفاضلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصلت هذه الدراسة على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية للشركاء (البروتوكول رقم 2018P002934). وشمل معيار الإدماج المرضى البالغين الذين يعانون من التليف الكيسي الذين قدموا موافقة خطية مستنيرة على الدراسة. ولم يكن هناك معيار استبعاد. وفقا للمبادئ التوجيهية البروتوكول، تم جمع جميع عينات البلغم من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي خلال زيارة مقررة للمرضى الخارجيين مع مزود السريرية الخاصة بهم.

1. الاصطناعية البلغم إعداد متوسط

ملاحظة: الكميات المذكورة هنا هي لإنتاج 1 لتر من المتوسط البلغم الاصطناعي النهائي، وتفترض الكواشف المحددة المدرجة في جدول المواد. يجب تعديل الأرقام لأحجام أخرى أو لاستخدام الكواشف المختلفة لضمان نفس المنتج النهائي. انظر الجدول 1 للاطلاع على التركيزات المستهدفة.

  1. مزيج كيميائي من البلغم الاصطناعي (ASCM)
    ملاحظة: ASCM تشكل 25٪ من حجم المتوسطة النهائية. وهو مستقر على الرف ويمكن إعداده بكميات كبيرة أو مقدما. إذا كان يجري إعدادها للاستخدام في وقت لاحق، autoclave المزيج الكيميائي وتخزينها بأمان في درجة حرارة الغرفة.
    1. خلط الحلول المكونة للمخزون الكيميائي.
      1. إعداد 1 M NaCl الأسهم: إضافة 58.44 غرام من NaCl لكل لتر من الماء العقيم.
      2. إعداد 1 M KCl المخزون: إضافة 74.55 غرام من KCl لكل لتر من الماء المعقم.
      3. إعداد 1 M MgSO4 الأسهم: إضافة 246.47 غرام من MgSO4· 7H2O لكل لتر من الماء العقيم، أو 120.37 غرام من MgSO4 اللامائية لكل لتر من الماء العقيم.
      4. إعداد مخزون الجلوكوز 1 M: إضافة 180.16 غرام من الجلوكوز لكل لتر من الماء المعقم.
    2. تعقيم الأوتوكلاف الحلول الأسهم الكيميائية، فضلا عن زجاجة فارغة 250 مل. قم بتنفيذ خطوات الاسترداد التلقائي إلى قيم قياسية على الأقل تبلغ 121 درجة مئوية و15 PSI لمدة 30 دقيقة.
    3. أضف 80.59 مل من الماء العقيم إلى زجاجة فارغة سعة 250 مل.
    4. إضافة 152.30 مل من 1 M NaCl الأسهم إلى هذا المزيج.
    5. إضافة 15.8 مل من 1 M KCl الأسهم إلى هذا المزيج.
    6. إضافة 610 ميكرولتر من 1 M MgSO4 الأسهم إلى هذا المزيج.
    7. أضف 700 ميكرولتر من مخزون الجلوكوز 1 M إلى المزيج.
  2. مزيج البلغم الموسين الاصطناعي (ASMM)
    ملاحظة: ASMM تشكل 50٪ من حجم المتوسطة النهائي. تأكد من أنه يتم إعداده في نفس يوم الدفعة المتوسطة النهائية.
    1. أضف 450 مل من الماء العقيم إلى زجاجة فارغة 1 لتر.
    2. أضف 50 مل من 10 × ملحي الفوسفات المخزنة (PBS) إلى الزجاجة.
    3. أضف شريط اثارة مغناطيسي يمكن التخلص منه إلى الزجاجة.
    4. أوتوكلاف الزجاجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني وشريط اثارة.
    5. قياس 10 غرام من مسحوق الموسين وإضافته إلى برنامج تلفزيوني.
    6. يهز زجاجة بقوة لخلط الأولية.
    7. ضع الزجاجة على طبق ساخن مع ستيرر مغناطيسي. ضبط الحرارة على متوسطة عالية تستهدف 50 درجة مئوية وسرعة تحريك إلى 1100 دورة في الدقيقة. تكثيف السرعة تدريجيا بحيث شريط لا يطير قبالة المغناطيس.
      1. اتركيه ليسخن ويحرك لمدة 15 دقيقة.
      2. التقط الزجاجة بقفازات مقاومة للحرارة. لاحظ للتحقق مما إذا كان مسحوق الموسين يستقر خارج المحلول.
      3. إذا لم يذوب مسحوق الموسين بالكامل، أعد الزجاجة إلى الحرارة/الستيرر لمدة 5 دقائق حتى تذوب تماما.
    8. السماح للمزيج mucin لتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
  3. مزيج البلغم الاصطناعي البيولوجي (ASBM)
    ملاحظة: ASBM هو 25٪ من حجم المتوسطة النهائي. إعداده في نفس اليوم الدفعة المتوسطة النهائية، وخلافا للخلطات الأخرى، لا تعرض مكوناته إلى أي حرارة.
    1. إذابة مخزون فيتامين 100x في ثلاجة 4 درجة مئوية أو على الجليد.
      ملاحظة: قبل جزء من المخزون فيتامين في 10 مل aliquots لتقليل عدد من تجميد / ذوبان دورات.
    2. أضف 124.24 مل من الماء العقيم إلى زجاجة 250 مل فارغة.
    3. إضافة 25.76 مل من 50x مخزون الأحماض الأمينية الأساسية إلى هذا المزيج.
    4. إضافة 80.14 مل من 100x مخزون الأحماض الأمينية غير الأساسية إلى هذا المزيج.
    5. إضافة 10 مل من (إذابة) 100x فيتامين المخزون إلى هذا المزيج.
    6. إضافة 1 مل من 1000x تتبع مخزون المعادن إلى هذا المزيج.
    7. إضافة 8.33 مل من 30٪ مستحلب صفار البيض إلى هذا المزيج.
    8. إضافة 400 ميكرولتر من 10 غرام / لتر الأسهم فيريتين إلى هذا المزيج.
    9. مزيج الحل بشكل جيد عن طريق اهتزاز اليدوي.
  4. متوسط البلغم الاصطناعي (ASM)
    1. أضف 250 مل من ASCM إلى زجاجة 1 لتر التي تحتوي على ASMM.
    2. أضف 250 مل من ASBM إلى الزجاجة المتوسطة.
    3. قم بتكريس الوسط مع المخزن المؤقت MOPS الأساسي (1 M) للوصول إلى درجة الحموضة 6.3 على ورق درجة الحموضة الضيق النطاق. قبل المعايرة، سيكون المزيج المتوسط حمضيا جدا.
    4. قم بتبريد متوسط البلغم الاصطناعي الناتج عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للترشيح.
    5. لبدء عملية الترشيح، نقل 200 مل من المتوسط البلغم الاصطناعي غير المصفاة إلى نظام الترشيح فراغ مع مرشح حجم المسام 0.22 ميكرومتر.
    6. قم بتوصيل نظام الترشيح بمضخة الفراغ، قم بتشغيل مضخة الفراغ، وحددها ب 70 mbar، ثم ضع الغرفة على هزة شاكر مدارية عند 90 دورة في الدقيقة في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية.
      1. أعلى قبالة مع 150 مل إضافية من المتوسط كمبلغ ملحوظ يتم تصفيتها. يستغرق 1-2 أيام لتصفية 1 لتر من المتوسطة تماما.
      2. كرر مع غرف إضافية حتى يتم تصفية جميع وسائل الإعلام.
        ملاحظة: حاول عدم تصفية أكثر من 350 مل من الوسط خلال نفس عامل التصفية 0.22 ميكرومتر لأن الموسين سيقوم بتوصيل الفلتر بمرور الوقت.
    7. تبريد المتوسط البلغم الاصطناعي المصفاة في 4 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. استخدم ASM في غضون شهر واحد من التحضير للحصول على أفضل النتائج.

2. الأوكسجين Sparging

  1. إعداد محطة التجنيب
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا البروتوكول فقط بحاجة إلى القيام به بالكامل مرة واحدة، وبعد ذلك يمكن الاحتفاظ الإعداد من خلال صيانة بسيطة حسب الضرورة. انظر الشكل 1 للحصول على تخطيط مرئي لنظام تجنيب الأكسجين.
    1. الحصول على خزانات الهواء والأوكسجين المضغوطة وتأمينها بشكل صحيح.
      تنبيه: الضغط العالي يجعل الدبابات خطيرة للغاية عند سوء التعامل معها. تأكد من أن الدبابات مغلقة تماما ومؤمنة، لا توجد تسربات عند إغلاق الخزان، وأن جميع العاملين في المناولة مدربون تدريبا كاملا على استخدامها.
    2. إرفاق منظم الهواء إلى خزان الهواء المضغوط مع وجع. لقراءة التدفق الأمثل على المنظم، قم بإرفاق المنظم في أقرب وقت ممكن بوضع مستقيم.
    3. إرفاق منظم الأكسجين إلى خزان الأكسجين المضغوط، وربط أقرب ما يمكن إلى وضع مستقيم. اعتمادا على خزان الأكسجين، قد يحتاج المرء إلى عكس الاتجاه لتشديد.
    4. قم بتوصيل الأنابيب من المنظمين بموصل Y لدمج تدفق الغاز من الخزانين.
    5. قم بتوصيل مخرج موصل Y بصمام تقاطع T المركزي.
    6. قم بتوصيل جانب واحد من صمام تقاطع T المركزي بمقياس ضغط الغاز.
    7. قم بتوصيل الجانب الآخر من مقياس ضغط الغاز بمرشح حقنة معقم قطره 25 مم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
    8. إرفاق مرشح حقنة قطرها 25 ملم الثانية إلى حقنة دون المكبس لاستخدامها كإطلاق الغاز أثناء التجنيب.
    9. قم بتوصيل الجانب الأخير من صمام تقاطع T المركزي بصمام T-junction الثاني لجهاز مراقبة الأكسجين.
    10. قم بتوصيل فلتر حقنة قطره 25 مم إلى جانب واحد من صمام T-junction الثاني هذا، إلى جانب أنابيب لإرفاق إبر 18 G.
    11. قم بتوصيل الجانب الأخير من صمام T-junction الثاني بجهاز مراقبة الأكسجين.
    12. توصيل أنبوب قطع إلى الجانب الآخر من جهاز مراقبة الأكسجين لاستخدامها كإطلاق الغاز أثناء الرصد.
      تنبيه: عند اختبار/استخدام نظام تجنيب الأكسجين، لاحظ بعناية وضع تقاطعات T وتأكد من مطابقته للمسار المقصود من خلال النظام. الفشل في القيام بذلك سيؤدي إلى تراكم الضغط داخل النظام ويتسبب في فشل المكونات وتفككها.
    13. لصيانة النظام والحفاظ عليه يعمل في الأداء الأمثل، والممارسات التالية مفيدة.
      1. تعزيز الاتصالات مع كميات ليبرالية من الشريط تفلون لتحسين كبير في الختم والحد من فرصة المكونات التي تأتي بعيدا عن الضغط الداخلي.
      2. حافظ على معدل التدفق المشترك تحت 10 لتر/دقيقة لتخفيف الضغط الأقصى ومنع الأعطال.
      3. إذا اشتبه في حدوث تسرب، فاستخدم محلول المنظفات مثل كاشفات التسرب السائل المتاحة تجاريا لتحديد موقعه بسهولة، حيث أنه سيتضخم فوق أي تسرب للغاز. تسرب التصحيح باستخدام شريط البوليتيترافلوروإيثيلين (على سبيل المثال، تفلون).
      4. استبدل مرشحات المحاقن بقطر 25 مم في نظام تجنيب الأكسجين كل أسبوعين ، ولكن هذا يختلف مع تكرار الاستخدام. مع مرور الوقت، تقلل الجسيمات التي يتم التقاطها في الفلتر من معدل تدفق الغاز وتسبب تراكمات الضغط.
      5. معايرة مراقبة الأكسجين إلى 21٪ الأكسجين ضغط الهواء قبل إجراء القياسات.
      6. عند الانتهاء من استخدام النظام، إيقاف الخزانات ونزيف الغاز الزائد من المنظمين حتى يتوقف التدفق تماما.
  2. مصل زجاجة الثقافة تجنيب
    1. تسمية 500 مل زجاجات مصل autoclaved مع معرفات العينة، وتاريخ / وقت التطعيم، ونسبة الأكسجين المستهدفة.
    2. في غطاء محرك السيارة البيولوجي، أضف 24 مل من متوسط البلغم الاصطناعي إلى كل زجاجة مصل يتم إعدادها.
    3. إضافة 1 مل من البلغم المريض متجانسة مع إبرة 18-G (المخفف مع المالحة العقيمة إذا لزم الأمر للحصول على حجم كاف من العينة لكل حالة ثقافة) إلى كل زجاجة مصل.
    4. باستخدام ملاقط معقمة، ضع سدادات المطاط المعبأة تلقائيا على الجزء العلوي من كل زجاجة مصل.
    5. اضغط أسفل سدادات المطاط، والحرص على عدم لمس الجانب السفلي من سدادة مع اليدين.
    6. إزالة الزجاجات من غطاء محرك السيارة، وتطبيق وتجعيد الأختام الألومنيوم. إزالة قطعة مركز من الأختام.
    7. مسح أسفل الجزء العلوي من الزجاجات مع مسح الكحول وتمريرها من خلال لهب الموقد بونسن.
    8. لصق إبرة معقمة 18-G إلى حقنة المكبس أقل مع مرشح. أدخل هذا الإصدار من الغاز في الزجاجة أولا.
    9. لصق إبرة معقمة 18-G إلى إخراج الغاز من النظام وإدراج إبرة إخراج الغاز في زجاجة كذلك.
    10. توجيه T-تقاطعات من الخزانات من خلال رصد الأكسجين. تحقق من أن تركيز الأكسجين المستهدف يتدفق عبر النظام. الهدف ما يقرب من 5 لتر / دقيقة من تدفق الغاز.
    11. إعادة توجيه تقاطعات تي من الدبابات من خلال لانتاج الغاز. يبدأ الغاز بالتدفق عبر زجاجة المصل.
      تنبيه: انتبه عن كثب إلى مقياس الضغط أثناء تجنيب الأكسجين. إذا زاد الضغط بشكل غير متوقع، أغلق النظام فورا.
    12. تشغيل الأكسجين سبارج من خلال زجاجة المصل لمدة 1 دقيقة. في 5 لتر / دقيقة، وهذا يسمح ل10 التبادلات الجوية ويضمن الغلاف الجوي الداخلي يصل إلى الضغط الجزئي المطلوب.
    13. إزالة الغاز الإفراج عن إبرة 18-G.
    14. السماح للضغط في زجاجة المصل لبناء إلى +1 الغلاف الجوي (2 الغلاف الجوي على مستوى سطح البحر) ومن ثم إزالة فورا إبرة إخراج الغاز.
      ملاحظة: يساعد الحفاظ على الضغط على الاحتفاظ بظروف فرط الأكسجين بمرور الوقت.
    15. ضع زجاجة المصل في حاضنة شاكر 37 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة. احتضان العينات لمدة ثلاث فترات 24 ساعة. في كل فاصل زمني 24 ساعة، واتخاذ aliquot لتحليل المصب، وإعادة sparge العينات وإعادتها إلى الحضانة لمدة حضانة مجموع 72 ساعة.
  3. قياس الأكسجين التدفقي
    1. معايرة مقياس الأكسجين إلى 21٪ الهواء المضغوط، ومن ثم إيقاف تشغيل الخزان.
    2. توجيه كمية زجاجة المصل من خلال مراقبة الأكسجين ولصق إبرة معقمة حتى النهاية.
    3. أدخل الإبرة من خلال سدادة المطاط في زجاجة المصل.
    4. انتظر حتى تستقر قراءة التدفق إلى الخارج. انخفاض معدل التدفق من زجاجات المصل يعني أن هذا قد يستغرق ما يصل إلى 2 دقيقة. الإبلاغ عن فرق الذروة من هواء الغرفة (العدد الأبعد من 21٪).
    5. إذا كان أداء قراءات متعددة، مسح النظام مع الهواء المضغوط بين القراءات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق هذه البروتوكولات على 50 عينة من البلغم المتوقع من pwCF تقديم الرعاية الروتينية إلى عيادة التليف الكيسي في العيادات الخارجية في مستشفى ماساتشوستس العام في بوسطن، ماساتشوستس. تم استزراع البلغم لكل مريض تحت 21٪ و 50٪ و 100٪ من حالات الأكسجين باستخدام متوسط البلغم الاصطناعي ، مع 0.5 مل aliquots مأخوذة من كل ثقافة في 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من وقت الثقافة للاختبار. تم تصوير الثقافات عندما تم إجراء عمليات الاستخراج لتتبع التغيرات البصرية. بالإضافة إلى ذلك ، تم أخذ 0.5 مل من كل عينة البلغم الأولية قبل الاستزراع. وأ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، تم تطوير نموذج في المختبر لدراسة تأثير فرط الأكسجين على المجتمعات الميكروبية الرئة. هذا النموذج، استنادا إلى البلغم الاصطناعي المتوسطة ويومية تجنيب زجاجات المصل، ويحافظ على تركيزات الأكسجين مرتفعة ويدعم نمو الميكروبات المحددة في البلغم من pwCF.

وهناك عدة خطوات حاسمة في هذا النهج. الأول هو اختيار استخدام مرشح التعقيم بدلا من التعقيم الحراري للوسط البلغم الاصطناعي. يمنع تعقيم المرشحات تدحر الموسين والمكونات الأخرى الحساسة للحرارة في الوسط وينتج عنه وسيط واضح يمكن استخدام...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تنفيذ جزء من هذا العمل في المختبر البيولوجي البحري بدعم من المختبر البيولوجي البحري، وزارة البيئة (DE-SC0016127)، NSF (MCB1822263)، HHMI (رقم المنحة 5600373)، وهدية من مؤسسة سيمونز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

محلول ورق اختبار الأس الهيدروجيني مجموعة محلول محلول نظام Milli-Q. جهاز محلول الدولي . تمديد سريع الإصدار ساني للتخلص منها مناديل مبيدات للجراثيم خزان خزان

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
فيتامينات BME (100x)MilliporeSigmaB6891محلول مركز من الفيتامينات التكميلية.
المكشكش، 30 ممDWK Life Sciences224307Crimper لربط أختام الألمنيوم بزجاجات المصل.
D- (+) - الجلوكوزMilliporeSigmaG7021مسحوق الجلوكوز الصلب (أيزومر dextrorotator).
مضخة الحجاب الحاجز ME 2 NTVACUUBRAND20730003مضخة فراغ للترشيح الفراغي.
مستحلب صفار البيضHiMediaFD045مستحلب معقم من 30٪ صفار بيض في محلول ملحي.
الفيريتين ، موجبة من محلول الفيريتين F7879 من طحال الحصانMilliporeSigmaF7879.
موقد FIREBOY plus Safety Bunsen BurnerIntegra Biosciences144000Bunsen مع واجهة مستخدم وميزات أمان.
ورق الأس الهيدروجيني (1.0 & ndash; 14.0)مختبر Micro Essential94ورقة اختبار الأس الهيدروجيني لنطاق 1.0 &ndash ؛ 14.0.
ورق الأس الهيدروجيني (4.0 & ndash; 9.0)مختبر Micro Essential55ورقة اختبار الأس الهيدروجيني لنطاق 4.0 &ndash ؛ 9.0.
ورق الأس الهيدروجيني (6.0 & ndash ؛ 8.0)Micro Essential Laboratory345لنطاق 6.0 &ndash ؛ 8.0.
جهاز أمان تحت الجلد Needle-Pro EDGE ، 18 GSmiths Medical40181518 G مع أغطية أمان.
مقياس الضغط في الخطMilliporeSigma20469مقياس ضغط الغاز لمراقبة ضغط الزجاجة.
Innova 42 حاضنة شاكرEppendorf2231000756الجمع بين الحاضنة / شاكر المدار.
حقنة Luer-Lok مع إبرة متصلةBecton Dickinson309580مجموعة حقنة 3 مل وإبرة 18 جرام.
متنوعة من أدواتالدقة العالمية14011صمامات لأنابيب تدفق الغاز.
شاكر مداري LSEThermoFisher Scientific6780-NPشاكر مداري لتحريك الوسائط أثناء الترشيح.
كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتMilliporeSigmaM2773ملح إبسوم صلب (كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات).
منظم الهواء الطبي أحادي المرحلة مع مقياس الجريانWestern EnterprisesM1-346-15FMمنظم معدل تدفق الهواء مع 15 لتر / دقيقة متر.
الأحماض الأمينية MEM (50x)MilliporeSigmaM5550محلول مركز من الأحماض الأمينية الأساسية.
الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x)MilliporeSigmaM7145محلول مركز من الأحماض الأمينية غير الأساسية.
مرشح Millex-GP ، 0.22 وميكرو ؛ مMilliporeSigmaSLMP25SS0.22 & micro; م مرشح حقنة معقمة غشاء البولي إيثر سولفون.
تنقية المياه المعقمةMilli-Q AcademicMilliporeSigmaZMQS60E01
MiniOX 3000 Oxygen MonitorMSA814365مراقبة نسبة الأكسجين لتدفق الغاز.
المخزن المؤقت MOPS (1 م ، درجة الحموضة 9.0)مخزن مؤقت بوسطن BioProductsBBM-90MOPS لضبط درجة الحموضة للوسائط.
الميوسين من مسحوق محول معدة الخنازيرMilliporeSigmaM2378Mucin (بروتين مكون للهلام بالجليكوزيلات).
طقم تركيب شائكة من مادة البولي بروبلين الطبيعيةهارفارد72-1413موصلات لأنابيب تدفق الغاز.
مجموعة تحضير مكتبة Nextera XT DNAIlluminaFC-131-1096إعداد المكتبة لتحديد الهوية أثناء التسلسل.
نظام التسلسل NovaSeq 6000Illumina770-2016-025-Nمنصة تسلسل البندقية لتوليد عينات من القراءات.
منظم الأكسجين أحادي المرحلة مع مقياس الجريانWestern EnterprisesM1-540-15FMمنظم معدل تدفق الأكسجين مع 15 لتر / دقيقة متر.
أنابيب الأكسجين مع 2 موصلات قياسية SunMed2001-01أنابيب لتوصيل مكونات نظام الغاز.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 10x ، درجة الحموضة 7.4ملحي مخزن بالفوسفاتالجزيئيMRGF-6235
PC 420 لوحة ساخنة / نماممارشال ScientificCO-PC420مجموعة لوحة ساخنة / محرك.
كلوريد البوتاسيومMilliporeSigmaP9541ملح كلوريد البوتاسيوم الصلب.
قضبان التحريك القابل للتصرف PTFEThermoFisher Scientific14-513-95قضبان التحريك المغناطيسية التي يمكن التخلص منها.
PTFE الخيط ختم تفلون الشريطVWR470042-938التفلون الشريط لتقوية توصيلات نظام الغاز.
خرطوشة تنقية Q-Gard 2خرطوشة تنقية MilliporeSigmaQGARD00D2لنظام Milli-Q.
زجاجات تخزين الوسائط القابلة لإعادة الاستخدامزجاجات ThermoFisher Scientific06-423Aلخلط وتخزين وسائط الثقافة.
سدادة مطاطية ، 30 مم ، رمادي BromobutylDWK Life Sciences224100-331سدادات مطاطية لزجاجات السيروم.
زجاجة مصل مع تخرج مصبوب ، 500 ملDWK Life Sciences223952زجاجات مصل زجاجية للزراعة المختومة.
مجموعة تمديد التجويف الصغيرةBraun Medical471960الأنابيب مع موصلات قفل لور.
كلوريد الصوديومMilliporeSigmaS3014ملح كلوريد الصوديوم الصلب.
التحكم في سبايك في I (الحمل الميكروبي العالي)ZymoBIOMICSD6320الميكروبات المسببة في (I. halotolerans و A. halotolerans) لحسابات الحمل الميكروبي المطلق
Stericup نظام الترشيح الفراغي المعقمMilliporeSigmaS2GPU02RE250 مل 0.22 & م غرفة الترشيح فراغ.
مناديل مبللة للجراثيم يمكن التخلص منها من القماش الفائقالاحترافية InternationalH04082مناديل مبيدات للجراثيم يمكن التخلص منها للتعقيم.
خليط المعادن النزرة ، محلول مركز 1000xThermoFisher ScientificNC0112668للمعادن النزرة الفسيولوجية.
ختم ألومنيوم غير مبطن ، 30 ممDWK Life Sciences224187-01أختام ألومنيوم مجعدة فوق السدادات المطاطية.
خزان هواء طبي USPهواء Airgas الذكاء الاصطناعي USP200خزان هواء مضغوط للمدخلات إلى نظام التناثر.
خزان الأكسجين الطبي USPAirgasOX USP200الأكسجين المضغوط للمدخلات إلى نظام التقشير.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060(2018).
  2. Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
  3. Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798(2018).
  4. Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
  5. Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
  6. Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
  7. Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
  8. Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532(2017).
  9. Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , Version 1 (2010).
  10. Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857(2012).
  11. Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423(2017).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938(2015).
  14. Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846(2016).
  15. Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
  16. Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
  17. Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953(2020).
  18. McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
  19. Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
  20. Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28(2016).
  21. Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
  22. Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
  23. Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
  24. Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390(2017).
  25. Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
  26. Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cystic Fibrosis MicrobiomeSupplemental OxygenArtificial Sputum MediumAirway Microbial CommunitiesOxygen SpargingSerum Bottle CultureMetagenomic SequencingMicrobial Community CompositionLung PathogensFilter Sterilization

Related Articles