مقالة منهجية

قياس تدفق الركيزة الميتوكوندريا في الخلايا المتالفة Perfringolysin O-Permeabilized

DOI:

10.3791/62902

⸱

أغسطس 13, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكول معدل لاختبار تدفق الركيزة التنفسية الميتوكوندريا باستخدام perfringolysin O المؤتلف في تركيبة مع قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة. مع هذا البروتوكول، نظهر كيف يؤثر الميتفورمين على تنفس الميتوكوندريا لخطين مختلفين للخلايا السرطانية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تدفق الركيزة الميتوكوندريا هو سمة مميزة لكل نوع من أنواع الخلايا، وتشارك التغيرات في مكوناته مثل الناقلين، والقنوات، أو الإنزيمات في مسببات الأمراض من عدة أمراض. يمكن دراسة تدفق الركيزة الميتوكوندريا باستخدام الخلايا السليمة، والخلايا permeabilized، أو الميتوكوندريا المعزولة. التحقيق في الخلايا سليمة يواجه العديد من المشاكل بسبب الأكسدة في وقت واحد من الركائز المختلفة. الى جانب ذلك ، تحتوي عدة أنواع من الخلايا على مخازن داخلية من الركائز المختلفة التي تعقد تفسير النتائج. طرق مثل عزل الميتوكوندريا أو استخدام عوامل البيرميلينج ليست قابلة للاستنساخ بسهولة. عزل الميتوكوندريا النقية مع الأغشية سليمة بكميات كافية من عينات صغيرة إشكالية. استخدام permeabilizers غير انتقائية يسبب درجات مختلفة من تلف غشاء الميتوكوندريا لا مفر منه. تم تقديم perfringolysin O المؤتلف (rPFO) كمطهر أكثر ملاءمة ، وذلك بفضل قدرته على اختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي دون التأثير على سلامة الميتوكوندريا. عندما تستخدم في تركيبة مع قياس التنفس microplate، فإنه يسمح اختبار تدفق العديد من الركائز الميتوكوندريا مع ما يكفي من يكرر داخل تجربة واحدة أثناء استخدام الحد الأدنى من عدد الخلايا. في هذا العمل، يصف البروتوكول طريقة لمقارنة تدفق الركيزة الميتوكوندريا من اثنين من الأنماط الظاهرية الخلوية المختلفة أو الأنماط الجينية ويمكن تخصيصها لاختبار ركائز الميتوكوندريا المختلفة أو مثبطات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أحدثت ثورة في قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة أبحاث الميتوكوندريا من خلال تمكين دراسة التنفس الخلوي لحجم عينة صغيرة1. ويعتبر التنفس الخلوي عموما كمؤشر على وظيفة الميتوكوندريا أو "خلل وظيفي", على الرغم من حقيقة أن مجموعة الميتوكوندريا من الوظائف يمتد إلى ما بعد إنتاج الطاقة2. في الظروف الهوائية، الميتوكوندريا استخراج الطاقة المخزنة في ركائز مختلفة عن طريق كسر وتحويل هذه الركائز إلى وسيطة الأيض التي يمكن أن تغذي دورة حمض الستريك3 (الشكل 1). التدفق المستمر للركائز ضروري لتدفق دورة حمض الستريك لتوليد الطاقة العالية "المتبرعين بالإلكترون"، والتي توفر الإلكترونات إلى سلسلة نقل الإلكترون التي تولد تدرج البروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي، مما يتيح ATP-synthase إلى فوسفوريلات ADP إلى ATP4. لذلك ، يجب أن يتضمن التصميم التجريبي لاحساس تنفس الميتوكوندريا طبيعة العينة (الخلايا السليمة ، والخلايا permeabilized ، أو الميتوكوندريا المعزولة) وركائز الميتوكوندريا.

تحتفظ الخلايا بتخزين الركائز الأصلية5، وتأكسد الميتوكوندريا عدة أنواع من الركائز في وقت واحد6، مما يعقد تفسير النتائج التي تم الحصول عليها من التجارب التي أجريت على خلايا سليمة. نهج مشترك للتحقيق في قدرة الميتوكوندريا لأكسدة ركيزة مختارة هو عزل الميتوكوندريا أو permeabilize الخلايا التحقيق5. على الرغم من أن الميتوكوندريا المعزولة مثالية للدراسات الكمية ، إلا أن عملية العزل شاقة. ويواجه صعوبات تقنية مثل الحاجة إلى حجم عينة كبيرة، ونقاء الغلة، وإعادة إنتاج تقنية5. الخلايا Permeabilized تقدم حلا لعيوب عزل الميتوكوندريا; ومع ذلك، فإن عوامل البيرمابيلينج الروتينية لطبيعة المنظفات ليست محددة وقد تلحق الضرر بالأغشية الميتوكوندريا5.

تم تقديم perfringolysin O المؤتلف (rPFO) كعامل انتقائي لغشاء البلازما permeabilizing7، وتم استخدامه بنجاح في تركيبة مع محلل تدفق خارج الخلية في العديد من الدراسات7و8و9و10. لقد قمنا بتعديل بروتوكول باستخدام rPFO لفحص تدفق الركيزة الميتوكوندريا باستخدام محلل التدفق خارج الخلية XFe96. في هذا البروتوكول، تتم مقارنة أربعة مسارات أكسدة ركائز مختلفة في اثنين من الأنماط الظاهرية الخلوية مع وجود تكرارات كافية والتحكم المناسب لكل مادة تم اختبارها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. قبل يوم واحد من الفحص

  1. إعداد الكواشف والركائز.
    1. محلول المقايسة الميتوكوندريا (MAS): إعداد حلول المخزون لجميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 1. تدفئة مخزونات مانيتول و السكروز إلى 37 درجة مئوية لتذوب تماما. تخلط الكواشف لإعداد ماس 2x، ثم تسخين الخليط إلى 37 درجة مئوية. ضبط درجة الحموضة مع 5N KOH إلى 7.4 (~ 7 مل)، ثم إضافة الماء لجعل حجم يصل إلى 1 L. تصفية تعقيم وتخزين الاقتباسات في -20 درجة مئوية حتى يوم القياس.
    2. الألبومين مصل البقر (5٪ BSA): حل 5 غرام من جيش استقلال اليابان في 90 مل من الماء العقيم قبل الحرب على ستيرر المغناطيسي وتجنب اهتزاز. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 5 N KOH، ثم إضافة الماء لرفع مستوى الصوت يصل إلى 100 مل. تصفية تعقيم وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية حتى يوم القياس.
    3. ركائز الميتوكوندريا: إعداد 1 M حلول الأسهم من الصوديوم succinate، بيروفات الصوديوم، وغلوتامات الصوديوم في الماء العقيم. إعداد محلول مخزون 100 mM من مالات الصوديوم في الماء العقيم واستخدام المياه العقيمة قبل الحرب لإعداد محلول مخزون 10 mM من كارنيتين بالميتويل. ضبط درجة الحموضة لكل حل إلى 7.4 في 5 N KOH ومرشح تعقيم. تخزين الركائز في 2-8 درجة مئوية. في وقت الاستخدام، دافئ البالميتويل كارنيتين إلى 37 درجة مئوية لإذابة أي رواسب. للاستخدام في وقت لاحق، متجر aliquots من جميع الركائز باستثناء بيروفات في -20 درجة مئوية.
    4. مثبطات الميتوكوندريا: استخدم ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لإعداد حلول المخزون من أوليغومايسين 25 مللي متر، 50 مللي متر سيانيد الكربونيل 4-(ثلاثي فلوريوميثوكسي) فينيلهيدرازون (FCCP)، 20 مليون روكتون، و 20 مللي متر أنتيميسين A. تخزين اليكوتس في -20 درجة مئوية.
  2. بذر وعلاج الخلايا: كما هو مبين في الشكل 2، بذرة الخلايا في الأعمدة 2-11. يجب ترك العمودين 1 و12 فارغين ليكونا بمثابة آبار خلفية. في هذا العمل، تم استخدام خلايا HepG2 و A549.
    1. زرع الخلايا في كثافة 20،000 خلية لكل بئر. استخدام 50-80 ميكرولتر من الخلايا ثقافة المتوسطة للبذر.
    2. ملء الآبار الفارغة مع حجم متساو من الخلايا ثقافة المتوسطة واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب مع 5٪ CO2. السماح للخلايا لإرفاق لمدة 3-4 ساعات، ومن ثم إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا الثقافة المتوسطة لجميع الآبار.
    3. مع هذه الإضافة المتوسطة النهائية ، طبق العلاج في الأعمدة 7-11. وفي هذا العمل، عولجت المجموعة التجريبية بهيدروكلوريد ميتفورمين طوله مليون متر لمدة 16 ساعة، وعولجت مجموعة المراقبة بحجم متساو من الماء المقطر العقيم كتحكم في السيارة.
  3. ترطيب أجهزة الاستشعار: ماصة 200 ميكرولتر من الماء العقيم لكل بئر في لوحة المرافق، ثم العودة بعناية خرطوشة الاستشعار في حين غمر أجهزة الاستشعار في الماء. احتضان خرطوشة في حاضنة CO2خالية في 37 درجة مئوية حتى اليوم التالي.
  4. قالب بروتوكول المقايسة: قم بتشغيل محلل (راجع جدول المواد)ووحدة وحدة التحكم. بدء تشغيل برنامج التحكم في الأدوات والحصول على البيانات وتصميم بروتوكول المقايسة كما هو موضح في الجدول 2. تحت تعريفات المجموعة، إنشاء أربع استراتيجيات الحقن حيث المنفذ A يختلف وفقا للركيزة حقن (الشكل 3). قم بتسمية الاستراتيجيات بعد الركائز أو اختصاراتها.
  5. إلى المنافذ B و C و D، قم بتعيين مركبات أوليغومايسين، FCCP، وروتينون/أنتيميسين A، على التوالي. إنشاء ثماني مجموعات وتسميتها كما هو موضح في الشكل 4. ضمن خريطة لوحة تعيين المجموعات إلى الآبار المطابقة، ثم حفظ البروتوكول كقالب جاهز للاستخدام. اترك المحلل قيد التشغيل للسماح لدرجة الحرارة بالاستقرار بين عشية وضحاها. الحفاظ على محلل في مكان مع درجة حرارة مستقرة لتجنب التغيرات المفاجئة في درجة الحرارة.

2. يوم الفحص

  1. استبدال الماء مع calibrant: تجاهل المياه من لوحة المرافق وماصة 200 ميكرولتر من calibrant prewarmed لكل بئر في لوحة المرافق. أعد الخرطوشة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون2-freeحتى وقت الفحص. لتجنب التبخر السريع للخلاب، حافظ على مصدر للرطوبة داخل الحاضنة واطفئ سرعة المروحة أو قللها إلى أدنى حد ممكن.
  2. إعداد حلول العمل: ابدأ بارتفاع درجة حرارة 2x MAS، و5٪ BSA، والمياه العقيمة إلى 37 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه، السماح للمخزونات المثبطة للوصول إلى درجة حرارة الغرفة. استخدام الحارة 2x ماس والماء المقطر العقيم لإعداد 5 مل من تركيز العمل من الركائز ومثبطات كما هو موضح في الجدول 3.
  3. تحميل منافذ الحقن: كما هو مبين في الشكل 3، تحميل 20 ميكرولتر من الركائز في المنفذ A. تحميل خليط succinate / rotenone في المنفذ A من الصفوف A و B. تحميل خليط بيروفيت / مالات في الميناء A من الصفوف C و D. تحميل خليط الغلوتامات / مالات في المنفذ A من الصفوف E و F. تحميل خليط كارنيتين البالميتويل / مالات في المنفذ A من الصفين G و H. لوحة كاملة، تحميل ميناء B مع 22 ميكرولتر من إعداد أوليغوميسين، ميناء C مع 25 ميكرولتر من إعداد FCCP، وميناء D مع 27 ميكروغرام من rotenone / antimycin خليط.
  4. بدء خطوة المعايرة: ضمن علامة التبويب تشغيل الفحص، انقر على تشغيل البدء لبدء الفحص. أدخل خرطوشة المستشعر المحملة وابدأ خطوة المعايرة. انتظر حتى تكتمل المعايرة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  5. إعداد وسيط الفحص (MAS-BSA-rPFO): لإعداد 20 مل من وسيط المقايسة، اخلط 10 مل من 2x MAS، و9.2 مل من الماء العقيم، و0.8 مل من 5٪ BSA في أنبوب 50 مل. إضافة 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر rPFO لتحقيق تركيز 1 nM وإعادة إنفاق الخليط مع pipetting لطيف. تجنب الهز ولا تستخدم خلاط دوامة للخلط. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية حتى وقت الاستخدام.
  6. غسل الخلايا: اغسل الخلايا والآبار الفارغة الفارغة مرتين باستخدام فوسفات مسبق الالسيوم والمغنيسيوم الخالي من الملحية (PBS) باستخدام ماصة متعددة القنوات. تجنب إعادة استخدام نفس النصائح لتجاهل وسيطة ثقافة الخلية وإضافة PBS. نفذ هذه الخطوة خارج تدفق صفح لحماية الخلايا من الجفاف من تدفق الهواء.
  7. permeabilization الخلية في المتوسط المقايسة: باستخدام ماصة متعددة القنوات، تجاهل برنامج تلفزيوني واستبداله مع 180 ميكرولتر من المتوسطة المقايسة prewarmed (MAS-BSA-rPFO).
  8. بدء القياس: بعد البيرميلات مباشرة، استبدل لوحة المنفعة لخرطوشة المستشعر المعايرة بلوحة الخلية وابدأ القياس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ابدأ بتطبيع النتائج إلى القياس الثاني للتنفس الأساسي لإظهار القيم كنسبة مئوية لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR٪). تظهر نتائج الفحص في الشكل 5والشكل 6 والشكل 7 والشكل 8. من المهم تعيين الآبار الخلفية المناسبة لكل مجموعة وتعطيل الآبار الخلفية للمجموعات الأخرى. ويبين الشكل 5 أن المجموعة المعالجة لديها معدل أعلى من التنفس الناجم عن النجدة. وكانت اس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول هو تعديلللدراسات المنشورة سابقا7و8و9و10 ودليل مستخدم المنتج. على النقيض من بروتوكول الشركة المصنعة، يستخدم 2x ماس بدلا من ماس 3x، منذ 2× ماس هو أسهل لتذوب ولا تشكل هطول الأمطار بعد التجمد. المجمدة 2x MAS aliquots يمكن تخزينها حتى ستة أشهر وتظهر نتائج متسقة. وثمة فرق آخر هو بما في ذلك ADP في مكونات ماس 2x وحذف BSA من الصيغة. الحلول التي تحتوي على BSA هي أكثر صعوبة لحقن وتسبب إمكان...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون موظفي قسم علم وظائف الأعضاء في كلية الطب في هراديك كرالوفي وقسم الفيزيولوجيا المرضية في الكلية الثالثة للطب على المساعدة في إعداد المواد الكيميائية والعينات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تشارلز برامج المنح PROGRES Q40/02، منحة وزارة الصحة التشيكية NU21-01-00259، منحة مؤسسة العلوم التشيكية 18-10144 ومشروع INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 بتمويل من وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية والاتحاد الأوروبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأدينوزين 5 & prime; -ثنائي الفوسفات أحادي البوتاسيوم ملح ثنائي هيدراتMerckA5285مخزن في -20 & درجة ؛ متجر C
Antimycin AMerckA8674عند -20 درجة ؛ C
مصل الأبقار الألبومينميركA3803مخزن في 2 - 8 درجة ؛ C
كربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازونMerckC2920مخزن في -20 درجة ؛ متجر سي
ثنائي ميثيل سلفوكسيدميركD8418في متجر RT
D-MannitolMerck63559في
RT Dulbecco الملحي الممخزن بالفوسفاتGibco14190-144في RT
Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether) -N ، N ، N ، N ، N ؛ - حمض رباعي الأسيتيكمتجر Merck03777في RT
HEPESMerckمتجر H7523في RT
L (-) ملح حمض الماليك ثنائي الصوديومMerckM9138في RT
L-Glutamic حمض الصوديوم ملح هيدراتMerckG5889مخزن في RT
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتMerckM2670في RT
OligomycinMerckO4876متجر في -20 درجة ؛ C
Palmitoyl-DL-carnitine كلوريدMerckP4509مخزن في -20 درجة ؛ متجر
484016 هيدروكسيد البوتاسيومMerckفي متجر RT
Potassium Potassium أحادي القاعدةMerckP5655في متجر RT
RotenoneMerckR8875في -20 درجة ؛ C
Seahorse Wave Desktop Softwareتقنيات Agilentتنزيل من www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzerتقنيات Agilent
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent تقنيات102416-100XFe96 وألواح دقيقة لثقافة الخلايا XF96
مخزن بيروفات الصوديومMerckP2256عند 2 - 8 درجة ؛ متجر C
سكسينات الصوديوم ثنائي القاعدة سداسي هيدراتMerckS2378في متجر RT
SucroseMerckS7903في متجر RT
WaterMerckW3500في
متجر RT XF Agilenttechnologies100840-000في RT
XF نفاذة غشاء البلازماAgilent Technologies102504-100المؤتلف perfringolysin O (rPFO) - Aliquot وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج
متجر ، متجر C Seahorse XFe96

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

O Seahorse XF A549

مقالات ذات صلة