في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكول معدل لاختبار تدفق الركيزة التنفسية الميتوكوندريا باستخدام perfringolysin O المؤتلف في تركيبة مع قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة. مع هذا البروتوكول، نظهر كيف يؤثر الميتفورمين على تنفس الميتوكوندريا لخطين مختلفين للخلايا السرطانية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس تدفق الركيزة الميتوكوندريا في الخلايا المتالفة Perfringolysin O-Permeabilized
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تدفق الركيزة الميتوكوندريا هو سمة مميزة لكل نوع من أنواع الخلايا، وتشارك التغيرات في مكوناته مثل الناقلين، والقنوات، أو الإنزيمات في مسببات الأمراض من عدة أمراض. يمكن دراسة تدفق الركيزة الميتوكوندريا باستخدام الخلايا السليمة، والخلايا permeabilized، أو الميتوكوندريا المعزولة. التحقيق في الخلايا سليمة يواجه العديد من المشاكل بسبب الأكسدة في وقت واحد من الركائز المختلفة. الى جانب ذلك ، تحتوي عدة أنواع من الخلايا على مخازن داخلية من الركائز المختلفة التي تعقد تفسير النتائج. طرق مثل عزل الميتوكوندريا أو استخدام عوامل البيرميلينج ليست قابلة للاستنساخ بسهولة. عزل الميتوكوندريا النقية مع الأغشية سليمة بكميات كافية من عينات صغيرة إشكالية. استخدام permeabilizers غير انتقائية يسبب درجات مختلفة من تلف غشاء الميتوكوندريا لا مفر منه. تم تقديم perfringolysin O المؤتلف (rPFO) كمطهر أكثر ملاءمة ، وذلك بفضل قدرته على اختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي دون التأثير على سلامة الميتوكوندريا. عندما تستخدم في تركيبة مع قياس التنفس microplate، فإنه يسمح اختبار تدفق العديد من الركائز الميتوكوندريا مع ما يكفي من يكرر داخل تجربة واحدة أثناء استخدام الحد الأدنى من عدد الخلايا. في هذا العمل، يصف البروتوكول طريقة لمقارنة تدفق الركيزة الميتوكوندريا من اثنين من الأنماط الظاهرية الخلوية المختلفة أو الأنماط الجينية ويمكن تخصيصها لاختبار ركائز الميتوكوندريا المختلفة أو مثبطات.
المقدمة
وقد أحدثت ثورة في قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة أبحاث الميتوكوندريا من خلال تمكين دراسة التنفس الخلوي لحجم عينة صغيرة1. ويعتبر التنفس الخلوي عموما كمؤشر على وظيفة الميتوكوندريا أو "خلل وظيفي", على الرغم من حقيقة أن مجموعة الميتوكوندريا من الوظائف يمتد إلى ما بعد إنتاج الطاقة2. في الظروف الهوائية، الميتوكوندريا استخراج الطاقة المخزنة في ركائز مختلفة عن طريق كسر وتحويل هذه الركائز إلى وسيطة الأيض التي يمكن أن تغذي دورة حمض الستريك3 (الشكل 1). التدفق المستمر للركائز ضروري لتدفق دورة حمض الستريك لتوليد الطاقة العالية "المتبرعين بالإلكترون"، والتي توفر الإلكترونات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. قبل يوم واحد من الفحص
- إعداد الكواشف والركائز.
- محلول المقايسة الميتوكوندريا (MAS): إعداد حلول المخزون لجميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 1. تدفئة مخزونات مانيتول و السكروز إلى 37 درجة مئوية لتذوب تماما. تخلط الكواشف لإعداد ماس 2x، ثم تسخين الخليط إلى 37 درجة مئوية. ضبط درجة الحموضة مع 5N KOH إلى 7.4 (~ 7 مل)، ثم إضافة الماء لجعل حجم يصل إلى 1 L. تصفية تعقيم وتخزين الاقتباسات في -20 درجة مئوية حتى يوم القياس.
- الألبومين مصل البقر (5٪ BSA): حل 5 غرام من جيش استقلال اليابان في 90 مل من الماء العقيم قبل الحرب على ستيرر المغناطيسي وتجنب اهتزاز. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 5 N KOH، ثم إضافة الماء لرفع مستوى الصوت يصل إلى 100 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ابدأ بتطبيع النتائج إلى القياس الثاني للتنفس الأساسي لإظهار القيم كنسبة مئوية لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR٪). تظهر نتائج الفحص في الشكل 5والشكل 6 والشكل 7 والشكل 8. من المهم تعيين الآبار الخلفية المناسبة لكل مجموعة وتعطيل الآبار الخلفية للمجموعات الأخرى. ويبين الشكل 5 أن المجموعة المعالجة لديها معدل أعلى من التنفس الناجم عن النجدة. وكانت اس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول هو تعديلللدراسات المنشورة سابقا7و8و9و10 ودليل مستخدم المنتج. على النقيض من بروتوكول الشركة المصنعة، يستخدم 2x ماس بدلا من ماس 3x، منذ 2× ماس هو أسهل لتذوب ولا تشكل هطول الأمطار بعد التجمد. المجمدة 2x MAS aliquots يمكن تخزينها حتى ستة أشهر وتظهر نتائج متسقة. وثمة فرق آخر هو بما في ذلك ADP في مكونات ماس 2x وحذف BSA من الصيغة. الحلول التي تحتوي على BSA هي أكثر صعوبة لحقن وتسبب إمكان.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون موظفي قسم علم وظائف الأعضاء في كلية الطب في هراديك كرالوفي وقسم الفيزيولوجيا المرضية في الكلية الثالثة للطب على المساعدة في إعداد المواد الكيميائية والعينات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تشارلز برامج المنح PROGRES Q40/02، منحة وزارة الصحة التشيكية NU21-01-00259، منحة مؤسسة العلوم التشيكية 18-10144 ومشروع INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 بتمويل من وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية والاتحاد الأوروبي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأدينوزين 5 & prime; -ثنائي الفوسفات أحادي البوتاسيوم ملح ثنائي هيدرات | Merck | A5285 | مخزن في -20 & درجة ؛ متجر C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | عند -20 درجة ؛ C |
| مصل الأبقار الألبومين | ميرك | A3803 | مخزن في 2 - 8 درجة ؛ C |
| كربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون | Merck | C2920 | مخزن في -20 درجة ؛ متجر سي |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | ميرك | D8418 | في متجر RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | في |
| RT Dulbecco الملحي الممخزن بالفوسفات | Gibco | 14190-144 | في RT |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether) -N ، N ، N ، N ، N ؛ - حمض رباعي الأسيتيك | متجر Merck | 03777 | في RT |
| HEPES | Merck | متجر H7523 | في RT |
| L (-) ملح حمض الماليك ثنائي الصوديوم | Merck | M9138 | في RT |
| L-Glutamic حمض الصوديوم ملح هيدرات | Merck | G5889 | مخزن في RT |
| كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات | Merck | M2670 | في RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | متجر في -20 درجة ؛ C |
| Palmitoyl-DL-carnitine كلوريد | Merck | P4509 | مخزن في -20 درجة ؛ متجر |
| 484016 هيدروكسيد البوتاسيوم | Merck | في متجر RT | |
| Potassium Potassium أحادي القاعدة | Merck | P5655 | في متجر RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | في -20 درجة ؛ C |
| Seahorse Wave Desktop Software | تقنيات Agilent | تنزيل من www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | تقنيات Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent تقنيات | 102416-100 | XFe96 وألواح دقيقة لثقافة الخلايا XF96 |
| مخزن بيروفات الصوديوم | Merck | P2256 | عند 2 - 8 درجة ؛ متجر C |
| سكسينات الصوديوم ثنائي القاعدة سداسي هيدرات | Merck | S2378 | في متجر RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | في متجر RT |
| Water | Merck | W3500 | في |
| متجر RT XF Agilent | technologies | 100840-000 | في RT |
| XF نفاذة غشاء البلازما | Agilent Technologies | 102504-100 | المؤتلف perfringolysin O (rPFO) - Aliquot وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج |
المراجع
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondria....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
