مقالة منهجية

تصوير الميتوكوندريا Ca2 + امتصاص في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام ترميز وراثيا Ca2 + مؤشرات (GECIs)

DOI:

10.3791/62917

⸱

يناير 22, 2022

 ,  ,  , 
1Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri-Columbia, 2Department of Biomedical, Biological and Chemical Engineering, University of Missouri-Columbia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا proctocol إلى توفير طريقة للتصوير في المختبر وفي الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrial Ca2+ يلعب دورا حاسما في السيطرة على التخزين المؤقت Ca2 + السيتوسوليك، واستقلاب الطاقة، ونقل الإشارات الخلوية. يساهم الحمل الزائد للميتوكوندريا Ca2+ في حالات مرضية مختلفة ، بما في ذلك التنكس العصبي وموت الخلايا المبرمج في الأمراض العصبية. هنا نقدم خلية من نوع محدد والميتوكوندريا التي تستهدف النهج الجزيئي للتصوير الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي. قمنا ببناء بلازميدات الحمض النووي ترميز الميتوكوندريا استهداف المشفرة وراثيا Ca2 + مؤشرات (GECIs) GCaMP5G أو GCaMP6s (GCaMP5G/6s) مع الخلايا الفلكية والخلايا العصبية محددة المروجين gfaABC1D وCaMKII وتسلسل استهداف الميتوكوندريا (ميتو-). للتصوير في المختبر الميتوكوندريا Ca2 + ، تم تحويل البلازميدات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية المستزرعة للتعبير عن GCaMP5G/6s. في الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + التصوير, تم إعداد ناقلات الفيروس المرتبطة أدينو (AAVs) وحقنها في أدمغة الماوس للتعبير عن GCaMP5G/6s في الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية. نهجنا يوفر وسيلة مفيدة لتصوير الميتوكوندريا Ca2 + ديناميات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية لدراسة العلاقة بين السيتوسوليك والميتوكوندريا Ca2 + الإشارات، فضلا عن التفاعلات بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي العضيات دون الخلوية الديناميكية وتعتبر مراكز قوة الخلية لإنتاج الطاقة. من ناحية أخرى، يمكن أن يستغرق الميتوكوندريا Ca2 + إلى المصفوفة استجابة لارتفاع Ca2+ المحلي أو الخلوي. الميتوكوندريا Ca2+ امتصاص يؤثر على وظيفة الميتوكوندريا, بما في ذلك عمليات التمثيل الغذائي مثل ردود الفعل في دورة حمض tricarboxylic (TCA) والفوسفور التأكسدي, وينظم Ca2+البروتينات الحساسة في ظل الظروف الفسيولوجية1,2,3,4. الميتوكوندريا Ca2 + الزائد هو أيضا محدد للموت الخلية, بما في ذلك نخر وموت الخلايا المبرمج في اضطرابات الدماغ المختلفة5,6,7. فإنه يسبب فتح المسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا (mPTPs) والإفراج عن العامل المساعد كاسباس، والتي تبدأ موت الخلايا المبرمج. لذلك ، من المهم دراسة ديناميات Mitochondrial Ca2 + والتعامل معها في الخلايا الحية لفهم فسيولوجيا الخلايا وعلم الأمراض بشكل أفضل.

الميتوكوندريا الحفاظ على مصفوفة Ca2 + التوازن من خلال التوازن بين امتصاص Ca2 + وefflux. يتم التوسط أساسا الميتوكوندريا كا2 + امتصاص من قبل الميتوكوندريا Ca2 + uniporters (MCUs)، في حين يتم التوسط الميتوكوندريا Ca2 + efflux من قبل نا+-Ca2 +- لي+ المبادلات (NCLXs) وH+/ Ca2 + المبادلات (mHCXs)8. يمكن أن يكون التوازن المضطرب من خلال تحفيز مستقبلات G-البروتين مقرونة (GPCRs)9. الميتوكوندريا Ca2 + التوازن يتأثر أيضا التخزين المؤقت الميتوكوندريا من خلال تشكيل xCa غير قابل للذوبان2 +-xPO4x-xOH المجمعات8.

يمكن تقييم التغيرات داخل الخلايا والميتوكوندريا في تركيز Ca2 + ([Ca2+]) من خلال مؤشرات الفلورسنت أو الإنارة Ca2+ . Ca2 + ملزمة للمؤشرات يسبب تعديلات الطيفية، مما يسمح لتسجيل الخلوية الحرة [Ca2 +] في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. يتوفر حاليا نوعان من المسابير لمراقبة تغيرات Ca2+ في الخلايا: المؤشرات الكيميائية العضوية ومؤشرات Ca2+ المشفرة وراثيا (GECIs). عموما، المتغيرات المختلفة مع مختلف Ca2 + تقارب (على أساس Kد)،خصائص الطيفية (الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات)، والنطاقات الديناميكية، والحساسيات متاحة للأسئلة البيولوجية قيد التحقيق. على الرغم من أن العديد من الاصطناعية العضوية Ca2+ وقد استخدمت مؤشرات للتصوير الخلوي Ca2 + ، إلا أن عدد قليل فقط يمكن تحميلها بشكل انتقائي في مصفوفة الميتوكوندريا للتصوير Mitochondrial Ca2 + ، مع رود - 2 كونها الأكثر استخداما على نطاق واسع (للاستعراضات انظر10،11). ومع ذلك، رود-2 لديه عيب كبير من التسرب خلال التجارب طويلة الوقت بالطبع؛ بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقسيمه بين الميتوكوندريا ، العضيات الأخرى والسيتوسول ، مما يجعل القياسات المطلقة في الأقسام الفرعية المختلفة صعبة. في المقابل ، باستخدام المروجين محددة من نوع الخلية وتسلسل استهداف المقصورة دون الخلوية ، يمكن التعبير عن GECIs في أنواع مختلفة من الخلايا والمقصورات دون الخلوية للتصوير Ca2 + الخاص بالخلايا والمقصورة في المختبر أو في الجسم الحي. وقد ظهرت مؤخرا واحد الطول الموجي الفلورسينس القائم على كثافة GCaMP Ca2 + مؤشرات كبرى GECIs12،13،14،15،16. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكولا لاستهداف الميتوكوندريا والتعبير عن نوع الخلية محددة من GCaMP5G وGCaMP6s (GCaMP5G/6s) في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، والتصوير الميتوكوندريا كا2 + امتصاص في هذه الأنواع من الخلايا. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن التعبير عن GCaMP6G/6s في الميتوكوندريا الفردية، ويمكن تحقيق امتصاص Ca2+ في دقة الميتوكوندريا واحدة في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ميسوري - كولومبيا على الإجراءات المتعلقة بالحيوانات.

1. بناء البلازميدات الحمض النووي

ملاحظة: للتصوير في المختبر وفي الجسم الحي، يتم إنشاء بلازميدات الحمض النووي التي تترميز GCaMP5G/6s مع المروجين للخلايا الفلكية والخلايا العصبية الخاصة وتسلسل استهداف الميتوكوندريا.

  1. إدراج مصفوفة الميتوكوندريا (MM) - تسلسل الاستهداف (ميتو-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 في استنساخ المواقع EcoRI وBamHI في العمود الفقري للفيروس المرتبطة أدينو (AAV) بلازميد pZac2.1 للحصول على البلازميدات التي تحتوي على gfaABCالفلكية 1D المروج أو الخلايا العصبية CaMKII المروج18،19،20.
  2. Subclone GCaMP5G/6s في مواقع الاستنساخ BamH الأول وليس 1 في البلازميدات أعلاه للحصول على بلازميدات جديدة pZac-gfaABC1D-ميتو-GCaMP5G/6s وpZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s التي تستهدف التعبير المتحول في الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية20،21 (الشكل 1A).
  3. إعداد pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G وpZac-CaMKII-mito-GCaMP6s الحمض النووي البلازميدات لtransfection للدراسة في المختبر (القسم 2). إنتاج ناقلات AAV مع النمط المصلي 5 للخلايا الفلكية والنمط المصلي 9 للخلايا العصبية للدراسة في الجسم الحي 18 (القسم 3).

2. في المختبر الميتوكوندريا Ca2 + التصوير في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية

  1. إعداد الخلايا الفلكية الأولية من قشرة فئران P1 الوليدية والخلايا العصبية الأولية من قشرة E15-16 الأجنة18،22،23،24، وزراعة لهم على الزجاج قطرها 12 ملم coverlips في لوحات 24 جيدا باستخدام دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، والمتوسط القاعدي العصبية (NBM) التي تحتوي على 2٪ B27، على التوالي.
  2. Transfect الخلايا الفلكية الناضجة والخلايا العصبية مع pZac-gfaABC1D-GCaMP6s وpZac-CaMKII-GCaMP5G البلازميدات باستخدام كاشف العدوى القائم على الدهون للتعبير عن GCaMP6s في الميتوكوندريا من الخلايا الفلكية وGCaMP5G في الميتوكوندريا من الخلايا العصبية18,20,21. خلايا العدوى في كل بئر مع 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي، وتغيير المتوسطة 6 ساعة في وقت لاحق.
    ملاحظة: الخلايا الفلكية والخلايا العصبية جاهزة للتصوير بعد 1-2 أيام من العدوى.
  3. إجراء التصوير في المختبر الميتوكوندريا Ca2+ بعد 1-2 أيام من العدوى.
    1. نقل الأغطية الزجاجية المستزرعة مع الخلايا الفلكية أو الخلايا العصبية إلى غرفة التشوش PH-1 تحت المجهر الضوئي أو اثنين.
    2. تحفيز الميتوكوندريا الفلكية Ca2+ امتصاص مع 100 μM ATP في ACSF, أو تحفيز الميتوكوندريا العصبية مع 100 ميكرومتر الغلوتامات/10 ميكرومتر غليسين20,25 (الشكل 2 والشكل 3).
      ملاحظة: يتم التحكم في تغييرات الحل من ACSF إلى ATP- والغلوتامات / الجليسين التي تحتوي على ACSF من قبل نظام تغلغل ALA-VM821. يتم التحكم في سرعة تغيير الحل عند 1-2 مل / دقيقة عن طريق ضبط صمام.

3. في الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + التصوير في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية

  1. الاستعدادات AAV.
    1. إعداد ناقلات الفيروسات التالية المؤتلفة المرتبطة بال أدينو (rAAV) باستخدام بلازميدات الحمض النووي المعدة في القسم 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G و rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
      ملاحظة: في هذه التجربة، تم إعداد ناقلات rAAV من النمط المصلي 5 للتعبير عن GCaMP5G في الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية وكانت ناقلات rAAV من النمط المصلي 9 مستعدة للتعبير عن GCaMP6s في الميتوكوندريا في الخلايا العصبية.
  2. حقن AAV ستيريوتاكسيك.
    1. تخدير الماوس مع 3٪ isoflurane.
      ملاحظة: في وقت لاحق أثناء الجراحة، يتم تخفيض مستويات isoflurane إلى 2٪.
    2. بعد أن يصل الفأر إلى مستوى جراحي من التخدير ، كما يحدده الذيل وقرصة إصبع القدم ، حلق الشعر فوق موقع الجراحة أو القشرة الحركية أو الحسية ، مع أداة تشذيب الشعر.
    3. ضع الماوس على جهاز الماوس المجسم وأصلح الرأس بقضبان الأذن. ضعي مرهم العيون على العينين لحمايتهما أثناء الجراحة. استخدم وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر عند 37 درجة مئوية طوال الجراحة.
      ملاحظة: إجراء عملية جراحية باستخدام إجراءات مطهرة. جميع الأدوات الجراحية تحتاج إلى تعقيم إما عن طريق الالاستعباد التلقائي أو معقم حبة ساخنة.
    4. بعد تركيب الماوس على الجهاز المجسم، قم بتعقيم فروة الرأس بفرك قائم على اليود بالتناوب و70٪ إيثانول ثلاث مرات. إجراء شق في خط الوسط من فروة الرأس لفضح موقع الحقن.
    5. قطع فتح الجلد في محور bregma-lamda وخلق ثقب بور قطرها ~ 1 ملم مع حفر عالية السرعة في موقع الحقن المقصود من القشرة الحركية أو سوماتوسينسوري.
    6. استخدم حقنة هاملتون سعة 33 جراما تحتوي على فيروس مرتبط بال أدينو (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G المتجهات [1 ×10 11 GC] أو rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s المتجهات [1 × 1011 GC]) لحقن ما يصل إلى 1 ميكرولتر من الفيروس في المنطقة المستهدفة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لتوصيل الفيروس القشري، حقن محلول الفيروس في عمقين في خطوات متعددة. أولا، أدخل الإبرة إلى عمق 1 ملم من دورا والسماح 5 دقائق للدماغ لاسترداد. ثم، نقل الإبرة تصل إلى عمق ~ 700 ميكرومتر وحقن 500 nL من محلول الفيروس بسرعة حقن 10 nL/s باستخدام حقنة هاملتون التي تسيطر عليها وحدة تحكم مضخة microsyringe. بعد اكتمال الحقن، انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للفيروس بالانتشراء في الدماغ. ثم، نقل الإبرة تصل إلى موقع الحقن الثاني على عمق 300 ميكرومتر. هنا، حقن 500 nL إضافية من محلول الفيروس. انتظر لمدة 10 دقائق للسماح للفيروس بالانتشراء في الدماغ.
    7. أغلق فروة الرأس والجلد باستخدام لاصق الأنسجة. دع الفئران تتعافى على منصة التدفئة أرسل الفئران إلى منشأة الحيوانات بعد الشفاء.
  3. تثبيت نافذة الجمجمة وفي الجسم الحي اثنين فوتون (2-P) التصوير من الميتوكوندريا Ca2 + إشارات.
    ملاحظة: يتم زرع نافذة الجمجمة 3 أسابيع بعد حقن AAV على القشرة الحركية أو الحسية26،27،28،29. يتم حقن Carprofen (10 ملغ / كغ) تحت الجلد لتوفير الإغاثة من الألم المحتمل قبل الجراحة. العمليات الجراحية نافذة الجمجمة متطابقة مع العمليات الجراحية حقن AAV ويتم تنفيذها في ظل ظروف مطهرة.
    1. تخدير الماوس مع 3٪ isoflurane.
      ملاحظة: هذه هي الجرعة الأولية وتقليل إلى 2٪ لعملية جراحية في وقت لاحق. أثناء التصوير، يتم استخدام حقن داخل الصفاق (IP) من 130 ملغ الكيتامين / 10 ملغ xylazine / كجم وزن الجسم المذاب في ACSF للتخدير.
    2. ضع الماوس على جهاز الماوس المجسم وأصلح الرأس بقضبان الأذن. تطبيق مرهم العيون على العينين. استخدم وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر عند 37 درجة مئوية طوال الجراحة.
      ملاحظة: جميع الأدوات الجراحية تحتاج إلى تعقيم.
    3. إجراء شق من 5-8 ملم طويلة في خط الوسط من فروة الرأس وإزالة رفرف من الجلد باستخدام زوج من مقص.
    4. بعد تعرض الجمجمة، قم بإجراء عملية استئصال القحف بقطر 2.0-3.0 مم باستخدام مثقاب عالي السرعة فوق منطقة حقن الفيروس (أي قشرة المحرك أو قشرة سوماتوسينسوري، الشكل 1B). أولا، جعل أربعة ثقوب صغيرة، ومن ثم حفر على طول في دائرة تربط الثقوب. ثم ارفع العظم وأزله بمقص حاد وأزيله. يمكن إزالة ماطر دورا المكشوفة أو الاحتفاظ بها سليمة ل impantation من النافذة القحفية.
    5. ضع غطاء زجاجي قطره 3-5 مم يحمل سيليكون شفاف فوق فغر القحف. استخدام مسواك لدفع نافذة الجمجمة بلطف على سطح الدماغ. ثم ختم الحافة مع كمية صغيرة من لاصقة السيليكون.
      ملاحظات: بدلا من ذلك، بدلا من قرص السيليكون، يمكن استخدام 1.2٪ منخفضة نقطة انصهار هلام agarose بين الزجاج الغطاء وأنسجة الدماغ.
    6. وأخيرا، ختم حواف غطاء مع أسمنت الأسنان. الحرص على تطبيق الاسمنت قليلا على حافة النافذة القحفية لارتباط قوي. إرفاق لوحة رأس معدنية مصنوعة خصيصا إلى الجمجمة مع أسمنت الأسنان.
      ملاحظة: يتم استخدام لوحة معدنية لإصلاح رأس الماوس إلى مرحلة المجهر 2-P أثناء جلسة التصوير(الشكل 1C).
    7. أضف 0.5 مل من محلول ACSF على الغطاء على النافذة القحفية لغمر الماء أثناء التصوير.
    8. أداء الفاصل الزمني في تصوير فيفو 2-P من mito-GCaMP5G في الخلايا الفلكية وmito-GCaMP6s في الخلايا العصبية مع الطول الموجي 910 نانومتر من خلال نافذة الجمجمة (الشكل 1C)18,20,27.
      ملاحظة: أثناء التصوير، الفئران على لوحة التدفئة للحفاظ على درجة الحرارة الفسيولوجية. سيتم التضحية بالفئران فور الانتهاء من جلسة التصوير.
    9. تسمية الخلايا الفلكية في الجسم الحي مع سولفورهودامين 101 (SR101) عندما يكون من الضروري تحديد كولوكاليد.
      1. في نهاية الخطوة 3.3.4، ضعي 100 ميكرولتر من 100 ميكرومتر SR101 في ACSF على السطح القشري لمدة 1-5 دقائق.
      2. شطف السطح مع ACSF لغسل SR101 غير منضم. باستخدام التصوير 2-P، يمكن ملاحظة المشاركة في وضع العلامات من mito-GCaMP5G و SR101 في الخلايا الفلكية 45-60 دقيقة في وقت لاحق(الشكل 4A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان الهدف من هذه الدراسة لتوفير منهجية لتصوير الميتوكوندريا Ca2 + إشارات باستخدام GECIs في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي. يتم تقديم نتائج كل من المختبر وفي الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + التصوير هنا.

في المختبر الميتوكوندريا Ca2 + الإشارة في الخلايا الفلكية المستزرعة والخلايا العصبية
يمكن الحصول على الميتوكوندريا Ca...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، ونحن نقدم طريقة وبروتوكول لتصوير الميتوكوندريا Ca2 + إشارات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية. قمنا بتنفيذ استراتيجيات استهداف الميتوكوندريا ونوع الخلية الخاصة للتعبير عن GECI GCaMP5G/6s. لاستهداف GCaMP5G/6s في الميتوكوندريا، أدرجنا تسلسل استهداف الميتوكوندريا في البلازميدات. للتعبير عن GCaMP5G/6s في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في الجسم الحي، أدخلنا gfaABC1D المروج الخلايا الفلكية محددة والخلايا العصبية محددة المروج CaMKII في البلازميدات. يمكن تأكيد التعبير الخاص من نوع الخلية م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) منح R01NS069726 وR01NS094539 إلى SD. نشكر إيريكا ديمرس على التسجيل الصوتي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرهم الدموع الاصطناعيةالرجبيNDC-0536-6550-9183 ٪ الفازلين
الأبيض سيانواكريليت الغراءأدوات الدقة3M Vetbond لاصق
تشريح المجهر المجسمنيكونSMZ 2Bجراحة
دومون ملقط مع طرف ناعمأدوات العلومالدقيقة 11255-20غطاء زجاجي
جافية ، 0.13-0.17 مم سميكةفيشر Scientific12-542Aلغطاء نافذة الجمجمة
العلوم الدقيقةعالية السرعة معمثقاب تلميع العظام
حقنةحقن هاميلتون2.5 ملللحقن
الكيتامينVEDCONDC-50989-996-06100 مجم / كجم وزن الجسم
نقطة انصهار منخفضة الاغاروزسيجما ألدريتشA9793تقليل القطع الأثرية للحركة
إطار معدنيالطلبانظر الشكل 1لربط الدماغ بمرحلة المجهر
وحدة التحكم في مضخة الحقنةالدقيقة العالمية أدوات الدقةUMP3وحدة التحكم في سرعة الحقن
جهاز تجسيمي الماوسStoelting51725لعقد الفئران
غرفة الترويةWarner Instruments64-0284
نظام PersfusionALA Scientific InstrumentsALA-VM8
وسادة تسخين ذاتية التنظيمأدوات العلوم الدقيقة21061لمنع انخفاض حرارة الفئران
Sulforhodamine 101InvitrogenS-359صبغة فلورسنت حمراء لتسمية الخلايا النجمية
مقص جراحي ، 12 سمأدوات العلوم الدقيقة14002-12للتشريح
أدوات العلوم الدقيقة Trephine18004-23لإزالة المواد
XylazineVEDCONDC-50989-234-1110 مجم / كجم من وزن الجسم
العالم لإزالة زلات عالية السرعة أدوات الفيروسي حسب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
  2. Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
  3. Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
  4. Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
  5. Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
  6. Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
  7. Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034(2013).
  8. Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321(2021).
  9. Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
  10. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  11. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: The calcium connection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  12. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  13. Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18(2011).
  14. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  17. Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
  18. Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
  19. Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
  20. Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
  21. Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
  22. Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
  23. Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416(2016).
  24. Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
  25. Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
  26. Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
  27. Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
  28. Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
  29. Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
  30. Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
  31. Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GCaMP5G GCaMP6s

مقالات ذات صلة