يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكشف عن G البروتين إلى جانب مستقبلات التعبير في الخلايا العصبية Vagal الماوس Afferent باستخدام Multix في الموقع التهجين

3.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62945

⸱

سبتمبر 20, 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

في هذه المقالة

ملخص

تم استخدام Multix في التهجين الموقعي (ISH) لتصور النصوص في وقت واحد لمستقبلين مقترنين بالبروتين G وعامل نسخ واحد في مجمع العقدة المبهم بأكمله من الماوس البالغ. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد خرائط دقيقة من ملامح النسخ من الخلايا العصبية المبهمة afferent.

الملخص

تصف هذه الدراسة بروتوكولا للتهجين المتعدد في الموقع (ISH) للجانجليا الوداجية العقيدة الماوسية ، مع التركيز بشكل خاص على الكشف عن التعبير عن مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs). تمت معالجة العقدة الوداجية العقيدات الثابتة بالفورمالين باستخدام تقنية RNAscope للكشف في وقت واحد عن تعبير اثنين من GPCRs التمثيلية (مستقبلات cholecystokinin و ghrelin) بالاشتراك مع جين علامة واحد إما من العقيدات (علبة منزل تشبه الزوج 2b ، Phox2b) أو الخلايا العصبية الأفرنت الوداجية (بروتين إصبع الزنك في مجال PR 12 ، Prdm12). تم تصوير العقدة المسماة باستخدام المجهر confocal لتحديد أنماط التوزيع والتعبير من النصوص المذكورة أعلاه. لفترة وجيزة، تم العثور على الخلايا العصبية Phox2b afferent للتعبير بوفرة مستقبلات cholecystokinin (Cck1r) ولكن ليس مستقبلات غريلين (غسر). تم العثور على مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية Prdm12 afferent أيضا للتعبير عن Ghsr و / أو Cck1r. تتم مناقشة المحاذير التقنية المحتملة في تصميم ومعالجة وتفسير ISH متعددة. النهج الموصوف في هذه المقالة قد يساعد العلماء في توليد خرائط دقيقة للملامح النسخية من الخلايا العصبية المبهمة.

المقدمة

وترد جثث الخلايا من afferents المبهم في الوداجي، بتروسال، وggallia نودوز1،2،3. محاورهم السفر معا عبر عدة فروع من العصب المبهم إلى القحف والصدر والبطن الأراضي4،5،6،7. من النهايات الحشوية ، يمكن أن تستجيب الطحالب لمجموعة واسعة من المحفزات الفسيولوجية والمضرة8و9و10. ومع ذلك، فإن توزيع جزيئات الإشارات والمستقبلات المشاركة في الاستشعار عن المبهم لا يزال غير مميز. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن العقدة المبهمة ، على الرغم من صغر حجمها ، تعبر عن طيف واسع من المستقبلات ، بما في ذلك عدد كبير من GPCRs8،11،12،13. وعلاوة على ذلك، الخلايا العصبية المبهمة غير متجانسة بطبيعتها وعرض ملامح الجزيئية متميزة14. ولتعقيد الأمر، يتم إرفاق العقدة الوداجية والتروسالية والعقيدة في الماوس، وبالتالي تشكيل كتلة واحدة من العقد. وأخيرا ، في مجموعة فرعية من الحيوانات ، يتم إرفاق العقدة العقيدية إلى العقدة العنقية المتفوقة المتعاطفة15.

في الماضي، تحولت المحققين إلى الكيمياء المناعية لدراسة الماكياج الكيميائي العصبي من الخلايا العصبية المبهمة16،17،18. في حين أن الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة المعتمدة مفيدة ، يجب تفسير نتائج الدراسات الكيميائية المناعية بحذر. على سبيل المثال، فشلت العديد من الجهود لتحديد أجسام مضادة محددة ضد GPCRs19و20و21و22و23و24و25، مما دفع المحققين إلى استنتاج أن غالبية الأجسام المضادة ضد GPCRs لا يمكن الاعتماد عليها. للتحايل على هذه القضايا، وقد استخدمت على نطاق واسع PCR الكمية (qPCR) لتقييم التعبير الجيني في كتلة العصابات المبهم القوارض26،27،28،29. ومع ذلك، فإن فحص التعبير الجيني باستخدام qPCR يحدث على حساب فقدان المعلومات المكانية. ولا يمكن التنبؤ على وجه الخصوص بعدد الخلايا أو نوع الخلية (أنواعها) التي تعبر عن جين معين مهم (مثل الخلايا العقدية مقابل الخلايا الوداجية). وتشمل القضايا المتكررة أيضا التلوث مع الأنسجة المجاورة وإدراج أطوال متغيرة من العصب المبهم، عنق الرحم متفوقة، والغانجيليا الوداجية أثناء تشريح15. نتيجة للصعوبات المذكورة أعلاه، الجدل يحيط التعبير وتوزيع العديد من GPCRs في الخلايا العصبية المبهمة. أحد الأمثلة المحيرة بشكل خاص يتعلق بمستقبلات غريلين (Ghsr). في حين وجدت بعض الدراسات على نطاق واسع التعبير عن هذا المستقبل في الخلايا العصبية المبهمة30,31,32, وجدت دراسات أخرى أن GHSR مرنا أن تكون غير قابلة للكشف تقريبا في العقدة العقيدات11,14. ولذلك هناك ما يبرر رسم خرائط مفصلة ل Ghsr mRNA في الكتلة الغنغليونية المبهمة.

في الموقع التهجين (ISH) كما تم استخدامها لتقييم أنماط التعبير الجيني في كتلة ganglionic المبهم7،11،12،33،34،35. لأن التقنيات القائمة على الحمض النووي الريبي لا تزال أكثر موثوقية ومحددة من التقنيات القائمة على الأجسام المضادة في معظم الظروف36،37، أثبتت دراسات ISH قيمة لفهم أفضل للترميز الكيميائي العصبي للخلايا العصبية المبهمة. ومع ذلك، فإن تقنيات ISH التقليدية نفسها لا تخلو من المحاذير. المشعة ISH حساسة ولكن يولد الخلفية ويبقىمرهقة 38. ISH غير المشعة أقل تعقيدا ولكن أيضا أقلحساسية 38. في المقابل، فإن طريقة RNAscope ISH المطورة مؤخرا حساسة للغاية وتولد الحد الأدنى من الخلفية39. الدراسة الحالية تطبيق متعدد الفلورسنت RNAscope للكشف عن GPCRs في الخلايا العصبية المبهمة من الماوس. ركزنا على رسم خرائط لتوزيع Ghsr وقارنا توزيعه بمستقبلات المرارة (Cck1r) ، وهو GPCR آخر معروف جيدا ليتم التعبير عنه في العقدة العقيدية34. وأخيرا، تم استخدام اثنين من عوامل النسخ، وقران مثل homeobox 2b (Phox2b) وبروتين إصبع الزنك المجال العلاقات العامة 12 (Prdm12)، كعلامات انتقائية للخلايا العصبية العقيدة والوداجي afferent، على التوالي14. دون تصور Phox2b أو Prdm12 ، سيكون من الصعب تحديد الوداجي مقابل العقيدات مع اليقين. كما تناقش المزالق التقنية المحتملة في جميع أنحاء المقال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: الفئران المستخدمة في هذه الدراسة كانت من النوع البري الذكور على خلفية C57BL/6J نقية. تم استخدام ما مجموعه 4 فئران لISH متعددة. وكان عمر جميع الفئران حوالي 8 أسابيع في وقت التضحية. كما استخدم فأر ذكر واحد (يبلغ من العمر عاما واحدا تقريبا) لإثبات الفلوروجيني المرتبط بالشيخوخة. تم إيواء الحيوانات في أقفاص التهوية داخل منشأة حاجز مع إمكانية الحصول على الغذاء والماء. استعرضت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في المركز الطبي لجنوب غرب الولايات المتحدة الإجراءات الموضحة أدناه ووافقت عليها. يمكن العثور على تفاصيل حول الكواشف والأدوات في جدول المواد.

1. جمع العينات

  1. في يوم التضحية ، قم بإعطاء جرعة زائدة من هيدرات الكلورال (500 ملغ / كجم ، أي p.) للفئران. Perfuse الفئران تخدير عميق عبر القلب باستخدام مضخة معج مع 5 مل من المالحة 1x الفوسفات العازلة (PBS) تليها 50 مل من 10٪ الفورمالين في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم ذلك في غطاء الدخان لمنع استنشاق الفورمالين.
  2. كما يتم تنصهر نودوز، بتروسال، والغنغلية الوداجية لتشكيل كتلة ganglionic واحد في الماوس15،وجمع بعناية كتلة ganglionic المبهم كامل من كل جانب (اليسار واليمين) مع مساعدة من نطاق تشريح ومقص الربيع غرامة والملقط (انظر جدول المواد).
  3. عند قطع رأس الماوس مع زوج من مقص كبير (انظر جدول المواد)،وتجنب سحق جذع الدماغ.
  4. بعد نهج تشريح وصفها من قبل في الفئران40، وإزالة العضلات sternohyoid وomohyoid الجانبية إلى القصبة الهوائية مع ملقط صغير (جدول المواد) لفضح العظام القذالي. مسح المنطقة بأكملها من العضلات والأنسجة الدهنية، والأنسجة الملتحمة حتى الشريان السباتي، العصب المبهم، العصب تحت القباني، وماغنوم foramen مرئية. قطع العصب تحت القباني كامل مع مقص الربيع الصغيرة (جدول المواد).
  5. ابحث عن العقدة العقيدة ككتلة شفافة قريبة من ماغنوم foramen15. باستخدام مقص صغير (جدول المواد)، كسر بعناية العظام القذالية لمزيد من فضح العقدة الوداجية. ابحث عن الخلايا الصباغية السوداء على سطح الوداجي كمعلم مرئي.
  6. قطع المرفقات العصبية بين كتلة ganglionic المبهم واستخراج الكتلة العقدية كله عن طريق سحب بلطف على الطرف المحيطي من العصب المبهم في حين قطع في وقت واحد العقدة الوداجي نحو جذع الدماغ مع مقص الربيع الصغيرة(جدول المواد).
  7. إزالة الأنسجة الملتحمة والدهون الشائكة إلى العصب المبهم والكتلة العقدية قدر الإمكان.
  8. كما أنه من السهل أن تفقد العقدة واحدة أثناء نقل من أنبوب واحد إلى آخر، والحفاظ على ~ 0.5 سم من العصب المبهم لتسهيل التعامل مع وتوطين العينات.
  9. وضع ganglia بمساعدة ملقط غرامة في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل واحتضان في 4 درجة مئوية في الفورمالين لمدة 24 ساعة ومع 30٪ السكروز لمدة 24 ساعة أخرى.
  10. وضع ganglia داخل قطرة صغيرة (~ 4 ملم Ø) من درجة الحرارة خفض الأمثل (أكتوبر) المتوسطة على قطعة من رقائق الألومنيوم. بعد ذلك، تجميد العينة على سرير من الجليد الجاف.
  11. قطع العينات مع cryostat في -20 درجة مئوية إلى أقسام من سمك 14 ميكرومتر وجمع على الشرائح المجهر الزجاجي كما 3 سلسلة 42 ميكرومتر عن بعضها البعض.
    ملاحظة: تجنب وضع مقاطع قريبة من حواف الشريحة. لحفظ الكواشف، حافظ على أقسام الأنسجة معبأة بإحكام قدر الإمكان ولكن دون تداخل.
  12. تخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية حتى الحاجة لISH لمدة 6 أشهر على الأقل.
    ملاحظة: راجع الشكل 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للفلورة الذاتية.

2. المعالجة المسبقة وISH

  1. قبل يوم التجارب، والأواني الزجاجية مختبر الأوتوكلاف لاستخدامها لISH، بما في ذلك تلطيخ الأطباق وجرار العازلة الغسيل.
    ملاحظة: أثناء العمل في ظل ظروف خالية من RNase ليست حرجة، وارتداء قفازات في جميع الأوقات. الحفاظ على زجاجات محلول إزالة التلوث RNase(جدول المواد)في متناول اليد في حالة الاشتباه في التلوث.
  2. في اليوم الأول، جلب الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء مخصصة خصيصا لISH. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1x وخبز لهم لمدة 30 دقيقة في 60 درجة مئوية في فرن الخبز (جدول المواد).
  3. بعد إصلاح الشرائح في 4٪ الفورماتين لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  4. جلب الكواشف في عدة multix(جدول المواد)إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. يجفف الشرائح في 50٪، 70٪، و 100٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما. تطبيق H2O2 حل للعينات لمدة 10 دقيقة ثم شطف في الماء المقطر المزدوج (ddH2O).
  6. علاج العينات مع كاشف استرجاع الهدف لمدة 5 دقائق، وشطف في ddH2O تليها الإيثانول 100٪، والهواء الجاف. باستخدام قلم مسعور، قم بإنشاء حاجز حول العينات.
    ملاحظة: لا تقم بتطبيق الحاجز الكاره للماء بالقرب من أقسام الأنسجة.
  7. تطبيق بروتياز لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية في فرن التهجين(جدول المواد).
  8. في غضون ذلك، قبل الحرب المسابير في 40 درجة مئوية وتبريدها في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. احتضان الشرائح مع المزيج المطلوب من المسابير المستهدفة (Cck1r-C3، Ghsr-C1، Phox2b-C2؛ أو Cck1r-C3، Ghsr-C1، Prdm12-C2) لمدة 2 ساعة في 40 درجة مئوية في فرن التهجين.
  9. احتضان أنسجة التحكم السلبية مع اختزال ثنائي هيدروبيكولينات (DapB) الهدف C1 التحقيق لمدة 2 ساعة في 40 درجة مئوية في فرن التهجين.
  10. شطف الشرائح في عازلة غسل وتخزينها بين عشية وضحاها في سيترات الصوديوم المالحة 5x (SSC) في درجة حرارة الغرفة. للراحة، تقسيم التجربة إلى يومين. في اليوم التالي، شطف الشرائح مع غسل العازلة واحتضان لهم مع الكواشف تضخيم المذكورة أدناه (انظر دليل المستخدم في جدول المواد).
  11. تطبيق AMP1 (30 دقيقة في 40 درجة مئوية)، AMP2 (30 دقيقة في 40 درجة مئوية)، و AMP 3 (15 دقيقة في 40 درجة مئوية). شطف في عازلة غسل بين كل خطوة.
  12. حل كل صبغة أوبال(جدول المواد)في ثنائي ميثيل سلفوإكسيد وتخزين الحلول في 4 درجة مئوية حتى الحاجة.
  13. للقناة 1، احتضان الشرائح مع HRP-C1 (15 دقيقة في 40 درجة مئوية) وأوبال 520 (اللون الأخضر؛ تخفيف 1/1500؛ 30 دقيقة في 40 درجة مئوية). شطف في عازلة غسل بين كل خطوة.
  14. للقناة 2، احتضان الشرائح مع HRP-C2 (15 دقيقة في 40 درجة مئوية) وأوبال 570 (اللون الأصفر؛ تخفيف 1/1،500؛ لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية). شطف في عازلة غسل بين كل خطوة.
  15. للقناة 3، احتضان الشرائح مع HRP-C3 (15 دقيقة في 40 درجة مئوية) وأوبال 690 (اللون الأحمر بكثير؛ تخفيف 1/1،500؛ لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية). شطف في عازلة غسل بين كل خطوة.
  16. غسل الشرائح وتعريضها ل4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 30 ق.
  17. تطبيق على الفور تصاعد المتوسطة على كل شريحة ووضع غطاء فوق قسم الأنسجة.
  18. حافظ على الأنسجة أفقية في حامل الشريحة عند 4 درجات مئوية حتى التصوير.

3. التحليل المجهري وتحليل البيانات

ملاحظة: يمكن تصوير بيانات Multix ISH مع مجموعة واسعة من الأدوات مع عوامل التصفية المناسبة. ومع ذلك، فإن طريقة التصوير المفضلة هي المجهر البؤري مع أهداف 20x و 63x (النفط). راجع المناقشة للأسباب. راجع الشكل 2 لتحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى.

  1. استخدم مجهرا كونفوجكال مجهزا بخطوط ليزر 488 و561 و633 نانومتر. استخدام معلمات الامتلاك التالية (انظر الجدول 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, نطاق الكشف 668-696 نانومتر, الطاقة 2.0, كسب 724); أوبال 570 (DPSS الليزر 561 نانومتر، نطاق الكشف 579-627 نانومتر، <قوة 15.0،
  2. لتحسين جودة الصور، احصل على خط متوسط 4 وحجم بكسل لا يقل عن 1024 × 1024.
    ملاحظة: يتم توفير المعلمات أعلاه كمثال فقط، ويوصى بالتعديلات اعتمادا على أداة واحدة، والتكبير (20x أو 63x)، ومستويات التعبير، ومستويات الإضاءة الذاتية لأي نسيج معين.
  3. بمجرد الرضا عن معلمات الاستحواذ ، اجمع الصور باستخدام نفس الإعدادات. سمة الألوان الزائفة إلى كل قناة لتسهيل التصور.
    ملاحظة: على سبيل المثال، أحمر (Phox2b أو Prdm12) ، سماوي (Cck1r) ، الأصفر (Ghsr) والرمادي (DAPI).
  4. قم بإجراء عد الخلايا باستخدام الصور الرقمية من خلال تحديد المخطط التفصيلي لملامح إيجابية ل RNAscope مع نواة واحدة ملطخة بخفة مع DAPI. حساب النسبة المئوية لملامح إيجابية RNAscope التعبير عن كل نسخة [الشكل 3A-C].
  5. لتحسين صرامة ودقة التقديرات، عد ما لا يقل عن 2000 ملامح الخلايا العصبية من ما لا يقل عن 4 مختلفة. إجراء العد من الجانجليا اليسار واليمين بشكل منفصل.
  6. إدخال البيانات في مخطط دائري مع العدد الإجمالي للملفات الجانبية التي تم عدها.
  7. استخدام برامج التصوير للحصول على الصور وغرزة معا 20x الصور. استخدام ImageJ فيجي وآخر الصور وتصميم البرمجيات لتوليد لوحات النهائي. تطبيق تعديلات على التباين والخفة بشكل موحد على جميع الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في حين يمكن تطبيق RNAScope على الحيوانات من أي عمر أو جنس أو خلفية وراثية ، فمن المستحسن العمل مع الشباب (<3 أشهر). وذلك لأن التحف الفلورية (على سبيل المثال، ليبوفوسين) هي النتائج الشائعة في الخلايا العصبية من الحيوانات القديمة41. غالبا ما تحتوي العقدة المثبتة بالفورماتين من الفئران القديمة على مضان داخلي مكثف بشكل مدهش يمكن أن يخطئ بسهولة في تلطيخ حقيقي(الشكل 1A، B). على أي حال ، من المستحسن التحقق من مستويات الفلورة الذاتية في الأنسجة قبل المعالج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

اخترعت التقنية من ISH في أواخر 1960s42. ومع ذلك، فإنه ليس حتى منتصف 1980s أنه تم تطبيقه للكشف عن mRNAs في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي43،44. وبالنظر إلى عدم تجانس الجهاز العصبي والقضايا المتكررة مع الأجسام المضادة، وتوطين نسخة معينة على المستوى الخلوي لا يزال أداة لا تقدر بثمن. ومع ذلك، ظلت أساليب ISH التقليدية شاقة وحساسة بشكل متفاوت. لحسن الحظ، استخدمت هذه الدراسة إجراء ISH حساسة للغاية تسمى RNAscope، والتي عادة ما يولد أي خلفية ويسمح ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من قبل التشريح العصبي / الأنسجة / الدماغ حقن الأساسية الممولة من منحة المعاهد القومية للصحة #5P01DK119130-02. الكتاب يود أن يعترف بمساعدة UT جنوب غرب مرفق تصوير الخلايا الحية (برئاسة الدكتور فيلبس) وموظفيها (Abhijit بوغدي ومارسيل Mettlen) ، بدعم جزئي من منحة NIH #1S10OD021684-01 ، وهو مورد مشترك لمركز هارولد سيمونز للسرطان ، بدعم جزئي من منحة دعم مركز السرطان NCI ، P30 CA142543.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x PBSفيشر العلميBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
& deg ؛ فريزر CPHCBIMDF-DU901VHA-PA
أدوبي فوتوشوب 2021برنامج أدوبيللصور والتصميم
فرن الخبزنموذج علمي حراري: 658
مجهر متحد البؤرZeissLSM880 Airyscan
غطاءزجاجي مختبرات أبحاث الدماغ2460-1.5D
CryostatLeicaCM 3050 إس
دومون # 5 ملقطFST11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lتصاعد متوسط فرن
تهجينHybEZ
قلم كاره للماءمختبرات ناقلاتH-4000
ImageJ-FijiNIH
مقص كبيرهنري شين100-7561
أنابيب الطرد المركزي الدقيقةVWR20170-333
مضخة صغيرة متغير التدفقفيشر Scientific13-876-1
أوبال 520أكويا للعلوم البيولوجيةFP1 1487001KTالمؤشر الحيوي الفلوري
أوبال 570أكويا للعلوم الحيويةFP1 1488001KTالمؤشر الحيوي الفلوري
أوبال 690أكويا للعلوم البيولوجيةFP1 1497001KTالمؤشر الحيوي الفلوري
ProLong Gold وسيط تركيب مضاد للتلاشيللخلايا المسمى بالفلورسنت
RNAscope Multiplex Fluorescent Kit v2ACD / Bio-Techne323100مجموعة تعدد الإرسال
RNAscope مسبار الماوس Cck1r-C3ACD / Bio-Techne313751-C3
RNAscope مسبار ماوس DapBACD / Bio-Techne310043
RNAscope مسبار Mouse GhsrACD / Bio-Techne426141
RNAscope مسبار الماوس Phox2b-C2ACD / Bio-Techne407861-C2
RNAscope مسبار الماوس Prdm12-C2ACD / Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020محلول تطهير Rnase
مقص تشريح صغيرMillipore SigmaZ265977
Superfrost Plus شرائحFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
دليل المستخدمACD323100 USM
Vannas Spring ScissorsRobozRS 5620
ZEN ImagingSoftware Zeiss
فرن

المراجع

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344(2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985(2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986(2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415(2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022(2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RNAscope Phox2b
الكشف عن G البروتين إلى جانب مستقبلات التعبير في الخلايا العصبية Vagal الماوس Afferent باستخدام Multix في الموقع التهجين
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.