Method Article

النهج الجيني العكسي لتحديد منظمات التصبغ باستخدام الزرد

DOI:

10.3791/62955

⸱

March 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research, 3Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحكم منظمو وظائف الخلايا الصباغية الاختلافات المرئية في نتيجة التصبغ. يشكل فك رموز الوظيفة الجزيئية لجين التصبغ المرشح تحديا. هنا ، نوضح استخدام نظام نموذج الزرد لتحديد المرشحين وتصنيفهم إلى منظمات لمحتوى الميلانين وعدد الخلايا الصباغية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الصباغية هي خلايا متخصصة مشتقة من القمة العصبية موجودة في جلد البشرة. تقوم هذه الخلايا بتوليف صبغة الميلانين التي تحمي الجينوم من الأشعة فوق البنفسجية الضارة. تؤدي الاضطرابات في عمل الخلايا الصباغية إلى اضطرابات صباغية مثل piebaldism والمهق والبهاق والكلف وسرطان الجلد. الزرد هو نظام نموذجي ممتاز لفهم وظائف الخلايا الصباغية. إن وجود الخلايا الصباغية المصطبغة الواضحة ، وسهولة التلاعب الجيني ، وتوافر خطوط الفلورسنت المعدلة وراثيا يسهل دراسة التصبغ. تستخدم هذه الدراسة استخدام خطوط الزرد من النوع البري والمعدل وراثيا التي تدفع تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت مروجي mitfa و tyrp1 التي تميز مراحل مختلفة من الخلايا الصباغية.

يتم تحقيق إسكات الجينات المرشحة على أساس المورفولينو لتقييم نتيجة النمط الظاهري على تصبغ اليرقات وينطبق على فحص منظمات التصبغ. يوضح هذا البروتوكول الطريقة من الحقن المجهري إلى التصوير والتشريح القائم على فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للأنماط الظاهرية باستخدام جينين مرشحين ، الأنهيدراز الكربوني 14 (Ca14) ومتغير هيستون (H2afv) ، لتقييم شامل لنتائج التصبغ. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول فصل الجينات المرشحة إلى محددات الخلايا الصباغية والمتمايزة التي تغير بشكل انتقائي أعداد الخلايا الصباغية ومحتوى الميلانين لكل خلية ، على التوالي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن استخدام الميلانين للحماية من الضوء قد تطور عدة مرات في جميع أنحاء المملكة الحيوانية ، يبدو أن الفقاريات قد أتقنت العملية. يتم حفظ الخلايا المخصصة المنتجة للصبغة مع آلية متقنة لتجميع واحتواء الميلانين من الأسماك إلى البشر1. ومع ذلك ، فإن نتيجة التصبغ متنوعة بشكل كبير ، تتراوح في اللون إلى الارتداد وتظهر كأنماط حية على التكامل والجلد والشعر2. على الرغم من التنوع ، يتم الحفاظ على ذخيرة الجينات المشاركة في استجابة التصبغ بشكل لافت للنظر. تظل المكونات الأساسية لآلية تخليق الميلانين ، مثل إنزيمات تخليق الميلانين الرئيسية ، ومكونات الميلانوزومات ، والاتصال المنبع بمسار الإشارات ، متطابقة بشكل أساسي عبر الكائنات الحية. تؤدي الاختلافات الجينية الدقيقة إلى تغييرات جذرية في أنماط التصبغ التي لوحظت عبر الأنواع3. ومن ثم ، فإن النهج الجيني العكسي في كائن فقاري أدنى ، الزرد (Danio rerio) ، يوفر فرصة ممتازة لفك تشفير مشاركة الجينات في تقديم الحالة المصطبغة4.

تتطور أجنة الزرد من زيجوت مخصب وحيد الخلية إلى يرقة في غضون ~ 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) 5. ومن اللافت للنظر أن الخلايا المكافئة للخلايا الصباغية - الميلانوفور - هي خلايا كبيرة موجودة في الأدمة وتكون واضحة بسبب محتوى الميلانين الداكن6. تنبعث هذه الخلايا المشتقة من القمة العصبية ~ 11 hpf وتبدأ في الصباغ ~ 24 hpf 6,7. مكنت وحدات التعبير الجيني المحفوظة من تحديد العوامل الرئيسية التي تنظم وظائف الخلايا الصباغية وأدت إلى تطوير خطوط مراسل الفلورسنت المعدلة وراثيا Tg (sox10: GFP) و Tg (mitfa: GFP) و Tg (ftyrp1: GFP) 8،9،10 التي تسمي المراحل الانتقائية لتطور الخلايا الصباغية. يتيح استخدام خطوط الأسماك المعدلة وراثيا هذه استجواب بيولوجيا الخلية للخلايا الصباغية على المستوى العضوي في سياق الأنسجة مع الإشارات المناسبة وفقا للجداول الزمنية التنموية. يكمل هؤلاء المراسلون القياس الكمي القائم على الصباغ للخلايا الصباغية ويمكنون من إجراء تقييم متميز لأعداد الخلايا الصباغية بغض النظر عن محتوى الميلانين.

توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لفك رموز بيولوجيا الخلايا الصباغية من خلال تقييم معلمتين مهمتين ، وهما محتوى الميلانين وأرقام الخلايا الصباغية. في حين أن الأول هو قراءة وظيفية شائعة تنبع من استجابة نقص التصبغ ، فإن الأخير يرتبط بانخفاض في مواصفات الخلايا الصباغية أو بقائها وغالبا ما يرتبط بظروف إزالة التصبغ الوراثية أو المكتسبة. تتمثل الإستراتيجية العامة لهذا الفحص الجيني العكسي في إسكات جينات مختارة باستخدام مورفولينو والتحقيق في النتائج الخاصة بالخلايا الصباغية. يتم تحليل محتوى الميلانين باستخدام القياس الكمي القائم على الصور لمتوسط القيم الرمادية متبوعا بتأكيد باستخدام مقايسة محتوى الميلانين. يتم تحليل عدد الخلايا الصباغية في مراحل مختلفة من النضج باستخدام القياس الكمي القائم على الصور وتأكيده باستخدام تحليل FACS. هنا ، يتم عرض بروتوكول الفحص باستخدام جينين مرشحين ، وهما الأنهيدراز الكربوني 14 ، المتورط في تكوين الميلانين ، ومتغير هيستون H2AFZ.2 المتورط في مواصفات الخلايا الصباغية من سلائف القمة العصبية. في حين أن الأول يغير محتوى الميلانين وليس أعداد الخلايا الصباغية ، فإن الأخير يغير عدد الخلايا الصباغية المحددة ، وبالتالي محتوى الميلانين في الجنين. إجمالا ، توفر هذه الطريقة بروتوكولا مفصلا لتحديد دور الجين المرشح في التصبغ وتمييز دوره في التحكم في أعداد الخلايا الصباغية مقابل محتوى الميلانين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء تجارب الزرد بما يتفق بدقة مع الموافقة المؤسسية لأخلاقيات الحيوان (IAEC) من CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB) ، الهند (الاقتراح رقم 45 أ). بذلت كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات.

1. حقن المورفولينو في أجنة الزرد

  1. باستخدام مجتذب إبرة قياسي ، ارسم ماصات حادة جدا ومغلقة الرأس.
  2. قم بتحميل المحلول الذي يحتوي على مورفولينو في الماصات الدقيقة باستخدام طرف محمل دقيق وأدخله في جهاز الحاقن الدقيق. أحكم ربط المسمار بشكل صحيح لقفل الماصة الدقيقة.
    ملاحظة: توحيد جرعة المورفولينوس ضروري. الجرعة المناسبة لديها معدل البقاء على قيد الحياة من >70 ٪ والنمط الظاهري المحدد في 24 hpf.
  3. قطع طرف micropipette باستخدام ملقط دقيق ومعايرته11.
  4. للمعايرة ، قم بحقن حجم واحد من محلول المورفولينو في الأنبوب الشعري من الماصة الدقيقة ، مع الحفاظ على وقت الحقن عند 1 ثانية. كرر هذا خمس مرات. باستخدام المعيار ، 1 مم = 30 نانولتر الحجم ، أوجد الحجم المحقون في 5 ثوان عن طريق إبقاء الأنبوب الشعري مقابل مقياس قياس. باستخدام المعلومات الواردة أعلاه ، احسب الوقت (بالثواني) المطلوب لحقن 1-3 نانولتر لكل حقنة12.
    ملاحظة: المعيار ، 1 مم = 30 نانولتر ، خاص بإعدادات ضغط الحاقن الدقيق وقطر الشعيرات الدموية المستخدمة للمعايرة. من الناحية المثالية ، يجب أن يتم الحقن في واجهة خلية صفار البيض ، والتي تتشكل في غضون 15-20 دقيقة بعد الإخصاب. لتسهيل الحقن المتعددة ، يمكن أن يتأخر النمو قليلا عن طريق الحفاظ على الأجنة عند درجة حرارة منخفضة (18 درجة مئوية). ومع ذلك ، يجب أن يبقى هذا عند الحد الأدنى ولا يمتد إلى ما بعد 30 دقيقة بسبب التأثير المركب لانخفاض درجة الحرارة على تغيرات التعبير الجيني.
  5. قم بتركيب الأجنة على طبق بتري مصبوب من الأغاروز (60 مم). كومة الأجنة بإحكام داخل التلال. باستخدام ماصات زجاجية مصقولة بالنار ، قم بمحاذاتها في الاتجاه الصحيح للحقن.
  6. تحت المجهر ، استخدم المتلاعبين لتقريب الماصة الدقيقة من الجنين وحقنها داخل واجهة خلية الصفار عن طريق الضغط على مفتاح القدم.
  7. حقن جميع الأجنة بالمثل. اجمعها في طبق بتري يحتوي على وسط مائي للجنين الطازج واحتضانها عند 28 درجة مئوية.
  8. تحقق من الأجنة المحقونة بعد 6-8 ساعات. قم بإزالة جميع الأجنة الميتة التي يمكن التعرف عليها بسبب عتامتها العالية واستمر في تغيير ماء الجنين مرة واحدة على الأقل يوميا لتجنب العدوى.

2. تحليل التصبغ

  1. التحضير لحساب الميلانوفورات الجانبية في خط الوسط في 3 أجنة من الزرد dpf
    1. علاج الأجنة بمخدر عصبي عضلي 0.016٪ لشل حركتها.
    2. لتركيب الأجنة للتصوير ، أضف بضعة ملليلتر من 1.5-2 ٪ ميثيل سلولوز في طبق بتري (60 مم) بحيث يشكل طبقة رقيقة. باستخدام ماصة باستور ، اختر الأجنة وضعها برفق في ميثيل سلولوز لتقييد المزيد من الحركة أثناء التصوير.
    3. اضبط موضعها للحصول على التصوير الجانبي الأمثل (الشريط الظهري ، الشريط البطني ، شريط صفار البيض ، وميلانوفورس منتصف الخط) أو التصوير الظهري (الميلانوفورات على الجزء الظهري من الرأس). للحصول على دقة أفضل للميلانوفور المجاور ، الصورة بتكبير أعلى (>5x)
  2. تصوير برايتفيلد
    ملاحظة: يتم إجراء تصوير برايتفيلد باستخدام مجهر مجسم بتكبير 8-10x.
    1. ضع طبق بتري الذي يحتوي على أجنة الزرد تحت المجهر. باستخدام مناور ، اضبط الأسماك في هذا الاتجاه بحيث تكون جميع الخطوط الجنينية الخمسة للخلايا الصباغية مرئية (ظهرية ، بطنية ، جانبيتان ، صفار) في وقت واحد (الشكل 1C). التقط الصور بسرعة باستخدام برنامج الاستحواذ. في حالة استعادة الحيوان للحركة قبل تصويره ، أعد غمره في مخدر واستمر في التصوير بمجرد تجميده بشكل كاف.
    2. كرر هذا مع جميع الأسماك وتأكد من أن التكبير يظل كما هو لكل صورة.
  3. حساب متوسط القيمة الرمادية باستخدام برنامج ImageJ
    1. التقط صورا ظهرية وجانبية ل 2 أجنة من الزرد dpf.
    2. افتح الصورة المراد قياسها كميا في ImageJ باستخدام أداة فتح . استخدم أداة الشكل الحر لتخطيط المساحة المراد تحليلها. انتقل إلى خيار تعيين القياسات وحدد منطقة متوسط القيمة الرمادية |. اضغط على M (أو تحليل | Measure) لحساب متوسط القيمة الرمادية للمنطقة المحددة.
    3. مع الحفاظ على المنطقة المراد تحليلها ثابتة ، احسب متوسط المنطقة الرمادية لكل على حدة.
    4. ارسم رسما بيانيا شريطيا بالبيانات المكتسبة (الشكل 2F).
  4. فحص محتوى الميلانين
    1. في 2 dpf ، استخدم ماصة باستور الزجاجية لجمع ~ 25 أجنة الزرد.
    2. قم بإجراء إزالة الشوائب يدويا باستخدام إبر الأنسولين سعة 1 مل وأضفها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
    3. تخلص من وسط الجنين بعناية وأضف 1 مل من محلول التحلل المثلج البارد (20 مللي متر فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 6.8) ، 1٪ Triton X-100 ، 1 mM PMSF ، 1 mM EDTA) مع كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني وإعداد محللات البروتين عن طريق صوتنة.
    4. قم بإذابة المحللات في 1 مل من 1 N NaOH واحتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة في حمام مائي. دوامة ذلك بشكل متقطع لتجانس المحللة تماما.
    5. خذ قراءات امتصاص العينات عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    6. احسب محتوى الميلانين من خلال مقارنة امتصاص العينة بمنحنى قياسي للتركيزات المعروفة للميلانين الصناعي (الشكل 2G).

3. عدد الميلانوفور

ملاحظة: يمكن إجراء تحليل مضان في أجنة الزرد المعدلة وراثيا بطريقتين: 1) عد الخلايا الإيجابية ل GFP. 2) قياس شدة التألق.

  1. التحضير للعد القائم على FACS للخلايا الإيجابية GFP في أجنة الزرد المبكرة
    1. اجمع 200-250 ftyrp: أجنة GFP واغسلها في مصفاة باستخدام ماء الجنين العادي. كعنصر تحكم سلبي ، قم بمعالجة أجنة GFP السلبية والمطابقة للمرحلة من النوع البري (Assam Wildtype)12.
    2. بناء على مرحلة الاهتمام ، انقل الأجنة إلى طبق بتري يحتوي على 0.6 مجم / مل بروناز. بعد 5-10 دقائق ، باستخدام ماصة باستور ، انقل الأجنة المنزوعة الأيونات إلى طبق بتري طازج يحتوي على ماء جنين عادي. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، اجمع ~ 100 جنين وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
    3. تخلص من الوسط بعناية وأضف 200 ميكرولتر من محلول رينغر المثلج (مخزن deyolking المؤقت). الحفاظ على الأنبوب على الجليد ، ماصة المحتويات صعودا وهبوطا ~ 20 مرة حتى يذوب صفار البيض. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة في جهاز طرد مركزي منضدية عند 4 °C. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وتجاهل بعناية طاف .
    4. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، انقل الأجنة منزوعة الأصداء إلى طبق بتري يحتوي على 10 مل من محلول التربسين (محلول تفكك الخلايا). قم بأدائها في أطباق بتري متعددة لتجنب اكتظاظ الأجنة وعدم كفاءة التربسين. استخدم ماصة سعة 1 مل ، امزج المحلول الذي يحتوي على أجسام الجنين مرة أو مرتين لتقليل التجميع.
    5. احتضان أطباق بتري في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (<24 أجنة hpf) أو 30 دقيقة (24-30 hpf الأجنة). نضح وتوزيع التعليق من حين لآخر باستخدام ماصة 1 مل للمساعدة في تفكك الخلايا.
    6. خلال فترة الحضانة ، قم بتهيئة آلة مقياس التدفق الخلوي لعد الخلايا.
    7. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتمرير تعليق التربسين عبر المصفاة للحصول على تعليق أحادي الخلية. اغسل أطباق بتري بنفس التعليق عدة مرات لإزالة الخلايا الملتصقة بالسطح.
    8. قم بتدوير العينات عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في دوار دلو متأرجح.
    9. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بارد 1x.
    10. أدر مرة أخرى على حرارة 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
    11. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في PBS + 5٪ مصل بقري جنيني واحتفظ بها على الجليد حتى تشغيل FACS.
  2. تحضير مقياس التدفق الخلوي
    1. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي وابدأ بدء التشغيل.
      ملاحظة: قبل تشغيل الجهاز، أفرغ سلة المهملات واملأ خزان سائل الغمد.
    2. تطبيع تدفق التيار لفوهة 70 ميكرومتر (أو 85 ميكرومتر). اتركه دون إزعاج لمدة 10-15 دقيقة إذا كان غير مستقر.
  3. عد الخلايا ذات العلامات الفلورية باستخدام مقياس التدفق الخلوي
    1. قم بتهيئة مجلد تجربة جديد وقم بعمل مخطط تشتت للتشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي ورسم بياني لشدة إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC).
    2. قم بتحميل الخلايا من النوع البري أولا لتعيين بوابات التشتت الأمامية والجانبية (لاستبعاد الازدواجية والحطام) وعتبة FITC.
    3. بعد ضبط البوابات ، قم بإزالة العينة وتحميل الخلايا المعزولة من أجنة Tg (ftyrp1: GFP) لحساب الخلايا الصباغية.
      ملاحظة: هنا ، نظرا لأن ftyrp1: GFP يسمي الخلايا الصباغية الناضجة على وجه التحديد ، فإن عدد الخلايا الإيجابية ل GFP تحت بوابة FITC سيتوافق مع عدد الخلايا الصباغية.
    4. كرر الخطوة المذكورة أعلاه مع العينات المحقونة بالمورفولينو لتقدير ومقارنة عدد الخلايا الصباغية مع عنصر التحكم.
  4. قياس شدة التألق في أجنة الزرد
    1. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، اجمع 100-120 جنينا وانقلها إلى طبق بتري يحتوي على ماء جنين عادي.
    2. عند ~ 10-12 hpf ، انقل الأجنة إلى 0.003٪ 1-phenyl-2-thiourea لمنع التصبغ.
    3. إجراء الإزالة اليدوية باستخدام إبر الأنسولين لتصوير أجنة <48 hpf.
    4. لشل حركة الأجنة ، تعامل مع 0.016 ٪ تريكايين.
    5. لتركيب الأجنة للتصوير ، ضع بضعة مل من 1.5-2 ٪ ميثيل سلولوز في طبق بتري (60 مم) بحيث يشكل طبقة رقيقة. أضف الأجنة إلى ميثيل سلولوز لتقييد أي حركة أخرى أثناء التصوير. ضع طبق بتري الذي يحتوي على العينات تحت المجهر. باستخدام طرف ماصة ، اضبط الحيوان في الاتجاه المطلوب.
    6. الحصول على الصور باستخدام برنامج الاستحواذ. بالنسبة للأجنة <24 حصان ، التقط الجنين بالكامل مرة واحدة تحت تكبير 10x. بالنسبة لمراحل >24 hpf ، احصل على حقول مسح متعددة ثم قم بتجميعها (غرزها) معا.
    7. كرر هذا مع جميع الأسماك وتأكد من أن الإعداد للاكتساب يظل ثابتا خلال التجربة.
  5. التحديد الكمي
    1. قم بتحليل الصورة بشكل أكبر باستخدام برنامج ImageJ.
    2. افتح الصورة المراد قياسها كميا في ImageJ باستخدام أداة فتح .
    3. استخدم أداة الشكل اليدوي لتحديد المنطقة المراد تحليلها (الشكل 3E).
    4. اضغط على M (أو تحليل | Measure) للحصول على قياس كثافة منطقة محددة .
    5. الحفاظ على المنطقة المراد تحليلها ثابتة ، وحساب متوسط الكثافة لكل منطقة لكل على حدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام سير العمل الموصوف في الشكل 1 لإجراء اضطراب وراثي قائم على المورفولينو في مرحلة الخلية الواحدة لسمك الزرد. تم إجراء تحليل التصبغ باستخدام طرق مختلفة ، كما هو مذكور أدناه. لتوضيح النتائج التمثيلية ، تم حقن أحجام موحدة من المورفولينو المضاد للحساسية الذي يستهدف جينات h2afv و ca14 في مرحلة صفار البيض أو الخلية الواحدة من جنين الزرد. تم إجراء التنميط الظاهري الأولي القائم على التصوير الساطع في 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf) ، عندما كانت جميع خطوط الميلانوفور الخمسة المصطبغ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما يتجلى النمط الظاهري للتصبغ على أنه تغيرات في محتوى الميلانين أو عدد الخلايا الصباغية الحاملة للصبغة. تسمح الطريقة الموصوفة هنا بتشريح هذا الانقسام وتسمح بالتقييم النوعي والكمي لمحتوى الميلانين وعدد الميلانوفور لكل جنين ، بغض النظر عن محتوى الميلانين. إن الخصوبة العالية لسمك الزرد ، والطبيعة المرئية للخلايا الصباغية المصطبغة ، ونقص نقل الميلانوزوم تمكن من تشريح بيولوجيا الخلايا الصباغية باستخدام هذا النهج الجيني العكسي القابل للفحص متوسط الإنتاجية.

ينبع اختيار الإسكات القائم على المورف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر الدعم التمويلي المقدم من مجلس البحوث العلمية والصناعية من خلال مشروع MLP2008 وقسم العلوم والتكنولوجيا لمشروع GAP165 لدعم العمل المقدم في هذه المخطوطة. نشكر جياشري رينجاراجو وشيتان ميشرا على مساعدتهما في التجارب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل أنابيب دقيقةAxygenMCT-150-Aلتحضير محلول MO
2 مل أنابيب دقيقةAxygenMCT-200-Cلخطوات الغسيل في بروتوكول FACS
AgaroseSigma-AldrichA-9539-500Gللحقن الدقيق
BD FACSAria IIBD BiosciencesNAلفرز الخلايا
أنبوب شعريDrummond1-000-0010
مصفاة خلية كورنينجكورنينج CLS431751لصنع معلق خلية واحدة
DMEM وسائط الجلوكوز العاليةسيجما ألدريتشD5648بروتوكول FACS
إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات (تريكايين)سيجما ألدريتشE10521-50Gلشل حركة ZF لتصوير
حمض ثنائي الصوديوم ثنائي هيدرات ملح الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشE5134للمحلول البارد المخزن
أنابيب FACSBD-Biosciences342065بروتوكول FACS
مصل الأبقار الجنيني (FBS)بروتوكول Invitrogen10270FACS
برنامج منشور GraphpadGraphstats TechnologiesNAلتمثيل البيانات
برنامج ImageJالمعهد الوطني للصحةNAلتحليل الصور
محاقن الأنسولين (1 مل)DispoVanNAللتخلص اليدوي
من الميلانين ،سيجما ألدريتشM8631لفحص محتوى الميلانين
ميثيل السليلوزسيجما-ألدريتشM7027-250Gلشل حركة ZF لتصوير
نصائح MicroloaderEppendorf5242956003للحقن المجهري
MorpholinoGene-toolsNAلتجارب الضربة القاضية
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629لتثبيط تكوين الميلانين
مجتذب الإبرةأداة SutterP-97للحقن المجهري
Nunc 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم من مادة البولي بروبيلينThermo Fisher Scientific339650بروتوكول FACS
Petridish (60 مم)Tarsons460090ل لوحات الجنين
Phenylmethylsulphonyl فلوريدSigma-Aldrich10837091001للمحلول الملحي للتحلل البارد
للفوسفات (PBS)HiMediaTL1099-500mLلغسل الخلايا
PronaseSigma-Aldrich53702لكوكتيل
مثبط البروتيازSigma-AldrichP8340لغمد عازلة التحلل البارد
السائلBD FACSFlow TM< / sup>342003بروتوكول FACS
فوسفات الصوديومMerck7558-79-4عازلة التحلل البارد
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500MLللمحلول المؤقت للتحلل البارد
TrypLEGibco1677119للتربسين
المؤقت الاصطناعية محلول ملحي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
  2. Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
  3. Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
  4. Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
  5. Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19(2018).
  6. Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
  7. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  8. Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
  9. Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
  10. Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
  11. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).
  12. Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
  13. Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).
  14. Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
  15. Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552(2019).
  16. Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. Fluorescent quantification of melanin. Pigment Cell & Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).
  17. Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
  18. Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reverse GeneticsZebrafish PigmentationMelanocyte BiologyMorpholino SilencingFluorescence ImagingFlow CytometryMelanin QuantificationTransgenic ZebrafishMelanophore StripesCRISPR Technology

Related Articles