مقالة منهجية

تطوير مختبر متنقل لفسيولوجيا الميتوكوندريا لقياس طاقة الميتوكوندريا في الميدان

DOI:

10.3791/62956

⸱

أغسطس 27, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Kinesiology, Auburn University, 2Department of Biological Sciences, Auburn University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Auburn University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتصميم وبناء مختبر متنقل لقياس معدلات التنفس في الميتوكوندريا المعزولة للحيوانات البرية التي تم التقاطها في المواقع الميدانية. هنا ، نصف تصميم وتجهيز مختبر الميتوكوندريا المتنقل وبروتوكولات المختبر المرتبطة به.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد طاقة الميتوكوندريا موضوعا مركزيا في الكيمياء الحيوية الحيوانية وعلم وظائف الأعضاء ، حيث يستخدم الباحثون تنفس الميتوكوندريا كمقياس للتحقيق في القدرة الأيضية. للحصول على مقاييس التنفس الميتوكوندريا ، يجب استخدام عينات بيولوجية جديدة ، ويجب إكمال الإجراء المختبري بأكمله في غضون 2 ساعة تقريبا. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى قطع متعددة من المعدات المتخصصة لإجراء هذه المقايسات المختبرية. وهذا يخلق تحديا لقياس تنفس الميتوكوندريا في أنسجة الحيوانات البرية التي تعيش بعيدا عن مختبرات علم وظائف الأعضاء حيث لا يمكن الحفاظ على الأنسجة الحية لفترة طويلة جدا بعد جمعها في الحقل. علاوة على ذلك ، فإن نقل الحيوانات الحية لمسافات طويلة يؤدي إلى الإجهاد ، والذي يمكن أن يغير طاقة الميتوكوندريا.

تقدم هذه المخطوطة MitoMobile بجامعة أوبورن (AU) ، وهو مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الذي يمكن نقله إلى الميدان واستخدامه في الموقع لقياس استقلاب الميتوكوندريا في الأنسجة التي تم جمعها من الحيوانات البرية. يتم تقديم السمات الأساسية للمختبر المتنقل والطرق خطوة بخطوة لقياس معدلات التنفس الميتوكوندريا المعزولة. بالإضافة إلى ذلك ، تؤكد البيانات المقدمة نجاح تجهيز مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل وإجراء قياسات تنفس الميتوكوندريا. تكمن حداثة المختبر المتنقل في القدرة على القيادة إلى الميدان وإجراء قياسات الميتوكوندريا على أنسجة الحيوانات التي تم التقاطها في الموقع.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حتى الآن ، اقتصرت الدراسات المصممة لقياس طاقة الميتوكوندريا على المختبر أو الحيوانات التي تم التقاطها بالقرب من مختبرات علم وظائف الأعضاء الراسخة ، مما منع العلماء من إجراء دراسات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الأنسجة التي تم جمعها من الحيوانات خلال أنشطة مثل الهجرة والغوص والسبات1،2،3،4،5،6. في حين نجح العديد من الباحثين في قياس معدلات الأيض القاعدية والذروة ونفقات الطاقة اليومية للحيوانات البرية 7,8 ، ظلت قدرة الباحثين على قياس أداء الميتوكوندريا محدودة (ولكن انظر1،4،9). ويرجع ذلك جزئيا إلى الحاجة إلى أنسجة جديدة لعزل الميتوكوندريا ومنشأة مختبرية لإجراء عمليات العزل في غضون حوالي 2 ساعة من الحصول على الأنسجة الطازجة. بمجرد عزل الميتوكوندريا ، يجب أيضا إكمال قياسات تنفس الميتوكوندريا في غضون ~ 1 ساعة.

عادة ما يتم إجراء معدلات تنفس الميتوكوندريا المعزولة عن طريق قياس تركيز الأكسجين في حاوية محكمة الغلق متصلة بقطب كلارك. تستند النظرية الكامنة وراء هذه الطريقة إلى الملاحظة الأساسية القائلة بأن الأكسجين هو آخر مستقبل إلكتروني لتنفس الميتوكوندريا أثناء الفسفرة التأكسدية. لذلك ، مع انخفاض تركيز الأكسجين أثناء التجربة ، يفترض أن إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) يحدث10. الأكسجين المستهلك هو وكيل ل ATP المنتج. يمكن للباحثين إنشاء ظروف تجريبية محددة باستخدام ركائز مختلفة وبدء التنفس المستحث بالأدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) (الحالة 3) عن طريق إضافة كميات محددة مسبقا من ADP إلى الغرفة. بعد فسفرة جزيء ADP الخارجي إلى جزيء ATP ، ينخفض معدل استهلاك الأكسجين ، ويتم الوصول إلى الحالة 4 ويمكن قياسها. علاوة على ذلك ، تسمح إضافة مثبطات محددة بالحصول على معلومات تتعلق بالتنفس المتسرب والتنفس غير المنفصل10. تحدد نسبة الحالة 3 إلى الحالة 4 نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) ، وهي مؤشر اقتران الميتوكوندريا الكلي10,11. تشير القيم المنخفضة ل RCR إلى خلل وظيفي عام في الميتوكوندريا ، بينما تشير قيم RCR الأعلى إلى مدى أكبر من اقتران الميتوكوندريا10.

كما ذكرنا سابقا ، يجب إكمال جمع المواد البيولوجية وعزل الميتوكوندريا وقياس معدلات التنفس في غضون 2 ساعة من الحصول على الأنسجة. لإنجاز هذه المهمة دون نقل الحيوانات لمسافات كبيرة إلى المختبرات القائمة ، تم بناء مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل ليتم نقله إلى المواقع الميدانية حيث يمكن جمع هذه البيانات. تم تحويل مركبة ترفيهية Jayco Redhawk 2018 إلى مختبر فسيولوجيا جزيئية متنقل وسميت جامعة أوبورن (AU) MitoMobile (الشكل 1A). تم اختيار مركبة ترفيهية بسبب الثلاجة المدمجة والفريزر وخزان تخزين المياه والسباكة والكهرباء التي تعمل ببطاريات 12 فولت ومولد الغاز وخزان البروبان ونظام التسوية الذاتية. علاوة على ذلك ، توفر السيارة الترفيهية القدرة على البقاء في المواقع النائية طوال الليل لجمع البيانات. لم يتم تغيير مقدمة السيارة وتوفر أماكن القيادة والنوم (الشكل 1 ب). تمت إزالة وسائل الراحة المثبتة مسبقا في غرفة النوم (السرير والتلفزيون والخزانة) في الجزء الخلفي من السيارة والموقد.

تم تركيب أرفف مصنوعة حسب الطلب من الفولاذ المقاوم للصدأ وسطح عمل كوارتز مخصص مدعوم بإطار من الألومنيوم 80/20 بدلا من وسائل الراحة في غرفة النوم والموقد (الشكل 1C). توفر مقاعد المختبر مساحة كافية لجمع البيانات (الشكل 1 د). وأخذ في الاعتبار استهلاك الطاقة لكل قطعة من المعدات (أي أجهزة الطرد المركزي المبردة، وغرف التنفس الميتوكوندريا، وأجهزة قراءة الألواح، والحواسيب، والمجانسات، والموازين، والمجمدات الفائقة المحمولة، وغيرها من لوازم المختبرات العامة). لدعم الجهد الكبير ومتطلبات التيار لأجهزة الطرد المركزي ، تمت ترقية النظام الكهربائي إلى معدات الطائرات. تم تحويل حجرة خارجية في الجزء الخلفي من السيارة إلى حجرة لتخزين النيتروجين السائل ، والتي تلبي إرشادات وزارة النقل الأمريكية لتخزين النيتروجين السائل ونقله. تم بناء وحدة التخزين هذه من الفولاذ المقاوم للصدأ ولها تهوية مناسبة لمنع أي غاز نيتروجين متمدد من التسرب إلى مقصورة الركاب في السيارة.

للتأكد من إمكانية استخدام المختبر المتنقل في دراسات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، تم عزل الميتوكوندريا ، وتم قياس معدلات تنفس الميتوكوندريا من الفئران المنزلية المشتقة من البرية (Mus musculus) العضلات الهيكلية الخلفية. نظرا لأن Mus musculus هو كائن نموذجي ، فإن معدلات تنفس الميتوكوندريا لهذا النوع راسخة12،13،14. على الرغم من أن الدراسات السابقة قد وثقت عزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي15،16،17 ، إلا أنه تم وصف لمحة موجزة عن الطرق المستخدمة في طرق مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقلة أدناه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف الأقسام التالية طرق مختبر الميتوكوندريا. تمت الموافقة على جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات وجمع الأنسجة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة أوبورن (# 2019-3582).

1. وصف المخازن المؤقتة المستخدمة لجمع البيانات

ملاحظة: يمكن تحضير هذه المخازن المؤقتة في مختبر ثابت ونقلها إلى المختبر المتنقل قبل الرحلة الميدانية (ما لم يذكر خلاف ذلك أدناه).

  1. قم بإعداد عازلة عزل الميتوكوندريا للعضلات الهيكلية باستخدام ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، كما هو موضح في الجدول 1.
    1. قم بإذابة المواد الكيميائية في الماء منزوع الأيونات (~ 90٪ حجم) باستثناء BSA الخالي من الأحماض الدهنية. ضع المخزن المؤقت في الثلاجة حتى تصل درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية.
    2. اضبط المحلول على درجة حموضة 7.5 مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.
    3. أضف BSA الخالي من الأحماض الدهنية وارفع الحجم إلى 100٪. قسمة الحل إلى أنابيب مخروطية 50 مل. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بإعداد عازلة عزل الميتوكوندريا للعضلات الهيكلية بدون BSA كما هو موضح في الجدول 1.
    1. حل المواد الكيميائية في الماء منزوع الأيونات (~ 90٪ حجم). ضع المخزن المؤقت في الثلاجة حتى تصل درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية.
    2. اضبط المحلول على درجة حموضة 7.5 مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.
    3. ارفع مستوى الصوت إلى 100٪. قسمة الحل إلى أنابيب مخروطية 50 مل. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. تحضير المخزن المؤقت لإعادة تعليق العضلات الهيكلية كما هو موضح في الجدول 1.
    1. حل المواد الكيميائية في الماء منزوع الأيونات (~ 90٪ حجم). ضع المخزن المؤقت في الثلاجة حتى تصل درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية.
    2. اضبط المحلول على درجة حموضة 7.4 مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.
    3. ارفع مستوى الصوت إلى 100٪. قسمة الحل إلى أنابيب مخروطية 50 مل. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. تحضير مخزن تنفس العضلات الهيكلية كما هو موضح في الجدول 2.
    1. قم بإذابة المواد الكيميائية في الماء منزوع الأيونات (~ 90٪ حجم) باستثناء BSA الخالي من الأحماض الدهنية. سخني المخزن المؤقت حتى تصل درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    2. اضبط المحلول على درجة حموضة 7.0 مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
    3. أضف BSA الخالي من الأحماض الدهنية وارفع الحجم إلى 100٪. قسمة الحل إلى أنابيب مخروطية 50 مل. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. تحضير ركائز التنفس كما هو موضح في الجدول 2.
    1. تأكد من أن هذه الركائز مصنوعة طازجة في يوم جمع البيانات في 100 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4. تخزينها على الجليد حتى الاستخدام.
      ملاحظة: القيم المقدمة هي صنع محلول مركز بدرجة كافية لامتصاص الميتوكوندريا كمية كافية من الركيزة. التركيزات النهائية للركائز هي 2 mM pyruvate ، و 2 mM malate ، و 10 mM glutamate ، و 5 mM succinate.

2. إجراء عزل الميتوكوندريا (الشكل 2)

ملاحظة: يتم إجراء قياسات عزل الميتوكوندريا وتنفس الميتوكوندريا في منطقة مقاعد المختبر في المختبر المتنقل ، ويجب الاحتفاظ بجميع المحاليل عند 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. أوقف المختبر المتنقل على أرض مستوية. قم بتشغيل المولد وتسوية السيارة. قم بتمديد الشريحة وإعداد الجهاز.
  2. قم بإذابة الكميات المطلوبة من المخازن المؤقتة.
    ملاحظة: بشكل عام ، هناك حاجة إلى 30 مل من عازلة عزل العضلات الهيكلية و 10 مل من عازلة عزل العضلات الهيكلية بدون BSA لكل عضلة.
  3. قم بإعداد ومعايرة غرف التنفس الميتوكوندريا إلى درجة الحرارة المطلوبة للتجارب والضغط الجوي الحالي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. انظر جدول المواد لغرف محددة مستخدمة في التجارب.
  4. القتل الرحيم للحيوان عن طريق قطع الرأس.
    ملاحظة: استخدمت الدراسة الحالية قطع الرأس للقتل الرحيم. بعض الغازات ، مثل ثاني أكسيد الكربون والأيزوفلوران ، تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا18،19،20 ؛ يجب مراعاة هذه التأثيرات عند اختيار أفضل طريقة للقتل الرحيم لكل دراسة. سيتم تحديد الطريقة التي يجب إجراؤها لكل دراسة من خلال السؤال العلمي المطروح.
  5. استئصال العضلات الهيكلية ، وتقليم الدهون والأنسجة الضامة بسرعة ، ووزن ، ووضع العضلات في عازلة عزل العضلات الهيكلية مع BSA (على الأقل 1/10 w / v) (على سبيل المثال ، 1 غرام من العضلات الهيكلية إلى 10 مل من العازلة).
  6. اللحم المفروم العضلات والهيكل العظمي مع مقص على الجليد.
  7. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 5 مل. قم بتجانسها بشفرة (انظر جدول المواد) بقوة 50٪ لمدة 5 ثوان. يضاف البروتياز (5 ملغ / غرام من العضلات الرطبة) ويهضم لمدة 7 دقائق ، ويخلط المحلول كل 30 ثانية. قم بإنهاء التفاعل عن طريق إضافة حجم متساو من المخزن المؤقت للعزل باستخدام BSA.
  8. جهاز الطرد المركزي المجانس في 500 × غرام لمدة 10 دقائق. انقل المادة الطافية من خلال القماش القطني مزدوج الطبقات باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 5 مل في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق لترسيب حبيبات الميتوكوندريا البنية.
  9. اسكب الطافية المتبقية. أضف نفس الحجم من المخزن المؤقت للعزل باستخدام BSA إلى أنبوب الطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا بمكشطة مرنة (شرطي) عن طريق عمل حبيبات الميتوكوندريا برفق على جدران أنبوب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق.
  10. اسكب الطافية المتبقية. أضف نفس الحجم من المخزن المؤقت للعزل بدون BSA إلى أنبوب الطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا عن طريق عمل حبيبات الميتوكوندريا برفق على جدران أنبوب الطرد المركزي باستخدام شرطي نظيف. جهاز طرد مركزي عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق.
  11. صب المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الميتوكوندريا في مخزن إعادة التعليق عن طريق عمل حبيبات الميتوكوندريا برفق على جدران أنبوب الطرد المركزي مع شرطي نظيف.
    ملاحظة: يعتمد حجم المخزن المؤقت لإعادة التعليق على حجم حبيبات الميتوكوندريا.
  12. انقل الميتوكوندريا المعاد تعليقها إلى خالط Dounce بطرف ماصة مقطوع سعة 1 مل. باستخدام الخالط Dounce ، قم بتجانس التعليق بعناية مع 4-5 تمريرات.
  13. ضع معلق الميتوكوندريا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل باستخدام طرف ماصة آخر مقطوع سعة 1 مل.

3. قياسات التنفس الميتوكوندريا (الشكل 3)

  1. ركائز المجمع الأول
    1. أضف 945 ميكرولتر من محلول التنفس إلى الغرفة. تأكد من أن المحرك يدور ، ويتم الحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية. ابدأ تسجيل جمع البيانات.
    2. بعد استقرار تركيز الأكسجين ، أضف 20 ميكرولتر من الميتوكوندريا وضع الغطاء على الغرفة. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة الميتوكوندريا إلى الغرفة.
    3. أضف 10 ميكرولتر من 1 M الغلوتامات ، 10 μL من 200 mM malate ، و 10 μL من 200 mM البيروفات إلى الغرفة مع المحاقن الفردية وانتظر حتى تستقر الإشارة. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة ركائز.
      ملاحظة: تستخدم هذه الركائز عادة لقياس التنفس الناجم عن الكربوهيدرات. للاطلاع على تركيبات أخرى من الركائز التي يجب استخدامها لقياس التنفس الناجم عن الدهون، انظر21.
    4. أضف 5 ميكرولتر من ADP مع حقنة منفصلة ولاحظ الاستهلاك السريع للأكسجين (الحالة 3). في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة ADP.
      ملاحظة: بعد فسفرة ADP المضافة ، سوف يستقر معدل استهلاك الأكسجين إلى الحالة 4.
    5. بعد 4 دقائق من جمع بيانات الحالة 4 ، قم بإنهاء التسجيل. احفظ ملف البيانات.
  2. ركائز المجمع الثاني
    1. أضف 963 ميكرولتر من مخزن التنفس إلى الحجرة. تأكد من أن المحرك يدور ، ويتم الحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية. ابدأ تسجيل جمع البيانات.
    2. بعد استقرار تركيز الأكسجين ، أضف 20 ميكرولتر من الميتوكوندريا وضع الغطاء على الغرفة. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة الميتوكوندريا إلى الحل.
    3. أضف 2 ميكرولتر من 4 ميكروغرام / ميكرولتر روتينون متبوعا ب 10 ميكرولتر من سكسينات 500 مللي مول إلى الحجرة باستخدام محاقن منفصلة وانتظر حتى تستقر الإشارة. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة ركائز.
    4. أضف 5 ميكرولتر من ADP باستخدام حقنة منفصلة ولاحظ الاستهلاك السريع للأكسجين (الحالة 3). في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة ADP.
      ملاحظة: بعد فسفرة ADP المضافة ، سوف يستقر معدل استهلاك الأكسجين إلى الحالة 4.
    5. بعد 4 دقائق من جمع بيانات الحالة 4 ، قم بإنهاء التسجيل. احفظ ملف البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بحثت المخطوطة الحالية في تنفس الميتوكوندريا لعضلات Mus المشتقة من البرية (ن = 7 ، ذكر = 5 ، أنثى = 2 ؛ العمر = 1.30 ± 0.2 سنة) في مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل (الشكل 1). لقياس تنفس الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية ، تم استخدام الطرف الخلفي بأكمله ، وبالتالي العضلات الهوائية واللاهوائية ، لعزل الميتوكوندريا (الشكل 2). يوضح الشكل 3 أمثلة على بيانات التنفس الخام للميتوكوندريا. يمثل الشكلان 3 أ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الباحثين من عزل الميتوكوندريا وقياس معدلات تنفس الميتوكوندريا في غضون 2 ساعة من جمع الأنسجة في المواقع الميدانية النائية. تشير النتائج المقدمة هنا إلى أن قياسات تنفس الميتوكوندريا التي أجريت في AU MitoMobile قابلة للمقارنة مع القياسات التي أجريت في مختبر أبحاث جامعي. على وجه التحديد ، فإن قيم الحالة 3 والحالة 4 و RCR للعضلات المشتقة من البرية المعروضة هنا قابلة للمقارنة مع النتائج المنشورة سابقا من نفس المختبر وغيره (الجدول 3)12,23

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفون بمارك نيلمز وجون تينانت من قسم الهندسة الكهربائية وهندسة الحاسبات في كلية صموئيل جين للهندسة بجامعة أوبورن للمساعدة في التجهيز الهيكلي والكهربائي ل AU MitoMobile. بالإضافة إلى ذلك ، يقر المؤلفون بالتمويل لتجهيز AU MitoMobile والبحث من منحة الجوائز الرئاسية بجامعة أوبورن للبحوث متعددة التخصصات (PAIR).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.7 مل أنابيب الطرد المركزيVWR87003-294
2.0 مل أنابيب الطرد المركزيVWR87003-298
50 مل أنابيب الطرد المركزيVWR21009-681أنبوب الطرد المركزي Nalgene Oak Ridge
ADPVWR97061-104
ATPVWR700009-070
برادفوردVWR7065-020
لوحة واضحة 96 بئرVWR82050-760Greiner Bio-One
Dounce الخالطVWR22877-284ورق
مرفق مع Hansatech OxyGraph
غلوتاماتVWRA12919
محاقن هاميلتونVWR60373-985محاقن Gaslight 1700 Series
HansatechOxyGraph Hansatech Instruments Ltdلا يوجد رقم كتالوج ، ولكن يمكن العثور عليها ضمن المنتجات - وحدات التحكم في القطب الكهربائي
> KH2< / sub>PO4VWR97062-350
MalateVWR97062-140
MannitolVWR97061-052
غشاءمضمن مع Hansatech OxyGraph
MgCl2< / sub>VWR97063-152
MOPSVWR80503-004
PolicemanVWR470104-462
PolytronThomas Scientific11090044
كلوريد البوتاسيوم (KCl)VWR97061-566
البروتيازVWR97062-366يشيع استخدام التربسين ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام البروتياز الآخر.
حمض البيروفيكVWR97061-448
الصوديوم ديثيونيتVWRAA33381-22
سكسيناتVWR89230-086
السكروزVWRBDH0308-500G
Tris-BaseVWR97061-794
Tris-HClVWR97061-258
ترشيح Corning EGTA VWR EM-4100 الأحماض الدهنية الخالية من BSA VWR 89423-672 الجلوكوز VWR BDH8005-500G

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
  2. Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
  3. Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401(2018).
  4. Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
  5. Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
  6. Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
  7. Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
  8. Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
  9. Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545(2019).
  10. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  12. Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
  13. Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
  14. Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
  15. Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217(2015).
  16. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251(2017).
  17. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452(2011).
  18. Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
  19. Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
  20. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).
  21. Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  23. Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
  24. Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  26. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431(2011).
  27. Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
  28. Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
  29. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  30. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317(2011).
  31. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965(2008).
  32. Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811(2017).
  33. Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
  34. Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mitochondrial RespirationMobile Physiology LaboratoryField Mitochondrial MeasurementMitochondria IsolationRespiration ChambersTissue HomogenizationOxygen ConsumptionSkeletal Muscle MitochondriaRespiratory Control Ratio

مقالات ذات صلة