الترقيع هو طريقة روتينية تستخدم لتحديد كمية الفيروسات الحية في السكان. على الرغم من أن الترويح يتم تدريسه في كثير من الأحيان في مختلف مناهج علم الأحياء الدقيقة مع البكتيريا والعاثيات البكتيرية ، إلا أن ترقيع فيروسات الثدييات أكثر تعقيدا ويستغرق وقتا طويلا. يصف هذا البروتوكول الإجراءات التي تعمل بشكل موثوق للعمل المنتظم مع فيروسات الهربس البسيط.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Plaqueing من فيروسات الهربس البسيط
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هناك العديد من البروتوكولات المنشورة لتصحيح الفيروسات ، بما في ذلك المراجع ضمن الأدبيات الأولية للمنهجية. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ فيروسات الترقيح ، مما يتطلب التركيز على مواصفاتها وصقلها. إنها طريقة صعبة بشكل لا يصدق للطلاب الجدد لإتقانها ، ويرجع ذلك أساسا إلى أنها تتطلب اهتماما دقيقا بأدق التفاصيل. يجب أن يساعد هذا العرض التوضيحي لفيروسات الهربس البسيط أولئك الذين كافحوا في تصور الطريقة ، وخاصة الفروق الدقيقة فيها ، على مر السنين. في حين أن هذه المخطوطة تستند إلى نفس مبادئ منهجية الترقيم القياسية ، إلا أنها تختلف في أنها تحتوي على وصف مفصل ل (1) أفضل طريقة للتعامل مع الخلايا المضيفة لتجنب الاضطراب أثناء العملية ، (2) وسط لزج أكثر فائدة من الأغاروز للحد من انتشار الفيروسات ، و (3) إجراء تثبيت وتلطيخ بسيط ينتج عنه نتائج قابلة للتكرار بشكل موثوق. علاوة على ذلك ، يساعد الفيديو المصاحب في إظهار الفروق الدقيقة في العملية ، والتي غالبا ما يتم تفويتها عند توجيه الآخرين حول إجراء اختبارات اللويحات.
المقدمة
تعود بدايات فحوصات لوحة الفيروسات إلى الاكتشافات الأولى للفيروسات في 1890s1. تم عزل فيروس فسيفساء التبغ لأول مرة ونقله على أوراق التبغ، حيث يمكن التعرف على بقع العدوى الفردية وتحديدها كميا على أنها ناشئة عن كيان واحد من الفيروسات الحية2، والذي تم تحديده لاحقا على أنه فيروس2. وقد أتقنت الدراسات المنوية اللاحقة التي أجريت على البكتيريا والعاثيات البكتيرية التقنيات المستخدمة لتجويف هذه الفيروسات، بما في ذلك البكتيريا في مرحلة منتصف سجل النمو، والتخفيف التسلسلي لعينات العاثيات البكتيرية، والأجار العلوي مع التصور اللاحق للثقوب الحرفية (المسماة اللويحات) في العشب البكتيري3.
<....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات مع خلايا فيرو وفيروسات الهربس الحية من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة توسون. ويمثل الشكل 1 مخططا معمما لهذه الإجراءات.
1. بذر خلايا فيرو
- في اليوم السابق لبدء فحص اللويحات، قم بتربسين خلايا فيرو وإعادة تعليقها في وسط النسور المعدلة (DMEM) من دولبيكو العادي والملحق وفقا لمنهجية زراعة الخلايا القياسية19. أعد تعليق الخلايا التربسينية في 10 مل من DMEM لكل قارورة T-75 من خلايا Vero المتقاربة (~ 107 خلايا).
ملاحظة: يستخدم DMEM لمقايسات البلاك بدلا من ألفا-ميم لأنه يبطئ قليلا معدل نمو الخلايا ويفضل نتائج فحص ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الجدول 1 تجربة لها أفضل النتائج. تتبع جميع التخفيفات 10 أضعاف انخفاضا بمقدار 10 أضعاف تقريبا في عدد اللويحات. يمكن أيضا رؤية هذه الأنواع من البيانات في الشكل 2 ، وهو فحص فعلي للويحات حيث انخفض العدد القابل للعد من اللويحات في نطاق 10-4 لجميع النسخ المتماثلة الثلاثة. ويمكن ملاحظة الشيء نفسه في الشكل 3، الصف العلوي، حيث كان العدد القابل للعد من اللويحات في التخفيف 10-3.
ومع ذلك ، يوضح
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في حين أن مقايسات البلاك قديمة قدم زراعة خلايا الثدييات نفسها تقريبا ، يبدو أن كل مختبر لديه مجموعة خاصة به من البروتوكولات لتنفيذ هذا الفحص الأساسي5،6،10،11،12،13،14،15،16،20 . على الرغم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر عددا لا يحصى من الطلاب في مختبراتنا (PJD و BJM) الذين عملوا معنا على مر السنين لتحسين هذه الأساليب. شكر خاص ل Stan Person ، الذي تم تطوير هذه المنهجية تحت وصايته لأول مرة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صندوق دعم البحوث الجامعية لكلية فيشر للعلوم والرياضيات بجامعة توسون وجسر NIGMS إلى منحة البكالوريا 5R25GM058264. هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 12 بئر ألواح | Corning | 3512 | |
| 6 آبار | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| المضادات الحيوية / المضادة للفطريات | Gibco | 15240096 | |
| البنفسجي الكريستالي | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (بدون Mg < sup > + + < / sup> أو Ca ++ < / sup>) | جيبكو | 14190144 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| مقياس الدم | ثيرمو فيشر | 02-671-54 | |
| ميثيل السليلوز | ميليبور سيجما | 27-441-0 | |
| العامل الرباعي (Lysol I.C.) | ثيرمو فيشر | NC9645698 | |
| تريبان بلو | كورنينج | 25900CI | |
| تربسين | سيتيفا | SH30042.01 | |
| خلايا فيرو | ATCC | CCL-81 |
المراجع
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
