مقالة منهجية
هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لتصوير المبايض بأكملها للتحليلات الكمية والنوعية باستخدام تلطيخ المناعة الكامل ، والمجهر متعدد الفوتونات ، والتصور والتحليل 3D. يستوعب هذا البروتوكول معالجة عالية الإنتاجية وموثوقة وقابلة للتكرار تنطبق على علم السموم والتشخيص السريري والمقايسات الجينومية لوظيفة المبيض.
تعتمد خصوبة الإناث والعمر التناسلي على نوعية وكمية احتياطي بويضة المبيض. يتم التخلص من ما يقدر بنحو 80٪ من الخلايا الجرثومية الأنثوية التي تدخل الطور الأولي الاختزالي خلال استنزاف بويضة الجنين (FOA) والأسبوع الأول من حياة ما بعد الولادة. ثلاث آليات رئيسية تنظم عدد البويضات التي تعيش أثناء التطور وتنشئ احتياطي المبيض لدى الإناث اللواتي يدخلن سن البلوغ. في الموجة الأولى من فقدان البويضات ، يتم التخلص من 30-50٪ من البويضات خلال FOA المبكر ، وهي ظاهرة تعزى إلى التعبير العالي عن العنصر النووي الطويل المتخلل 1 (LINE-1). الموجة الثانية من فقدان البويضات هي القضاء على البويضات ذات العيوب الوسيطة بواسطة نقطة تفتيش جودة meiotic . تحدث الموجة الثالثة من فقدان البويضات في الفترة المحيطة بالولادة أثناء تكوين الجريب البدائي عندما تفشل بعض البويضات في تكوين بصيلات. ولا يزال من غير الواضح ما الذي ينظم كل من هذه الموجات الثلاث من فقدان البويضات وكيف تشكل احتياطي المبيض في الفئران أو البشر.
وقد فتح التألق المناعي والتصور 3D طريقا جديدا لتصوير وتحليل تطور البويضات في سياق المبيض بأكمله بدلا من أقسام 2D أقل إفادة. توفر هذه المقالة بروتوكولا شاملا للتلطيخ المناعي للمبيض بالكامل والمقاصة البصرية ، مما يؤدي إلى استعدادات للتصوير باستخدام الفحص المجهري متعدد الفوتونات والنمذجة 3D باستخدام البرامج المتاحة تجاريا. يوضح كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لإظهار ديناميكيات استنزاف البويضات أثناء تطور المبيض في الفئران C57BL/6J وتحديد كمية فقدان البويضات خلال الموجات الثلاث للقضاء على البويضات. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على مبايض ما قبل الولادة وبعدها المبكر لتصور البويضات وتحديدها كميا ، بالإضافة إلى النهج الكمية الأخرى. الأهم من ذلك ، تم تطوير البروتوكول بشكل استراتيجي لاستيعاب المعالجة عالية الإنتاجية والموثوقة والقابلة للتكرار التي يمكن أن تلبي الاحتياجات في علم السموم والتشخيص السريري والفحوصات الجينومية لوظيفة المبيض.
تولد معظم إناث الثدييات بعدد محدود من البويضات المتوقفة بشكل متوسط الحجم المخزنة داخل بصيلات بدائية ، والتي تشكل احتياطي المبيض (OR) 1,2. يحدد OR العمر الإنجابي العام للإناث والصحة3. عادة ما ينخفض حجم OR مع الشيخوخة ويمكن استنفاده قبل الأوان عند التعرض لبعض العوامل السامة للوراثية (الإشعاع / العلاج الكيميائي) والضغوط البيئية (سوء التغذية) ، مما يؤدي إلى العقم4،5،6. غالبا ما يمكن أن يعزى العقم الأنثوي مجهول السبب إلى الجودة الوراثية والفسيولوجية للبيض الذي يتطور من غرفة العمليات ولا يزال غير مفه....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
كانت جميع الفئران المستخدمة من السلالة الوراثية C57BL/6J (انظر جدول المواد). تم تسلسل هذه السلالة بالكامل وهي قياسية للعديد من الدراسات حول بنية المبيض ووظيفته. تم إيواء الفئران وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة ، وتمت الموافقة على الإجراءات التي تم تنفيذها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مختبر جاكسون. وترد الكواشف والتركيبات المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد والجدول 1 على التوالي.
1. إعداد الكواشف
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يتيح التلطيخ المناعي وتصوير المبيض بأكمله تصور وقياس حجم البويضات أو تعبير البروتين في المبيضين في مراحل النمو المختلفة باستخدام نفس التقنية والعلامات (الشكل 3). تم تطوير هذا البروتوكول لمشروع واسع النطاق يتطلب تحليل المبيضين على مراحل متعددة ومن سلالات متعددة من الفئران. هنا ، نقدم البيانات التي تم جمعها لسلالة C57BL6 / J ، وهي سلالة قياسية للتحليل الجيني. التقنية المعروضة هنا واضحة ، ويمكن الحصول على النتائج في غضون 14-19 يوما (الشكل 2D) ويمكن استخدامها للمباي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تقدم هذه المقالة بروتوكول تصوير وتصوير مناعي 3D مفصل للمبايض قبل الولادة وبعدها للحصول على إنتاجية عالية ودراسات مقارنة لتحديد كمية الخلايا الجرثومية وتوطين البروتين. قمنا بتطوير هذا البروتوكول لتحليل أعداد البويضات في المبيضين (N = 6-12) في ست نقاط زمنية للتطور في 10-16 سلالة مختلفة ، حيث تتم معالجة لوحات 2-4 24-well عادة في وقت واحد. يمكن تكييف هذه الطريقة مع الأعضاء الأخرى أو العلامات الخلوية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتسمية وتصور الخلايا الجسدية ، مثل الخلايا الحبيبية في المبيض ، باستخدام الأجسام.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 HD093778 إلى E.B-F و T32 HD007065 إلى R.B). نشكر زاكاري باوتشر على مساعدته في التجربة الإشعاعية. نشكر ماري آن هاندل على قراءتها النقدية للمخطوطة. نحن نقدر بامتنان مساهمة سونيا إيراتوبوزا وخدمة الفحص المجهري الأساسية في مختبر جاكسون لمساعدة الخبراء في عمل الفحص المجهري الموصوف في هذا المنشور وجاريك ترابزو من خدمات الأدوات العلمية في مختبر جاكسون لتصميم شريحة المحول المطبوعة 3D.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حاضنة منضدة | علمي | H2200-H | 37 درجة ؛ C حاضنة |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL / 6J | مختبر جاكسون | 000664 | سلالة فأرية |
| فطرية ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما ألدريتش | D1435 | المواد الخطرة |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| Dumont # 5 ملقط | FST | 91150-20 | |
| حواجز كاشف FastWells | GraceBio | 664113 | حشية سيليكون لزجة ومرنة (لاصقة جيدا) |
| مقص ناعم | FST | 91460-11 | |
| جلسرين | سيجما ألدريتش | G2025 | |
| جلايسين | ثيرموفيشر العلمي | BP381-500 | |
| الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | التخفيف 1: 1000 |
| الماعز المضاد للفئران IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | التخفيف 1: 1000 |
| مصل الماعز | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS Software | Oxford Instruments | الإصدار 9.7.0 | تصور وتحليل |
| الصور Insight X3 | Spectra-Physics | InSight ؛ X3 ليزر فائق السرعة قابل للضبط | للتصوير متعدد الفوتون |
| برنامج LASX | الإصدار | 3.5.6 | برنامج الحصول على الصور |
| Leica Dive / 4TONE / FALCON | Leica | Leica Dmi8 ، 2P-M جاهز: # 158005406 | مجهر متعدد الفوتون |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box ليزر فائق السرعة | للتصوير متعدد الفوتون |
| وحدة تحكم مضخة Masterflex | SPW | النموذج الصناعي: 7553-50 | مضخة تمعجية لمقص |
| Mayo | FST | 14010-17 | 5 "& ndash ؛ 7 " مقص حاد / حاد لقطع الرأس |
| نظارات الغطاء الصغير ، مربع ، رقم 1.5 25 × 25 مم | VWR | 48366-249 | |
| ميني BioMixer | المعياري شاكر | / مغذي B3D1020 | ل 37 درجة ؛ حاضنة C |
| نيكون Ergonomic SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | المجهر المجهري |
| الفراغي بارافورمالدهايد 16٪ (محلول مائي للفورمالديهايد) | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | PBS للمواد الخطرة |
| ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات | ThermoFisher | Scientific BP2944100 | يذوب في ماء Milli-Q |
| البنسلين الستربتومايسين ، 200x ، محلول مضاد حيوي مزدوج | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| كحول البولي فينيل (PVA) | سيجما ألدريتش | P8136 | |
| كوادرول (N ، N ، N & Prime ؛ ، N & Prime ؛ -Tetrakis (2-Hydroxypropylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Rabbit anti-DDX4 / MVH | Abcam | ab27591 | التخفيف 1: 500 |
| أرنب مضاد ل LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | التخفيف 1: 500 |
| الفئران المضادة ل TRA98 / GCNA | Abcam | ab82527 | التخفيف 1: 500 |
| أزيد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S2002 | المواد الخطرة |
| بوروهيدريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | 452882 | المواد الخطرة |
| السكروز | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar شاكر المداري | Bimedis | VXR-S10 | شاكر لدرجة حرارة الغرفة |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK مجموعة التسريب | MYCO Medical | 7001-23 | إبر للتروية |
| Urea | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S / N XT640-W-0147 | مصباح مضان LED منخفض الطاقة |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن