هنا ، نصف بروتوكولا محسنا لانسداد الوريد الشبكي باستخدام وردة البنغال ونظام مجهر تصوير الشبكية الموجه بالليزر مع توصيات لزيادة قابليته للتكاثر في السلالات المعدلة وراثيا.
مقالة منهجية
* These authors contributed equally
هنا ، نصف بروتوكولا محسنا لانسداد الوريد الشبكي باستخدام وردة البنغال ونظام مجهر تصوير الشبكية الموجه بالليزر مع توصيات لزيادة قابليته للتكاثر في السلالات المعدلة وراثيا.
غالبا ما تستخدم نماذج الفئران لانسداد الوريد الشبكي (RVO) في طب العيون لدراسة إصابة نقص تروية نقص الأكسجين في الشبكية العصبية. في هذا التقرير ، يتم توفير طريقة مفصلة تشير إلى الخطوات الحاسمة مع توصيات للتحسين لتحقيق معدلات انسداد ناجحة باستمرار عبر سلالات الفئران المعدلة وراثيا المختلفة. يتكون نموذج الماوس RVO بشكل أساسي من إعطاء صبغة محسسة للضوء عن طريق الوريد متبوعة بالتخثير الضوئي بالليزر باستخدام مجهر تصوير شبكية متصل بليزر موجه للعيون. تم تحديد ثلاثة متغيرات كمحددات لاتساق الانسداد. من خلال ضبط وقت الانتظار بعد إدارة البنغال الوردية وتحقيق التوازن بين خط الأساس وإخراج الليزر التجريبي ، يمكن أن يكون التباين عبر التجارب محدودا وتحقيق معدل نجاح أعلى للانسداد. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة أمراض الشبكية التي تتميز بوذمة الشبكية وإصابة نقص تروية نقص الأكسجين. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذا النموذج يؤدي إلى إصابة الأوعية الدموية ، فيمكن تطبيقه أيضا لدراسة الأوعية الدموية العصبية وموت الخلايا العصبية والالتهابات.
انسداد الوريد الشبكي (RVO) هو مرض شائع في الأوعية الدموية في شبكية العين أثر على ما يقرب من 28 مليون شخص في جميع أنحاء العالم في عام 20151. يؤدي RVO إلى تدهور الرؤية وفقدانها لدى البالغين وكبار السن في سن العمل ، مما يمثل مرضا مستمرا يهدد البصر ويقدر أنه سيزداد خلال العقد القريب. بعض الأمراض المميزة ل RVO تشمل إصابة نقص تروية نقص الأكسجين ، وذمة الشبكية ، والالتهاب ، وفقدان الخلايا العصبية2. حاليا ، الخط الأول من العلاج لهذا الاضطراب هو من خلال إعطاء مثبطات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF). بينما ساعد العلاج المضاد ل VEGF في تحسين وذمة الشبكية ، لا يزال العديد من المرضى يواجهون انخفاض الرؤية3. لمزيد من فهم الفيزيولوجيا المرضية لهذا المرض واختبار خطوط العلاج الجديدة المحتملة ، هناك حاجة لتشكيل بروتوكول نموذج فأر RVO وظيفي ومفصل لسلالات الفئران المختلفة.
تم تطوير نماذج الماوس باستخدام نفس جهاز الليزر المستخدم في المرضى من البشر ، مقترنا بنظام تصوير تم تحجيمه إلى الحجم الصحيح للماوس. تم الإبلاغ عن نموذج الماوس هذا من RVO لأول مرة في 2007 4 وتم تأسيسه بواسطة Ebneter وآخرين 4,5. في النهاية ، تم تحسين النموذج بواسطة Fuma et al. لتكرار المظاهر السريرية الرئيسية ل RVO مثل وذمة الشبكية6. منذ أن تم الإبلاغ عن النموذج لأول مرة ، استخدمته العديد من الدراسات باستخدام إدارة صبغة محسسة للضوء متبوعة بالتخثير الضوئي لأوردة الشبكية الرئيسية بالليزر. ومع ذلك ، فإن كمية ونوع الصبغة التي يتم إعطاؤها ، وقوة الليزر ، ووقت التعرض تختلف اختلافا كبيرا عبر الدراسات التي استخدمت هذه الطريقة. يمكن أن تؤدي هذه الاختلافات في كثير من الأحيان إلى زيادة التباين في النموذج ، مما يجعل من الصعب تكراره. حتى الآن ، لا توجد دراسات منشورة تحتوي على تفاصيل محددة حول السبل المحتملة لتحسينها.
يقدم هذا التقرير منهجية مفصلة لنموذج فأر RVO في سلالة C57BL / 6J وسلالة كاسباز 9 البطانية القابلة للحث على عقار تاموكسيفين (iEC Casp9KO) مع خلفية C57BL / 6J وذات صلة بأمراض RVO كسلالة مرجعية للفأر المعدل وراثيا. أظهرت دراسة سابقة أن التنشيط غير المبرمج للكابتيز البطاني caspase-9 يحرض على وذمة الشبكية ويعزز موت الخلايا العصبية8. ساعدت تجربة استخدام هذه السلالة في تحديد وتقديم نظرة ثاقبة نحو التعديلات المحتملة لتكييف نموذج فأر RVO ، والذي يمكن تطبيقه على سلالات أخرى معدلة وراثيا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يتبع هذا البروتوكول بيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تمت الموافقة على تجارب القوارض ومراقبتها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة كولومبيا.
ملاحظة: استخدمت جميع التجارب ذكور فئران عمرها شهرين تزن حوالي 20 جم.
1. إعداد وإدارة عقار تاموكسيفين للاستئصال الجيني المستحث للجينات floxed
ملاحظة: يمكن أن يتأثر قطر وعاء الشبكية بوزن الحيوان. تأكد من أن جميع الحيوانات المستخدمة في التجربة ذات أوزان متشابهة.
2. تحضير الكواشف للتخثير الضوئي بالليزر
3. إعداد الليزر
4. حقن الوريد ذيل الفأر من وردة البنغال
5. انسداد الأوردة الرئيسية
6. تحديد عدد الأوردة المسدودة في اليوم 0
7. الرعاية اللاحقة
8. تقييم وذمة الشبكية عن طريق التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT)
ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة في الوقت الذي يهمه المحقق. ذروة وذمة الشبكية للماوس C57BL / 6J هي 1 يوم بعد إجراء RVO. قد تختلف هذه النقطة الزمنية وفقا لخلفية الماوس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يهدف نموذج الماوس RVO إلى تحقيق انسداد في الأوردة الشبكية بنجاح ، مما يؤدي إلى إصابة نقص التأكسج ، وانهيار حاجز الشبكية الدموي ، وموت الخلايا العصبية ، وذمة الشبكية8. يوضح الشكل 1 جدولا زمنيا للخطوات لضمان قابلية التكرار ، وتخطيطيا للتصميم التجريبي ، ويحدد الخطوات التي يمكن تحسينها بشكل أكبر اعتمادا على الأسئلة التجريبية. الخطوات الثلاث الرئيسية التي يمكن تعديلها هي وقت الانتظار بعد إدارة البنغال الوردية ، وطاقة الليزر الأساسية ، وإخراج الليزر التجريبي. في هذا التقرير...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يوفر نموذج RVO للماوس وسيلة لفهم أمراض RVO بشكل أكبر واختبار العلاجات المحتملة. بينما يستخدم نموذج الماوس RVO على نطاق واسع في هذا المجال ، هناك حاجة إلى بروتوكول تفصيلي حالي للنموذج يعالج تباينه ويصف تحسين النموذج. هنا ، نقدم دليلا بأمثلة من التجربة حول ما يمكن تغييره للحصول على النتائج الأكثر اتساقا عبر مجموعة من التجارب وتقديم بيانات موثوقة.
العنصران الأساسيان في نموذج الماوس RVO هما إخراج الليزر والحقن الوريدي الناجح لصبغة المحسس للضوء. لإنتاج الطاقة اللازمة للحث على التخثر عندما يستهدف ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كاربروفين | ريماديل | NADA # 141-199 | يحافظ على 4 درجات ؛ C |
| زيت الذرة | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| كابل تصحيح الألياف | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| الكيتامين هيدروكلوريد | هنري شاين | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | متماسك | 1098293 | |
| فينيليفرين | أكورن | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV مع Meridian, وحدات StreamPix و OCT | مجموعة تكنولوجيا Phoenix | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | تحافظ على 4 درجات ؛ C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | Tropicamide Akorn NDC |
| : 174478-102-12 | |||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن