مقالة منهجية

نظام Explant لدراسات التصوير بالفاصل الزمني لتجميع الدوائر الشمية في ذبابة الفاكهة

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62983

⸱

أكتوبر 13, 2021

 , 
1Department of Biology, Howard Hughes Medical Institute, Department of Biology, Stanford University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إجراء التشريح وحالة الزرع والتصوير الحي لنظام إكسبلانت الهوائيات والدماغ لدراسة تجميع الدائرة الحامية الشمية.

الملخص

~ الخلايا العصبية مترابطة بدقة لتشكيل دوائر ضرورية للوظيفة المناسبة للدماغ. يوفر نظام ذبابة الفاكهة الشمية نموذجا ممتازا للتحقيق في هذه العملية نظرا لأن 50 نوعا من الخلايا العصبية للمستقبلات الشمية (ORNs) من الهوائيات والجس الفكي العلوي تعرض محاورها إلى 50 كبيبات محددة في فص الهوائي وتشكل اتصالات متشابكة مع التشعبات من 50 نوعا من الخلايا العصبية الإسقاط من الدرجة الثانية (PNs). ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على تحديد الجزيئات المهمة التي تنظم الاستهداف الدقيق في الدائرة الشمية باستخدام الأنسجة الثابتة. هنا ، يتم وصف نظام explant الهوائيات الدماغية الذي يلخص المعالم التنموية الرئيسية لتجميع الدوائر الشمية في الثقافة. من خلال تشريح البشرة الخارجية وتنظيف الأجسام الدهنية غير الشفافة التي تغطي دماغ العذراء النامي ، يمكن جمع صور عالية الجودة للخلايا العصبية المفردة من الأدمغة الحية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. وهذا يسمح بالتصوير بفاصل زمني لاستهداف محور عصبي ORN واحد من الأنسجة الحية. سيساعد هذا النهج في الكشف عن السياقات والوظائف البيولوجية المهمة للخلايا للجينات المهمة التي تم تحديدها مسبقا وتحديد الآليات التي تدعم العملية الديناميكية لتجميع الدائرة.

المقدمة

الخلايا العصبية مترابطة بدقة لتشكيل دوائر ضرورية للوظيفة المناسبة للدماغ. لأكثر من 100 عام، يحاول علماء الأعصاب فهم كيفية امتداد الخلايا العصبية نحو أهدافها المتوسطة والنهائية بدقة متناهية. ونتيجة لذلك ، حددوا جينات مهمة تشفر إشارات التوجيه لتطوير العمليات العصبية1. يوفر نظام ذبابة الفاكهة الشمية نموذجا ممتازا للتحقيق في هذه العملية منذ أن قامت الخلايا العصبية ذات المستقبلات الشمية (ORNs ، الخلايا العصبية الحسية الأولية) بمشروع إلى 50 كبيبات يمكن تحديدها ذات حجم وشكل وموضع نسبي نمطي ، حيث تشكل روابط متشابكة مع التشعبات من 50 نوعا من الخلايا العصبية الإسقاط من الدرجة الثانية (PNs) ، كل منها يرسل التشعبات إلى واحدة من 50 كبيبات2 (الشكل 1A ). لذلك ، من السهل نسبيا تحديد الأنماط الظاهرية المتحولة بدقة متشابكة (كبيبي) في نظام الشم الذبابة. أدى ذلك إلى اكتشاف جينات مهمة تنظم تجميع الدوائر الشمية3.

يعتمد تجميع الدائرة الشمية الذبابة على عمليات تنموية منسقة زمنيا ومكانيا3. تكتسب ORNs و PNs مصائر خلوية متميزة ، والتي تعد البرنامج لخصائص الأسلاك الخاصة بها. بعد ذلك ، تقوم التشعبات PN بنمط فص الهوائي مسبقا (الشكل 1B). ثم تدور محاور ORNs حول فص الهوائي الجانبي وتعبر خط الوسط للدماغ للوصول إلى فص الهوائي المقابل للجانبي. في وقت لاحق ، تغزو محاور ORN كلا من فصوص الهوائيات ipsi و contralateral وتشكل نقاط اشتباك عصبي مع تشعبات شريكها PNs في كبيبات محددة. تم اقتراح هذا النموذج الخشن لتجميع الدوائر الشمية بناء على توصيف العينات الثابتة من نقاط زمنية وسيطة أثناء التطوير. إن ضعف الدقة الزمنية وعدم القدرة على متابعة نفس العمليات العصبية عبر التطور من الأنسجة الثابتة يحد من الفهم الميكانيكي لعملية تجميع الدائرة.

من الصعب تقنيا أن تعيش عمليات ORN و PN للصور في الجسم الحي لأن عملية الأسلاك تحدث في النصف الأول من مرحلة العذراء عندما يكون الفص الهوائي محاطا بجسم دهني غير شفاف داخل علبة العذراء. لذلك ، من المستحيل تصوير الدائرة الشمية النامية مباشرة من الشرانق السليمة. يمكن للأنسجة المشوهة المستزرعة خارج الجسم الحي التحايل على عتامة الأنسجة وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة التطور العصبي4،5،6. التحدي المتمثل في استخدام استراتيجية مماثلة لزراعة الخلايا خارج الجسم الحي لدراسة الأسلاك العصبية في دماغ العذراء هو ما إذا كانت تلخص استهداف الخلايا العصبية الدقيقة في حالة الثقافة. استنادا إلى حالة زراعة خارج الجسم الحي تم الإبلاغ عنها سابقا لمجمع العين والدماغ الذبابة7 ، تم مؤخرا تطوير إكسبلانت يحتوي على الدماغ العذراوي بأكمله والهوائيات والأعصاب الهوائية المتصلة سليمة ، والتي تحتفظ بالاستهداف الدقيق للدائرة الشمية ويمكن أن تخضع للتصوير الحي القائم على المجهر ثنائي الفوتون لمدة تصل إلى 24 ساعة على تردد كل 20 دقيقة8 . هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لثقافة explant والتصوير. يوفر نظام explant طريقة قوية لدراسة تجميع الدائرة الشمية والدوائر الأخرى المحتملة في الدماغ المركزي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) ما لم يتم توضيح خلاف ذلك.

  1. لإعداد طبق الاستزراع لشل حركة الإكسبلانت أثناء التصوير بفاصل زمني ، ضع سيلغارد بسماكة 0.5 سم (امزج جيدا مكونين سائلين بنسبة 10: 1 قبل الاستخدام) على السطح السفلي لطبق بتري 60 مم × 15 مم واتركه يعالج لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2A ، المشار إليه باسم طبق Sylgard في النص التالي).
  2. لإعداد دبابيس صغيرة لتثبيت الإكسباس على هذه اللوحة، استخدم زوجا من الملقط للصق دبابيس صغيرة متعددة على شريط مع محاذاة النهايات الحادة على جانب واحد (الشكل 2B). استخدم زوجا من المقصات لقطع ~ 2 مم من الأطراف الحادة للدبابيس الدقيقة (الشكل 2B). استخدم الملقط لتثبيت الدبابيس الدقيقة المقطوعة وإدخالها في طبقة سيلغارد من لوحة سيلغارد مسبقة الصنع (الشكل 2C). يتم استخدام اثنين من المسامير الدقيقة لشل حركة explant واحد.
  3. استخدم فرشاة لجمع الشرانق البيضاء ، التي تشكل البوباريوم في غضون 1 ساعة ، من hsFLP ، مرصوفة بالحصى GAL4 / + ؛ UAS-FRT 100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 النمط الوراثي ونقلها إلى قوارير جديدة. صدمة حرارية في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لتحفيز استنساخ ORN المتناثر من الأنواع العشوائية. بعد الصدمة الحرارية ، ضع القوارير عند 25 درجة مئوية لمدة 30 ساعة ، مما أدى إلى ظهور شرانق تبلغ من العمر 30 ساعة بعد تكوين البوباريوم (APF).
  4. لتحضير وسط الاستزراع للإزباس، أضف 5 مل من البنسلين-ستربتومايسين (10000 يو/مل) إلى 500 مل من وسيط ذبابة الفاكهة من شنايدر. تصفية الوسط وجعل 45 مل aliquots في أنابيب مخروطية 50 مل. يمكن تخزين الوسط في 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أشهر.
  5. في يوم التصوير ، خذ أنبوبا واحدا من 45 مل من وسيط ذبابة الفاكهة من شنايدر وأضف 5 مل من مصل الأبقار الجنيني (10٪ v / v) ، 125 ميكرولتر من محلول مخزون الأنسولين البشري 4 mg / mL (التركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل) ، 50 ميكرولتر من 1 ملغ / مل 20-هيدروكسي إيكديسون محلول الأسهم المذاب في الإيثانول (1 ميكروغرام / مل التركيز النهائي). اخلطي جيدا وانقلي 15 مل من الوسط الكامل إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. يمكن تخزين بقية الوسط الكامل عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع. يتم اقتباس مصل الجنين البقري ومحلول مخزون الأنسولين البشري ومحلول مخزون 20-hydroxyecdysone وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  6. أكسجين الوسط الكامل 15 مل عن طريق ضخ فقاعات الأكسجين من أسطوانة الأكسجين تحت سطح السائل من خلال طرف ماصة معقمة 5 مل بمعدل فقاعة / فقاعة واحدة لمدة 20-30 دقيقة. استخدم فيلم بارافين لتغطية فتح الأنبوب أثناء هذه العملية.
  7. قم بتعقيم سطح بئر التشريح ولوحة سيلغارد (مع إدخال دبابيس صغيرة على طبقة سيلغارد ، محضرة في الخطوتين A1 و A2) مع 70٪ من الإيثانول. اتركها تجف قبل الاستخدام.

2. تشريح الزرع

  1. استخدم فرشاة لنقل الشرانق 30 ساعة APF (30 ساعة بعد تكوين البوباريوم) إلى منديل ورقي وتجفيف السطح الخارجي للشرانق لمدة 5 دقائق.
  2. ضع قطعة من الشريط على الوجهين على شريحة زجاجية. نعلق بعناية الشرانق المجففة على السطح اللزج للشريط مع الجانب الظهري المواجه لأعلى. اضغط بلطف على الشرانق بفرشاة لمساعدة الجانب البطني من الشرانق جيدا على الشريط (الشكل 3A). لا تتلف الخادرة.
  3. استخدم زوجا من الملقط لإزالة علبة العذراء البنية التي تغطي الجانب الظهري من الرأس (الشكل 3A ، B). أدخل طرفا حادا واحدا من الملقط بين علبة العذراء البنية والخادرة من الجانب الجانبي وكسر حالة العذراء البنية بعناية من خلال خط إلى الطرف الخلفي من الخادرة (الشكل 3B ، C). افتح علبة العذراء البنية. استخدم زوجا من الملقط لحمل الخادرة بلطف ونقلها إلى التشريح جيدا باستخدام 1 مل من الوسط الكامل المؤكسج. غمر الخادرة العائمة على السطح المتوسط لمساعدتها على الغرق في قاع البئر (الشكل 3D).
    ملاحظة: لا تقم بإدخال طرف الملقط بعمق كبير داخل علبة العذراء البنية لمنع إصابة الخادرة بالملقط.
  4. لتشريح الهوائيات الدماغية من الخادرة ، استخدم الملقط لحمل الخادرة بلطف بيد واحدة واستخدم زوجا من المقصات الدقيقة لقطع ثقب صغير من الجانب الخلفي من الخادرة باليد الأخرى (الشكل 3E). هذا الثقب الصغير يطلق الضغط العالي داخل الخادرة.
  5. قطع من خلال خط الوسط البطني للخادرة من الحفرة حتى الرقبة (الهيكل الضيق الذي يربط الرأس والصدر) مع المقص الدقيق (الشكل 3F). ثم ، قطع من خلال محيط الرقبة لفصل الرأس عن جسم الخادرة (الشكل 3G). إزالة الجسم ووضعه في بئر مختلف.
    ملاحظة: لا تقطع الرقبة مباشرة من الجانب الظهري / البطني من الخادرة ، مما قد يضغط على الدماغ.
  6. قطع البشرة الشفافة التي تغطي الجانب الظهري من الدماغ (الشكل 3H). هذا سوف يعرض الجسم الدهني فوق الدماغ. احتفظ ببعض البشرة التي ترتبط بها شبكية العين والهوائيات. كرر نفس الإجراء إلى الجانب البطني من الدماغ.
    ملاحظة: لا تقم بإدخال شفرة المقص بعمق شديد تحت البشرة لأن هذا سيؤدي إلى قطع أعصاب الهوائي التي تربط الهوائيات والدماغ (الشكل 3H').
  7. استخدم ماصة P10 لغسل الجسم الدهني الذي يغطي الدماغ والهوائيات بلطف عن طريق سحب الوسط نحو المناطق المفتوحة على الجانبين الظهري والبطني للرأس (الشكل 3I).
    ملاحظة: كن لطيفا جدا عند سحب الوسط حيث يمكن بسهولة فصل الدماغ عن البشرة. تأكد من إزالة جميع الدهون في الجسم خلال هذه الخطوة. لوحظ التطور الموقوف لمحاور ORN عندما لم يتم تنظيف الجسم الدهني جيدا ، ربما بسبب ضعف الوصول إلى الأكسجين من الوسط.
  8. لدراسة تفاعل محاور ORN الثنائية أو محاور ORN مع استهداف تغصن PN ، قم بقطع واحد أو اثنين من أعصاب الهوائي مع المقص الدقيق خلال هذه المرحلة8 (الشكل 3J). ضع شفرات المقص بعناية بين البشرة والدماغ وقطع أعصاب الهوائي المهتمة.
  9. لنقل الإكسبلانت التشريحي إلى صفيحة سيلغارد ، ضع قطرة من الوسط الكامل المؤكسج (~ 200 ميكرولتر) على سطح سيلغارد. قم بتغطية السطح الداخلي لطرف ماصة بطرف عريض 200 ميكرولتر بالجسم الدهني من الجذع المشوه (الخطوة 1.6) عن طريق سحب الجسم الدهني عدة مرات ، مما يمنع explants من الالتصاق بطرف الماصة أثناء النقل. بعد ذلك ، استخدم طرف الماصة العريض هذا لنقل الإكسبلانت من التشريح جيدا إلى القطرة المتوسطة على لوحة الاستزراع (الشكل 3K).
  10. استخدم الملقط لتثبيت الإكسبلانت على طبقة سيلغارد في الفصين البصريين (الشكل 3L). ضع لوحة سيلغارد بعناية على محطة التصوير وشل حركة اللوحة بأشرطة. أضف ببطء 10 مل من الوسط الكامل المؤكسج إلى لوحة سيلغارد باستخدام ماصة P1000.
    ملاحظة: تجنب تعطيل الإكسبلاست عند إضافة الوسط إلى صفيحة سيلغارد.

3. التصوير الحي القائم على المجهر ثنائي الفوتون

  1. لإجراء تصوير بفاصل زمني ، استخدم مجهرا ثنائي الفوتون ، وليزر Ti:Sapphire ، وهدف غمر الماء 20x (1.0 NA) وبرنامج تصوير. استخدم الطول الموجي للإثارة عند 920 نانومتر لتصوير بروتينات GFP. اضبط وقت سكن البكسل على 10 ميكروثانية.
  2. اضبط موضع محطة التصوير بحيث تكون المحطات الخارجية تحت الهدف تقريبا. استخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم العدسة قبل التصوير. خفض الهدف ببطء تحت الوسط بالقرب من explants. تحقق مما إذا كان هناك أي فقاعة على عدسة الهدف.
    1. إذا كان الأمر كذلك ، فارفع الهدف فوق الوسط وكرر ذلك حتى تختفي الفقاعة. ابحث عن البثور باستخدام العدسة وقم بمركز واحد في الحقل.
  3. لضمان وجود إكسبلانت مع عدد قليل من ORNs التي تحمل علامات متفرقة لتصوير الفاصل الزمني ، قم بتشريح ~ 10 explants في كل مرة ومحاذاة على محور y على لوحة الثقافة. قم بفحص جميع الإكسباسترات عن طريق تحريك الهدف على طول المحور y واختر مزبلة حيث وصل عدد قليل من محاور ORN المفردة للتو إلى فص الهوائي للتصوير (الشكل 4A).
    1. تعرف على فص الهوائي من خلال شكله البيضاوي ومحاور ORN التي بدأت في الالتفاف حوله. صورة مساحة ~ 150 ميكرومتر × 150 ميكرومتر في المستوى xy (تكبير 3x مع هدف 20x). تقدير حدود فصي الهوائي وتركيزهما في منطقة التصوير.
  4. حدد منطقة تصوير أولية على طول المحور z عن طريق تحديد القسم السفلي والقسم العلوي من المسح الضوئي. قم بإعداد منطقة التصوير على طول المحور z. اضبط أعمق قسم مع إشارات محورية ORN كأول جلسة تصوير والجلسة 100 ميكرومتر أعلاه (الجانب الأكثر سطحية) كآخر جلسة تصوير (الشكل 4B).
    ملاحظة: هذا يترك بعض الأقسام في الأعلى (الجانب السطحي) من محاور ORN ويتجنب نقل محاور ORN إلى أعلى خارج منطقة التصوير بسبب نمو الدماغ أثناء الثقافة.
    1. الصورة على فترات 2 ميكرومتر. اضبط المسح الضوئي التلقائي للتصوير على تردد كل 20 دقيقة باستخدام برنامج التصوير.
  5. قم بتحويل منطقة التصوير 20 ميكرومتر لأعلى على طول المحور z بعد التصوير الأول لمدة 4 ساعات و 20 ميكرومتر أخرى لأعلى على طول المحور z بعد التصوير لمدة 16 ساعة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تعيين برنامج نصي ومكدسات z مختلفة في برنامج التصوير.
  6. استزرع الإكسباج لفترة إضافية بعد التصوير (حتى 24 ساعة خارج الجسم الحي) قبل التثبيت والتلطيخ باستخدام N-cadherin ، وهي علامة عصبية ، للكشف عن الهوية الجينية لكل ORN واحد بواسطة الكبيبات التي يستهدفها.

4. معالجة الصور

  1. لمعالجة صور z stack من سلسلة الأقسام التي تم التقاطها في كل نقطة زمنية باستخدام برنامج فيجي ، افتح سلسلة أقسام الصور ، انقر فوق Image | مكدسات | مشروع Z [/].
  2. لتصحيح الانجراف الجانبي للعينة أثناء الثقافة، قم بتثبيت TurboReg Plugin في فيجي.
    1. افتح سلسلة صور مكدس z وصورة مكدس z واحدة من السلسلة. فتح المكونات الإضافية | | التسجيل توربوريج.
    2. حدد سلسلة صور مكدس z في المصدر وصورة مكدس z مفردة في الهدف | الترجمة. انقر فوق الزر Batch لتسجيل جميع الصور من سلسلة صور z stack المفتوحة.
  3. لتحقيق أقصى قدر من الفائدة من العينات المصورة ، افصل المحاور الأحادية ذات التصنيف المتناثر في المنطقة المجاورة لبعضها البعض عن صور z stack التي تتبع أقسام صور 3D.
    1. لاستخراج محاور ORN واحدة من عدد قليل من المحاور في نفس الصورة ، افتح سلسلة قسم الصورة ، وانقر فوق المكونات الإضافية | | التجزئة محرر التقسيم [/]. حدد أداة الفرشاة وقناع محور ORN المهتم به في نافذة عمل محرر التجزئة باستخدام أزرار تحديد "+" أو "-" في كل قسم صورة.
    2. انقر على عملية | حاسبة الصور [/]. حدد "Image X" في الصورة 1 ، "ضرب" في العملية ، "Image X. labels" في الصورة 2 ، [/]. يؤدي ذلك إلى إنشاء ملف سلسلة صور جديد باستخدام المحور العصبي المعني فقط. تنفيذ الخطوة 4.1 لمعالجة صورة مكدس z. كرر هذه الخطوة لجميع النقاط الزمنية لإنشاء ملف صورة سلسلة زمنية.
  4. لتلوين محاور مختلفة زائفة من نفس الصورة، قم أولا بتنفيذ الخطوة 4.3 لإنشاء ملف صورة السلسلة الزمنية لكل محور عصبي على حدة. افتح ملفات صور السلاسل الزمنية لمحاور عصبية مفردة مختلفة من نفس صورة البيانات الأولية. انقر على صورة | | الألوان دمج القنوات. حدد ملفات صور السلاسل الزمنية المختلفة في قنوات ألوان مختلفة وانقر فوق موافق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تصل محاور ORN إلى الفص الهوائي بين 18 ساعة و 36 ساعة APF. ثم يتنقلون في فص الهوائي ، ويعبرون خط الوسط ، ويعصب الكبيبات. الفيديو 1 هو فيديو تمثيلي يعرض العملية بأكملها لعدة محاور يمكن التعرف عليها بشكل فردي ، يتم التقاطها بتردد كل 20 دقيقة لمدة 24 ساعة. قبل التسجيل باستخدام TurboReg ، تظهر المحاور العصبية بعض الانجراف الجانبي مع تطور الدماغ (النصف الأول من الفيديو). بعد التسجيل ، يتم تصحيح الانجراف (النصف الثاني من الفيديو).

لفصل عدد قليل من محاور ORN عن نفس الإكسبلان، يظهر مثا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يحتفظ هوائيات ذبابة الفاكهة - الدماغ explant بالاستهداف الطبيعي للدائرة الشمية. لقد لاحظنا أن التطور أبطأ 2 مرات خارج الجسم الحي مقارنة بالجسم الحي. ويلاحظ أن نظام explant لا يحتفظ بالجس الفكي العلوي ، الذي يستضيف ستة أنواع من ORNs. لضمان تلخيص التطور الطبيعي خارج الجسم الحي ، يجب تجنب تمدد أعصاب الهوائي أثناء تشريح الزرع. خلال زراعة خارج الجسم الحي ، عادة ما يسبب نمو البكتيريا الموقوف للدائرة الشمية. لذلك ، من المهم التعقيم الشامل لطبق الثقافة والدبابيس قبل التصوير والحفاظ عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر ن. أوزيل و ر. هيسنجر على مشورتهما بشأن ثقافة الإكسبلان. M. فاغنر للمساعدة التقنية من المجهر ثنائي الفوتون. D.J. Luginbuhl لتوليد الذباب المعدلة وراثيا ؛ د. فريدمان للحصول على اقتراحات بشأن تحليل برمجيات فيجي؛ Y. Ge للمساعدة في العمل على الطاير ؛ C. McLaughlin و K.K.L. WONG للتعليق على المخطوطة. ل. ل. هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 1K99DC01883001 (إلى T.L.) و R01-DC005982 (إلى L.L.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
20-hydroxyecdysoneSigmaH5142
Chameleon Ti: ليزر الياقوتمتماسكمتماسك MRU X1
مصل الأبقار الجنينيثيرمو فيشر العلمي10082147
الأنسولين البشريثيرمو فيشر برنامجالعلمي 12585014
البراري
مقص صغيرأدوات الدقةالعالمية 501778
دبابيس دقيقةأدوات العلوم الدقيقة26002-10
اسطوانة أكسجينPraxairOX M-E
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Schneider ' s ذبابة الفاكهة < / em> 21720024فيشر الحراري المتوسط
SYLGARD 184 سيليكون المطاطالحرارية فيشر العلميNC0162601
المجهر ثنائيبروكر
غمر الماء الهدف (20X)Zeiss421452-9800-000
التصوير الصناعي الفوتون

المراجع

  1. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  3. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
  4. Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
  5. Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
  6. Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
  7. Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721(2015).
  8. Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
  9. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
  10. Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
  11. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
  12. Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
  13. Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
  14. Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة