يصف هذا البروتوكول إجراء التشريح وحالة الزرع والتصوير الحي لنظام إكسبلانت الهوائيات والدماغ لدراسة تجميع الدائرة الحامية الشمية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نظام Explant لدراسات التصوير بالفاصل الزمني لتجميع الدوائر الشمية في ذبابة الفاكهة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
~ الخلايا العصبية مترابطة بدقة لتشكيل دوائر ضرورية للوظيفة المناسبة للدماغ. يوفر نظام ذبابة الفاكهة الشمية نموذجا ممتازا للتحقيق في هذه العملية نظرا لأن 50 نوعا من الخلايا العصبية للمستقبلات الشمية (ORNs) من الهوائيات والجس الفكي العلوي تعرض محاورها إلى 50 كبيبات محددة في فص الهوائي وتشكل اتصالات متشابكة مع التشعبات من 50 نوعا من الخلايا العصبية الإسقاط من الدرجة الثانية (PNs). ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على تحديد الجزيئات المهمة التي تنظم الاستهداف الدقيق في الدائرة الشمية باستخدام الأنسجة الثابتة. هنا ، يتم وصف نظام explant الهوائيات الدماغية الذي يلخص المعالم التنموية الرئيسية لتجميع الدوائر الشمية في الثقافة. من خلال تشريح البشرة الخارجية وتنظيف الأجسام الدهنية غير الشفافة التي تغطي دماغ العذراء النامي ، يمكن جمع صور عالية الجودة للخلايا العصبية المفردة من الأدمغة الحية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. وهذا يسمح بالتصوير بفاصل زمني لاستهداف محور عصبي ORN واحد من الأنسجة الحية. سيساعد هذا النهج في الكشف عن السياقات والوظائف البيولوجية المهمة للخلايا للجينات المهمة التي تم تحديدها مسبقا وتحديد الآليات التي تدعم العملية الديناميكية لتجميع الدائرة.
المقدمة
الخلايا العصبية مترابطة بدقة لتشكيل دوائر ضرورية للوظيفة المناسبة للدماغ. لأكثر من 100 عام، يحاول علماء الأعصاب فهم كيفية امتداد الخلايا العصبية نحو أهدافها المتوسطة والنهائية بدقة متناهية. ونتيجة لذلك ، حددوا جينات مهمة تشفر إشارات التوجيه لتطوير العمليات العصبية1. يوفر نظام ذبابة الفاكهة الشمية نموذجا ممتازا للتحقيق في هذه العملية منذ أن قامت الخلايا العصبية ذات المستقبلات الشمية (ORNs ، الخلايا العصبية الحسية الأولية) بمشروع إلى 50 كبيبات يمكن تحديدها ذات حجم وشكل وموضع نسبي نمطي ، حيث تشكل روابط متشابكة مع التشعبات من 50 نوعا من الخلايا العصبية الإسقاط من الدرجة الثانية (PNs) ، كل منها يرسل التشعبات إلى واحدة من 50 كبيبات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) ما لم يتم توضيح خلاف ذلك.
- لإعداد طبق الاستزراع لشل حركة الإكسبلانت أثناء التصوير بفاصل زمني ، ضع سيلغارد بسماكة 0.5 سم (امزج جيدا مكونين سائلين بنسبة 10: 1 قبل الاستخدام) على السطح السفلي لطبق بتري 60 مم × 15 مم واتركه يعالج لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2A ، المشار إليه باسم طبق Sylgard في النص التالي).
- لإعداد دبابيس صغيرة لتثبيت الإكسباس على هذه اللوحة، استخدم زوجا من الملقط للصق دبابيس صغيرة متعددة على شريط مع محاذاة النهايات الحادة على جانب واحد (<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تصل محاور ORN إلى الفص الهوائي بين 18 ساعة و 36 ساعة APF. ثم يتنقلون في فص الهوائي ، ويعبرون خط الوسط ، ويعصب الكبيبات. الفيديو 1 هو فيديو تمثيلي يعرض العملية بأكملها لعدة محاور يمكن التعرف عليها بشكل فردي ، يتم التقاطها بتردد كل 20 دقيقة لمدة 24 ساعة. قبل التسجيل باستخدام TurboReg ، تظهر المحاور العصبية بعض الانجراف الجانبي مع تطور الدماغ (النصف الأول من الفيديو). بعد التسجيل ، يتم تصحيح الانجراف (النصف الثاني من الفيديو).
لفصل عدد قليل من محاور ORN عن نفس الإكسبلان، يظهر مثا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يحتفظ هوائيات ذبابة الفاكهة - الدماغ explant بالاستهداف الطبيعي للدائرة الشمية. لقد لاحظنا أن التطور أبطأ 2 مرات خارج الجسم الحي مقارنة بالجسم الحي. ويلاحظ أن نظام explant لا يحتفظ بالجس الفكي العلوي ، الذي يستضيف ستة أنواع من ORNs. لضمان تلخيص التطور الطبيعي خارج الجسم الحي ، يجب تجنب تمدد أعصاب الهوائي أثناء تشريح الزرع. خلال زراعة خارج الجسم الحي ، عادة ما يسبب نمو البكتيريا الموقوف للدائرة الشمية. لذلك ، من المهم التعقيم الشامل لطبق الثقافة والدبابيس قبل التصوير والحفاظ عل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر ن. أوزيل و ر. هيسنجر على مشورتهما بشأن ثقافة الإكسبلان. M. فاغنر للمساعدة التقنية من المجهر ثنائي الفوتون. D.J. Luginbuhl لتوليد الذباب المعدلة وراثيا ؛ د. فريدمان للحصول على اقتراحات بشأن تحليل برمجيات فيجي؛ Y. Ge للمساعدة في العمل على الطاير ؛ C. McLaughlin و K.K.L. WONG للتعليق على المخطوطة. ل. ل. هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 1K99DC01883001 (إلى T.L.) و R01-DC005982 (إلى L.L.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti: ليزر الياقوت | متماسك | متماسك MRU X1 | |
| مصل الأبقار الجنيني | ثيرمو فيشر العلمي | 10082147 | |
| الأنسولين البشري | ثيرمو فيشر برنامج | العلمي 12585014 | |
| البراري | |||
| مقص صغير | أدوات الدقة | العالمية 501778 | |
| دبابيس دقيقة | أدوات العلوم الدقيقة | 26002-10 | |
| اسطوانة أكسجين | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider ' s ذبابة الفاكهة < / em> 21720024 | فيشر الحراري المتوسط | ||
| SYLGARD 184 سيليكون المطاط | الحرارية فيشر العلمي | NC0162601 | |
| المجهر ثنائي | بروكر | ||
| غمر الماء الهدف (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
المراجع
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neu....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
