مقالة منهجية

تحليل التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية للرئة الفخذية

DOI:

10.3791/62985

⸱

نوفمبر 16, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا فعالا وقابلا للتكرار لعزل السكان المناعيين للجهاز التنفسي الفئراني. كما نقدم طريقة لتحديد جميع الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية التي توجد في رئتي الفئران السليمة ، باستخدام لوحة قياس التدفق الخلوي القائمة على 9 ألوان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز التنفسي على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية ويتطلب نظام مناعي منظم بدقة لتوفير الحماية مع قمع ردود الفعل غير المرغوب فيها على المستضدات البيئية. تستضيف الرئتين عدة مجموعات من الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية التي توفر المراقبة المناعية ولكنها تتوسط أيضا في الاستجابات المناعية الوقائية. هذه الخلايا ، التي تحافظ على توازن الجهاز المناعي الرئوي الصحي ، تشارك أيضا في العديد من الحالات المرضية مثل الربو والالتهابات وأمراض المناعة الذاتية والسرطان. يوفر التعبير الانتقائي للبروتينات السطحية وداخل الخلايا خصائص مناعية فريدة للخلايا المناعية في الرئة. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي له دور أساسي في تحديد مجموعات الخلايا هذه خلال الحالة الثابتة والظروف المرضية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يصف طريقة متسقة وقابلة للتكرار لتحديد الخلايا المناعية الموجودة في رئتي الفئران السليمة في ظل ظروف الحالة الثابتة. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد التغيرات في مجموعات الخلايا هذه في نماذج الأمراض المختلفة للمساعدة في تحديد التغيرات الخاصة بالمرض في المشهد المناعي للرئة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتوي الجهاز التنفسي الفئراني على نظام مناعي فريد مسؤول عن مكافحة مسببات الأمراض والحفاظ على التوازن المناعي. يتكون الجهاز المناعي الرئوي من مجموعات خلوية ذات تباين كبير في نمطها الظاهري ووظيفتها وأصلها وموقعها. توجد البلاعم السنخية المقيمة (AMs) ، التي نشأت بشكل رئيسي من الخلايا الوحيدة الجنينية ، في التجويف السنخي1 ، في حين أن البلاعم الخلالية المشتقة من نخاع العظام (IMs) موجودة في حمة الرئة 2. ويمكن كذلك تصنيف الرسائل الفورية تصنيفا فرعيا من خلال التعبير عن CD206. تملأ CD206+ IMs المنطقة المحيطة بالشعب الهوائية وحول الأوعية الدموية ، بينما تقع CD206- IMs في الخلالي السنخي 3. تم اقتراح بعض التصنيفات الفرعية للرسائل الفورية مؤخرا3،4،5،6. على الرغم من أن IMs أقل دراسة من AMs ، إلا أن الأدلة الحديثة تدعم دورها الحاسم في تنظيم الجهاز المناعي للرئة 7. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن CD206 أيضا في AMs8 المنشطة بدلا من ذلك.

الخلايا المتغصنة الرئوية (DCs) هي مجموعة أخرى غير متجانسة من الخلايا المناعية الرئوية فيما يتعلق بخصائصها الوظيفية وموقعها وأصلها. تم وصف أربع فئات فرعية من DCs في الرئة: DCs التقليدية CD103 + (المعروفة أيضا باسم cDC1) ، CD11b + DCs التقليدية (المعروفة أيضا باسم cDC2) ، DCs المشتقة من الخلايا الأحادية (MoDCs) ، و DCs9,10,11,12,13. يمكن تعريف الفئات الفرعية الثلاث الأولى على أنها مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) II + CD11c + 9،10،14،15. تعبر DCs البلازما عن MHC II وهي إيجابية بشكل متوسط ل CD11c ولكنها تعبر عن مستويات عالية من B220 و PDCA-19,13,16. في رئتي الفئران الساذجتين ، توجد CD103 DCs و CD11b DCs في الممر الخلالي للمجرى الهوائي ، في حين توجد DCs البلازما في الخلالي السنخي 17.

توجد مجموعتان رئيسيتان من الخلايا الوحيدة في الرئة أثناء الحالة المستقرة: الخلايا الوحيدة الكلاسيكية والخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية. الخلايا الوحيدة الكلاسيكية هي Ly6C + وهي حاسمة للاستجابة الالتهابية الأولية. في المقابل ، فإن الخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية هي Ly6C - وقد تم النظر إليها على نطاق واسع على أنها خلايا مضادة للالتهابات 3،16،18. في الآونة الأخيرة ، تم وصف مجموعة إضافية من الخلايا الوحيدة CD64 + CD16.2 + ، والتي تنشأ من الخلايا الوحيدة Ly6C وتؤدي إلى CD206 + IMs3.

تظهر الحمضات بشكل رئيسي في الرئتين أثناء عدوى الديدان الطفيلية أو حالات الحساسية. ومع ذلك ، هناك عدد قليل من الحمضات في الحمة الرئوية خلال الحالة المستقرة ، والمعروفة باسم الحمضات المقيمة. على النقيض من الحمضات المقيمة ، توجد الحمضات الالتهابية في الخلالي الرئوي وغسل القصبات السنخية (BAL). في نماذج الفئران من عث غبار المنزل (HDM) ، يتم تجنيد الحمضات الالتهابية في الرئة بعد التحفيز بوساطة المستضد. وقد اقترح أن الحمضات المقيمة قد يكون لها دور تنظيمي في الحساسية عن طريق تثبيط حساسية T helper 2 (Th2) ل HDM19.

على النقيض من بقية الخلايا النخاعية الرئوية ، تعبر العدلات عن Ly6G ولكن ليس CD68 وتتميز بتوقيع النمط الظاهري المناعي CD68-Ly6G + 16,20,21. أظهرت دراسات التصور أنه خلال الحالة المستقرة، تحتفظ الرئة بمجموعة من العدلات في المقصورة داخل الأوعية الدموية وتستضيف عددا كبيرا من العدلات خارج الأوعية الدموية22. على غرار الحمضات ، لا توجد العدلات في BAL في حالة ثابتة. ومع ذلك ، فإن العديد من أشكال التحفيز المناعي ، مثل تحدي LPS أو الربو أو الالتهاب الرئوي ، تدفع العدلات إلى التجويف السنخي ، مما يؤدي إلى وجودها في BAL21،22،23.

يمثل عدد كبير من خلايا CD45+ في الرئة القاتل الطبيعي (NK) والخلايا التائية والخلايا البائية وهي سلبية لمعظم علامات النخاع الشوكي24. في رئتي الفئران الساذجة ، يمكن تحديد هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا بناء على تعبير CD11b و MHC II18. حوالي 25٪ من خلايا CD45+ الرئوية هي خلايا بائية ، في حين أن النسبة المئوية لخلايا NK أعلى في الرئة من الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية الأخرى24،25،26. بين الخلايا التائية الرئوية ، جزء كبير هو CD4-CD8- ويلعب دورا مهما في التهابات الجهاز التنفسي26.

نظرا لأن الرئة تستضيف جهازا مناعيا معقدا وفريدا للغاية ، فقد تم تطوير العديد من استراتيجيات البوابة لتحديد الخلايا المناعية الرئوية والإبلاغ عنها16،18،20،27. توفر استراتيجية البوابات الموضحة هنا طريقة شاملة وقابلة للتكرار لتحديد ما يصل إلى 12 مجموعة مناعية نخاعية رئوية وغير نخاعية مختلفة باستخدام 9 علامات. تم استخدام علامات إضافية للتحقق من صحة النتائج. علاوة على ذلك ، يتم توفير طريقة مفصلة لإعداد تعليق أحادي الخلية يقلل من موت الخلايا ويسمح بتحديد المظهر الأكثر اكتمالا لحجرة الخلايا المناعية في الرئة. تجدر الإشارة إلى أن تحديد الخلايا غير المناعية في الرئة ، مثل الخلايا الظهارية (CD45-CD326 + CD31-) ، والخلايا البطانية (CD45-CD326-CD31 +) ، والخلايا الليفية يتطلب نهجا مختلفا28,29. ولا يشمل البروتوكول والطريقة الموصوفة هنا تحديد هوية هؤلاء السكان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع الدراسات والتجارب الموصوفة في هذا البروتوكول بموجب مبادئ توجيهية وفقا للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لمركز بيت إسرائيل ديكونيس الطبي. تم استخدام الفئران C57BL / 6 من أي من الجنسين التي يتراوح عمرها بين ستة وعشرة أسابيع لتطوير هذا البروتوكول.

1. الاستئصال الجراحي وإعداد الأنسجة

  1. القتل الرحيم للفأر عن طريق حقن 1 مل من ثلاثي برومو الإيثانول داخل الصفاق (أعدت وفقا للبروتوكول القياسي ؛ جدول المواد).
    ملاحظة: يجب تجنب اختناق CO2 في دراسات الرئة لأنه قد يسبب إصابة الرئة ويغير ميزات وخصائص خلايا المناعة الرئوية. يجب أيضا تجنب خلع عنق الرحم لأنه قد يسبب إصابة ميكانيكية للرئة.
  2. انقل الماوس إلى منطقة نظيفة ومخصصة للعملية الجراحية.
  3. قم بتثبيت الجانب الظهري للماوس لأسفل باستخدام إبر أو شريط لاصق على الأطراف الأربعة. استخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم جلد المنطقة البطنية.
  4. إجراء شق في الجلد ، من الرقبة إلى البطن. إزالة الجلد بعناية من منطقة الصدر.
  5. قم بإزالة القص والأضلاع بعناية.
  6. اغسل الرئتين عن طريق حقن 10 مل من PBS البارد مباشرة في البطين الأيمن ، باستخدام إبرة 18-21 جم ، حتى تصبح الرئتين بيضاء تماما.
  7. قم بإزالة الغدة الصعترية والقلب بعناية دون لمس الرئتين.
  8. افصل الرئتين بلطف عن الأنسجة المحيطة بها وانقلها إلى أنبوب به مخزن مؤقت BSA بارد (الجدول 1).
    ملاحظة: يجب بذل جهد لإزالة جميع الدهون المجاورة من الرئتين قبل مواصلة إعداد تعليق الخلية الواحدة ، لأن هذا يمكن أن ينحاز إلى القراءات.

2. إعداد تعليق خلية واحدة

  1. انقل الرئتين إلى طبق بتري فارغ وفرمهما بمشرطين ناعمين. انقل جميع قطع الرئة المفرومة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. استخدم 5 مل من المخزن المؤقت للهضم لغسل الصفيحة وإضافتها إلى أنبوب 50 مل الذي يحتوي على الرئة المفرومة (الجدول 1).
    ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت للهضم مباشرة قبل الاستخدام. استخدم 5 ملغم/مل من الكولاجيناز28. الجمع بين 1 أو 5 ملغ من الكولاجيناز مع المخزن المؤقت BSA أو PBS الخالي من البروتين لم يحسن النتائج (الشكل التكميلي S1).
  2. قم بتأمين غطاء الأنبوب وهضم الرئة لمدة 30 دقيقة على شاكر مداري بسرعة 150 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. أوقف التفاعل بإضافة 10 مل من المخزن المؤقت BSA البارد.
  3. بعد الهضم ، استخدم إبرة 18 جم لخلط وإذابة قطع الرئة. ضع مصفاة مرشح 70 ميكرومتر في الجزء العلوي من أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
    ملاحظة: قد يؤدي استخدام مرشح ميكرون أصغر إلى فقدان مجموعات نخاعية كبيرة.
  4. انقل خليط الرئة المهضوم ببطء مباشرة على المصفاة. استخدم الجانب المطاطي من مكبس حقنة سعة 10 مل لتحطيم قطع الرئة المتبقية على الفلتر. اغسل المواد المعالجة على الفلتر باستخدام المخزن المؤقت BSA.
  5. جهاز الطرد المركزي للتعليق أحادي الخلية عند 350 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. تخلص بعناية من supernatant وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK. تخلط جيدا باستخدام ماصة 1 مل ، وتحضن لمدة 90 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  7. أضف 10 مل من المخزن المؤقت BSA البارد لإيقاف التفاعل وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية.تخلص بعناية من المادة الفائقة وأعد تعليق الكريات في Staining Buffer لحساب الخلايا باستخدام مقياس مفاصل.
  8. أعد تعليق الخلايا بتركيز 5 × 106 خلية/مل واستخدمها لتلطيخ السطح (انظر القسم 3).
    ملاحظة: لهذا الغرض ، قم بطلاء الخلايا في صفيحة مستديرة القاع من 96 بئرا متبوعة بتلطيخ الأجسام المضادة وغسلها. إذا لم يكن جهاز الطرد المركزي اللوحتي متوفرا، فاستخدم أنابيب التدفق بدلا من اللوحات. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن الحصول على 15-20 × 106 خلية لكل رئة من فأرة C57BL / 6 عمرها 6-10 أسابيع متوسطة الحجم.

3. تلطيخ الأجسام المضادة السطحية

  1. انقل 1 × 106 خلية في 200 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة 96 بئرا. الطرد المركزي للصفيحة عند 350 × غرام لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول كتلة Fc عن طريق تخفيف الأجسام المضادة المضادة 16/32 (1:100) في مخزن التلطيخ العازل (الجدول 1).
  2. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول حجب FC المعد مسبقا (جدول المواد) واحتضنها لمدة 15-20 دقيقة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد.
  3. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ وقم بالطرد المركزي للصفيحة عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة السطحية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة السطحية (1:100; الجدول 2) في تلطيخ المخزن المؤقت.
    ملاحظة: (ط) يمكن استخدام الأجسام المضادة المضادة 16/32 لمنع FC مع الأجسام المضادة السطحية في نفس الخليط. (ii) إذا تم استخدام صبغة قابلة للإصلاح ، فأضفها إلى كوكتيل الأجسام المضادة السطحية بتخفيف 1: 1000.
  4. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية المعدة مسبقا واحتضنها لمدة 30-40 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. اغسل الخلايا باستخدام مخزن مؤقت للتلطيخ مرتين.
    ملاحظة: إذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ داخل الخلايا ، فأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من مخزن التلطيخ المؤقت وانتقل مباشرة إلى الحصول على البيانات الموجودة على مقياس التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، قد يتم إصلاح الخلايا وتخزينها عند 4 درجات مئوية لاقتنائها لاحقا. نوصي باستخدام الخلايا لقياس التدفق الخلوي في غضون 24 ساعة.

4. تثبيت الخلايا وتلطيخ داخل الخلايا

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتثبيت/التخلل (Fix/Perm Buffer) عن طريق خلط ثلاثة أجزاء من تركيز التثبيت/التخلل وجزء واحد من مخفف التثبيت/التخلل في مجموعة المخزن المؤقت لعامل التلطيخ FoxP3/Transcription Factor (الجدول 1).
  2. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت Fix/Perm المعد مسبقا لكل بئر من صفيحة البئر المكونة من 96 بئرا، حيث تم طلاء الخلايا كما هو موضح في القسم 3، واحتضنها لمدة 20-25 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  3. قم بتخفيف المخزن المؤقت للنفاذية 10x على أنه 1: 10 في الماء النقي منزوع الأيونات لإعداد مخزن مؤقت للنفاذية 1x.
  4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت للنفاذية 1x. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا عن طريق تخفيف الأجسام المضادة داخل الخلايا (1:100) في 1 مل من المخزن المؤقت للنفاذية.
  5. أعد تعليق الخلايا باستخدام 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية المعدة مسبقا لكل خلية من الصفيحة المكونة من 96 بئرا واحتضنها لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  6. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت للتخلل ومرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت للتلطيخ. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
    ملاحظة: في حالة عدم توفر مقياس التدفق الخلوي مع قارئ اللوحات، قم بنقل الخلايا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي.
  7. الحصول على ما لا يقل عن 1.5 × 106 خلية لكل عينة على مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: بالنسبة للألوان المفردة وعينات التحكم غير الملطخة ، سيكون 0.5-1 × 106 خلية لكل عينة كافيا. يوصى بعيار الأجسام المضادة الفردية المستخدمة لتحقيق التلطيخ الأمثل وتقليل التكاليف. تم تحسين البروتوكول الحالي باستخدام Fix / Perm Buffer الذي تم إعداده باستخدام مجموعة المخزن المؤقت للتلطيخ FoxP3. نظرا لأن CD68 عبارة عن سيتوبلازم وليس علامة نووية ، فقد تكون حلول النفاذية الأخرى مثل التركيز المنخفض للبارافورمالديهايد أو مجموعات cytofix / cytoperm من مختلف البائعين كافية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استراتيجية البوابات
الخطوة الأولى من استراتيجيتنا للبوابات هي استبعاد الحطام والمزدوجات (الشكل 1A). يعد الاستبعاد الدقيق للثنائيات أمرا بالغ الأهمية لتجنب المجموعات الإيجابية الكاذبة (الشكل التكميلي S2). بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا المناعية باستخدام CD45 + ، وهي علامة على الخلايا المكونة للدم (الشكل 1B). يمكن إضافة البقعة الحية الميتة لاستبعاد الخلايا الميتة. ومع ذلك ، يؤدي هذا البروتوكول إلى وفاة <5٪ من خلايا C...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يكون تحديد الخلايا المناعية الرئوية أمرا صعبا بسبب أنواع الخلايا المناعية المتعددة الموجودة في الرئة وخصائصها المناعية الفريدة مقارنة بنظيراتها المقيمة في الأنسجة الأخرى. في العديد من الحالات المرضية ، تظهر الخلايا ذات السمات الظاهرية المميزة في الرئتين. على سبيل المثال ، تؤدي إصابة الرئة الناجمة عن البليوميسين إلى تجنيد البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية المنتشرة في الفضاء السنخي ، حيث يمكن أن تبقى لمدة تصل إلى عام واحد وحتى تستمر بعد التليف الناجم عن البليومايسين. على النقيض من AMs المقيمة في الأنسجة ، فإن الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمتلك V.A.B. براءات اختراع على مسار PD-1 مرخص من قبل بريستول مايرز سكويب وروش وميرك وإي إم دي سيرونو وبوهرنجر إنجلهايم وأسترازينيكا ونوفارتيس وداكو. ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية أخرى متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01CA238263 و R01CA229784 (VAB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 مل حقنة الغطاسEXELINT26265
18 G الإبرBD الدقة انزلاقإبرة 305165
21 G إبرBD الدقة انزلاق إبرة305195
50 مل أنابيب مخروطيةFalcon3520
70 & مصفاة الخلايا mThermoFisher22363548
ألواح 96 بئرا Falcon/ corning3799
ACK Lysing BufferThermoFisherA10492-01
CD11b Biolegend101215للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
CD11c Biolegend المضاد للفأر117339 / 117337لمزيد من التفاصيل ، انظر الجدول 2
المضاد للفأرBiolegend103115للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
CD64 Biolegend المضاد للفأر139319للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
CD68 Biolegend المضاد للفأر137009للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
المضاد للفأر GR-1Biolegend108433للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
، Siglec F Biolegend المضاد للفأر155503للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
AVERTINSigma-Aldrich240486
B220Biolegend103228للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8
CD103Biolegend121405 / 121419لمزيد من التفاصيل ، انظر الجدول 2
CD24Biolegend138503للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
CD3Biolegend100205للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
الطرد
كولاجيناز من النوع 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
DNase IMillipore Sigma10104159001
الإيثانول
F4 / 80Biolegend123133للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
FcBlock (CD16 / 32)Biolegend101301للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
مصل الأبقار الجنينيR & D Systems
ملقط مسنن ناعمRoboz أداة جراحية Co
Foxp3 / مجموعة عازلة تلطيخ عامل النسخThermoFisher00-5523-00
Futura SafetyScalpel Merit Medical SystemsSMS210
Live / Dead Fixable Far Read Dead Cell StainKit ThermoFisherL34973لمزيد من التفاصيل انظر الجدول 2
MERTKBiolegend151505للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
MHC-IIBiolegend107621للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
NK1.1Biolegend108705للحصول على التفاصيل ، انظر الجدول 2
شاكر المداريVWRموديل 200
طبق بتريفالكون351029
جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولةSORVAL ST 16R
مقص منحني صغيرRoboz Surgical Instrument Co
، CD45 جهاز المركزي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  2. Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
  3. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964(2019).
  4. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  5. Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756(2020).
  6. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
  7. Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
  8. Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
  9. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
  12. Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
  13. Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
  14. Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
  15. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
  16. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
  17. Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046(2018).
  18. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  19. Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
  20. Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
  21. Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024(2019).
  22. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  23. Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
  24. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
  25. Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
  26. Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
  27. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
  28. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
  29. Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21(2020).
  30. Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416(2019).
  31. Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
  32. Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879(2018).
  33. Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
  34. Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
  35. Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794(2018).
  36. Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  37. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  38. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
  39. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
  40. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
  41. Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة