يفصل هذا البروتوكول طريقة محسنة لتوليف غلة عالية من البروتينات المؤتلفة من نظام ترجمة النسخ الخالي من الخلايا العقدية الفنزويلية (TX-TL).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مجموعة أدوات النسخ والترجمة العقدية عالية الإنتاجية للبيولوجيا التركيبية وتطبيقات المنتجات الطبيعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العقديات spp. هي مصدر رئيسي للمضادات الحيوية السريرية والمواد الكيميائية الصناعية. العقديات الفنزويلية ATCC 10712 هي سلالة سريعة النمو ومنتج طبيعي للكلورامفينيكول والجادوميسين والبيكروميسين ، مما يجعلها مرشحا جذابا كهيكل بيولوجي تركيبي من الجيل التالي. لذلك ، فإن الأدوات الوراثية التي تسرع تطوير S. venezuelae ATCC 10712 ، بالإضافة إلى نماذج Streptomyces spp. الأخرى ، مرغوبة للغاية لهندسة المنتجات الطبيعية واكتشافها. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم توفير نظام S . venezuelae ATCC 10712 الخالي من الخلايا في هذا البروتوكول لتمكين التعبير غير المتجانس عالي الإنتاجية لجينات G + C العالية (٪). هذا البروتوكول مناسب لتفاعلات الدفعات الصغيرة (10-100 ميكرولتر) إما في شكل لوحة 96 بئر أو 384 بئر ، في حين أن التفاعلات قابلة للتطوير. النظام الخالي من الخلايا قوي ويمكنه تحقيق غلة عالية (~ 5-10 μ M) لمجموعة من البروتينات المؤتلفة في الحد الأدنى من الإعداد. يتضمن هذا العمل أيضا مجموعة أدوات بلازميد واسعة للقياس في الوقت الفعلي للحمض النووي الريبوزي المرسال وتخليق البروتين ، بالإضافة إلى تلطيخ التألق في الجل للبروتينات الموسومة. يمكن أيضا دمج هذا البروتوكول مع سير عمل توصيف التعبير الجيني عالي الإنتاجية أو دراسة مسارات الإنزيم من جينات G + C العالية (٪) الموجودة في جينومات الأكتينوميسيت.
المقدمة
توفر أنظمة النسخ والترجمة الخالية من الخلايا (TX-TL) منصة نموذجية مثالية للبيولوجيا التركيبية لتنفيذ دورات التصميم والبناء والاختبار والتعلم السريعة، وهي الإطار الهندسي المفاهيمي للبيولوجيا التركيبية1. وبالإضافة إلى ذلك، هناك اهتمام متزايد بأنظمة TX-TL لإنتاج البروتين المؤتلف عالي القيمة في بيئة التفاعل المفتوح2، على سبيل المثال، لدمج الأحماض الأمينية غير القياسية في مترافقات الأجسام المضادة والأدوية3. على وجه التحديد ، يتطلب TX-TL مستخلصا خلويا أو بلازميد أو حمض نووي خطي ، ومحلول طاقة لتحفيز تخليق البروتين على دفعة واحدة أو تفاعلات شبه مستمرة. في حين أن الإشريكية القولونية TX-TL هي النظا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: انظر الجدول 1 والجدول 2 للحصول على وصفات لصفيحة GYM المتوسطة والأجار ومخازن الغسيل S30A و S30B.
1. إعداد الحلول والتوجيه العام
- احتفظ بجميع المحاليل والخلايا (ما بعد النمو) ومستخلصات الخلايا على الجليد بعد التحضير ، ما لم يتم ذكر استثناء.
- قم بتخزين المخزونات ل 1 M Mg-glutamate ، 4 M K-glutamate ، 40٪ (w / v) PEG 6000 ، 1 جم / مل من حمض البولي فينيل سلفونيك في درجة حرارة الغرفة ، وجميع المخزونات الأخرى عند -80 درجة مئوية. تقليل عدد دورات التجميد والذوبان لتجنب التحلل الكيميائي.
- لإعداد مخزونات حلول الطاقة (انظر الجدول 3) مثل 3-PGA (يتطلب تعديل الأس الهيدر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم توفير هذا البروتوكول التفصيلي كمثال لمساعدة المستخدم على إنشاء نظام Streptomyces TX-TL استنادا إلى سلالة نموذج S. venezuelae ATCC 10712 (الشكل 1). قد يسعى المستخدم إلى دراسة سلالات العقديات الأخرى. ومع ذلك ، فإن مراحل النمو / الحصاد للسلالات الأخرى ذات أوقات المضاعفة الأطول أو تفضيلات النمو المتميزة ستحتاج إلى تحسين مخصص لتحقيق نتائج الذروة. بالنسبة للنتيجة التمثيلية ، تم تحسين بروتين الفلورسنت mScarlet-I من البلازميد القياسي pTU1-A-SP44-mScarlet-I (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه المخطوطة، تم وصف بروتوكول S. venezuelae TX-TL عالي الإنتاجية بخطوات مفصلة يسهل إجراؤها لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والجدد لأنظمة TX-TL. تمت إزالة العديد من الميزات من بروتوكولات Streptomyces45 و E. coli TX-TL41 الحالية لإنشاء بروتوكول الحد الأدنى ، ولكنه عالي الإنتاجية ل S. venezuelae TX-TL5,26. سير العمل الموصى به هنا هو التأكد من أن S. venezuelae ينمو بسرعة في ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم البحثي التالي: EPSRC [EP/K038648/1] ل SJM كPSR مع PSF. قامت Wellcome Trust برعاية زمالة ISSF ل SJM مع PSF في إمبريال كوليدج لندن. منحة الجمعية الملكية البحثية [RGS\R1\191186]; جائزة Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] ل SJM في جامعة كينت؛ ومنحة الدكتوراه من صندوق أبحاث التحديات العالمية (GCRF) ل KC في جامعة كينت.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2.5 لتر قارورة UltraYield | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93٪) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black / Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| كلوريد الأمونيوم (98٪) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP ، CTP ، UTP ، GTP (محلول 100 ملي متر ، >99٪)ThermoFisher | R0481 | ||
| كاربينيسيلين (اتصل بالمورد للحصول على النقاء) | Melford | C46000-25.0 | |
| D- (+) -glucose (اتصل بالمورد للحصول على النقاء) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (& ge ؛ 98٪ - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (اتصل بالمورد للحصول على النقاء) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT 2< / sub> (اتصل بالمورد للحصول على النقاء) | سانتا كروز Biotech | sc-363644 | |
| الجلوكوز 6-فوسفات (>98٪) | Sigma | G7879 | |
| حمض خال من HEPES (اتصل بالمورد للحصول على النقاء) | Melford | B2001 | |
| حمض الجلوتاميك هيمي مغنيسيوم ملح رباعي الهيدرات (>98٪) | Sigma | 49605 | |
| كلوريد المغنيسيوم (98٪) | الشعير | 494356 | |
| Sigma | 70167-500G | ||
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well لوحة غسيل الكلى المجهري ، 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| بولي (فينيل كبريتات) ملح البوتاسيوم | سيجما | 271969 | |
| غلوتامات البوتاسيوم (>99٪) | الأمينية Sigma | G1149 | |
| RTS | 5 Prime | 2401530 | |
| كلوريد الصوديوم (99٪) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 عمود SPE (1 جم) مستخلص | الخميرة 505471 | ||
| سيجما ميلفورد | Y1333 | ||
| <قوي> المعدات< / قوي> | |||
| قارئ الصفائح | BMG | أوميغا |
المراجع
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
