واجهات هيدروجيل قابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا واختيارها وعزلها

Summary

يتم الإبلاغ عن استخدام الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لعزل الخلايا البكتيرية باستخدام أداة عالية الدقة للتربيت الخفيف. يتم مراجعة الإجراءات التجريبية الأساسية والنتائج ومزايا العملية. وتتيح هذه الطريقة العزل السريع وغير المكلف للبكتيريا المستهدفة التي تظهر وظائف نادرة أو فريدة من نوعها من المجتمعات أو السكان غير المتجانسين.

Abstract

حاول علماء الأحياء منذ فترة طويلة فهم العلاقة بين النمط الظاهري والنمط الجيني. لفهم أفضل لهذا الاتصال، من الأهمية بمكان تطوير تقنيات عملية تربط فحص الخلايا المجهرية مع عزل الخلايا بنقاء عال للتحليل الجيني في المصب. هنا، يتم وصف استخدام الهيدروجيلات البولي القابلة للتحلل الضوئي (الإيثيلين غليكول) لفحص وعزل البكتيريا ذات الأنماط الظاهرية للنمو الفريدة من مجموعات الخلايا غير المتجانسة. وتعتمد هذه الطريقة على تغليف الخلايا أو حاصرتها بالهيدروجيل، تليها الثقافة، والفحص المجهري، ثم استخدام أداة نقش ضوئي عالية الدقة للسيطرة الصدغية على تدهور الهيدروجيل وإطلاق خلايا مختارة في حل للاسترجاع. تطبيق أنماط ضوء مختلفة يسمح للسيطرة على مورفولوجيا الخلية المستخرجة، ويمكن استخدام أنماط مثل الحلقات أو الصلبان لاسترداد الخلايا مع الحد الأدنى من التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية للتخفيف من تلف الحمض النووي إلى العزلات. وعلاوة على ذلك، توفر أداة النقش الخفيف جرعة خفيفة قابلة للتعديل لتحقيق مختلف معدلات التدهور وإطلاق الخلايا. فهو يسمح بالتدهور بدقة عالية، مما يتيح استرجاع الخلايا بدقة مكانية على نطاق ميكرون. هنا ، يتم عرض استخدام هذه المواد لفحص واسترداد البكتيريا من كل من الهيدروجيل السائبة والأجهزة المصنعة مختبر على رقاقة. هذه الطريقة غير مكلفة وبسيطة ، ويمكن استخدامها للتطبيقات الشائعة والناشئة في علم الأحياء المجهرية ، بما في ذلك عزل السلالات البكتيرية مع ملامح نمو نادرة من المكتبات المتحولة وعزل الاتحادات البكتيرية مع الأنماط الظاهرية الناشئة لتوصيف الجينوم.

Introduction

عزل الخلايا ذات السلوكيات الفريدة من بيئة معقدة وغير متجانسة أمر أساسي للحصول على المعلومات الوراثية في علم الأحياء¹. في علم الأحياء المجهرية ، واختيار وعزل الميكروبات النادرة أو الفريدة بعد المراقبة يصبح من المهم في العديد من التطبيقات التي تتطلب وجود صلة بين المعلومات الجينومية والمعلومات الظاهرية التي يمكن ملاحظتها. وتشمل هذه التطبيقات اختيار سلالات نادرة phenotypically من المكتبات متحولة²، واختيار الكائنات الحية الدقيقة حجر الزاوية من المجتمعات الميكروبية المعقدة^3،4، واختيار البكتيريا النادرة ولكن المهم phenotypically من السكان isogenic. عزل الخلايا القابلة للحياة ولكن غير قابلة للتكثير (VBNC) من مجموعة البكتيريا هو مثال مهم على هذا الأخير، حيث غالبا ما تكون مخفية الخلايا مع النمط الظاهري VBNC في مجموعات البكتيريا في 1:10² إلى 1:10⁵ نسب^5،6. بسبب الصعوبات الواسعة النطاق في عزلة البكتيريا ، لا يزال الكثير غير معروف حول العديد من الكائنات الحية الدقيقة النادرة بشكل الظاهري. تؤكد هذه القيود على الحاجة إلى تقنيات عزل الخلايا لتحديد الخلية أو الخلايا المستهدفة من الخليط أولا ثم استردادها وعزلها للتحليل الجزيئي في المصب⁷.

بعض الطرق الأكثر شيوعا لعزل الخلايا تشمل تدفق قياس الخلايا والفلورسنت فرز الخلايا المنشطة (FACS)⁸، فصل المغناطيسي المناعي^9،10، وmicrofluidics¹¹. في حين أن هذه الأساليب العزل لها قيمة عالية، لديهم أيضا عيوب تحد من استخدامها. على سبيل المثال، يمكن أن توفر FACS العزل الميكروبي الروتيني على مستوى الخلية الواحدة لمتابعة التحليل الجينومي³ ولكن غالبا ما تكون محدودة بسبب توافرها وحسابها، فضلا عن قضايا التلوث المصب¹¹. وقد حصلت النهج القائمة على microfluidic مثل قياس التدفق الدقيق للخلايا على الكثير من الاهتمام ، والذي ، مقارنة ب قياس التدفق الخلوي التقليدي ، يسمح بانخفاض كبير في حجم العينة^{المطلوبة 12}. ومع ذلك ، فإن فصل واسترجاع مجموعات فردية أو صغيرة من الخلايا من الأجهزة الدقيقة غالبا ما يكون مشكلة صعبة تتطلب عادة إعدادا أكثر تعقيدا وتصميم جهاز¹³. العديد من النهج القائمة على microfluidic تميز وراثيا الخلايا قبل أن يتم إدخالها ومراقبتها في جهاز¹⁴، والحد من عدد الأنواع الفريدة التي لوحظت عند أداء شاشة وظيفية. ونظرا لهذه القيود، يلزم المزيد من الابتكار في كل من الطرق والمواد العملية لفحص الخلايا وعزلها لاستخدامها على نطاق واسع في العديد من المختبرات.

تقدم هذه الورقة نهجا جديدا قائما على المواد لفحص البكتيريا وعزلها. تستخدم الطريقة الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لتغليف الخلايا والثقافة والمراقبة المجهرية وإطلاق البكتيريا المستهدفة واستردادها عند الطلب مع أنماط الظاهرية الفريدة. تم تصميم Hydrogels لاحتواء حجم شبكة 10 نانومتر، حيث يحتوي كل وصلة عرضيةس-nitrobenzyl مجموعات¹⁵. المواد تغليف أو الفخاخ الخلايا للمراقبة مع تمكين نشر المواد الغذائية والنفايات من وإلى الخلايا للثقافة. تعريض المواد لنمط 365 نانومتر مصدر الأشعة فوق البنفسجية الضوء من خلال المجهر تستقيم تمكن التدهور المحلي للhytrogel من خلال photocleavage من س-nitrobenzyl مجموعات^16،17. يؤدي التحلل إلى إطلاق انتقائي للخلايا للتعافي من أجل تحليل المصب، بما في ذلك التحليل الجينومي، وربما، البروتيوميك والنص. الإعداد التجريبي والبروتوكول بسيطة نسبيا، وغير مكلفة، وترجمية إلى مختبرات علم الأحياء المجهرية. فإنه يتطلب فقط تغليف الخلية من خلال تشكيل الهيدروجيل، ومراقبة الخلايا الملتقطة مع المجهر مشرق تستقيم والمضان، وإضاءة الخلايا ذات الأهمية مع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية منقوشة لاسترجاعها.

ومن المزايا الرئيسية لهذا النهج القائم على المواد في الفحص قدرته على التكيف مع أشكال الفحص المختلفة. في شكله الأساسي ، يمكن استخدام المواد للفحص عن طريق تغليف مجموعة خلايا غير متجانسة في الهيدروجيلات السائبة. ثم يتم ملاحظة الخلايا للنمط الظاهري المطلوب ، ويتم إزالة الخلايا الفردية ذات الاهتمام لتوصيف الجينوم. في أشكال أكثر تفصيلا، يمكن أيضا دمج المواد في أجهزة مختبر على رقاقة لتوفير إطلاق الخلايا دقيقة واسترجاعها من المناطق المطلوبة من الجهاز. ويرد وصف كلا الشكلين هنا، وكلاهما مكن الحديثة رواية الفحص الميكروبي واختيار التطبيقات^17،18،19. ويتضح هذا الأسلوب هنا مع نموذج الكائنات الحية السلبية غرام(الإشريكية القولونية، Tumefaciens Agrobacterium) ونموذج كائن إيجابي غرام(عصيات subtilis)وقد تم تمديدها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من البكتيريا الأخرى.

Protocol

1. السلالات البكتيرية وبروتوكولات الثقافة

1. مستعمرات متتالية من البكتيريا على لوحات أجار تكملها وسائل الإعلام النمو المناسبة. في هذا التقرير، B. subtilis (سلالة 1A1135، يتم استزراع مركز الأسهم الوراثية عصيات على ATGN (0.079 M KH₂PO₄, 0.015 M (NH₄)₂SO₄, 0.6 mM MgSO₄·7H₂O, 0.06 mM CaCl₂·2H₂O, 0.0071 mM MnSO₄ H₂O, 0.125 M فيسو_4· 7H₂O, 28 mM الجلوكوز, درجة الحموضة: 7 ± 0.2, 15 غرام / لتر أجار) لوحات أجار تكملها مع 100 ميكروغرام / مل spectinomycin وE. القولونية (سلالة 25922, ATCC) على لوحات أجار ATGN تكملها 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
   ملاحظة: التقارير السابقة من تغليف هيدروجيل والإفراج مع هذه المواد من Fattahi وآخرون.¹⁹ بدلا من ذلك تستخدم A. tumefaciens C58 الخلايا
2. اختيار المستعمرات المطلوبة من لوحات أجار ATGN وبدء الثقافات بين عشية وضحاها. بالنسبة لسلالات الإشريكية القولونية وB. subtilis المستخدمة هنا ، والثقافة عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 215 دورة في الدقيقة في ATGN المتوسطة السائلة لمدة 24 ساعة. تخزين ثقافات الخلية في 50٪ الجلسرين في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام في المستقبل.
3. اختيار مستعمرات من كل من سلالات من مخزونات الجلسرين باستخدام حلقات التطعيم العقيمة واحتضان في وسائل الإعلام السائل ATGN لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 215 دورة في الدقيقة.

2. إعداد المواد اللازمة لتشكيل الهيدروجيل

1. PHOTODEGRADABLE PEG-س-NB-diacrylate التوليف
   ملاحظة: تم وصف توليفة داخلية من PEG-o-NB-diacrylate بشكل جيد وأبلغ سابقا^16،17. بدلا من ذلك، لأن التوليف هو روتيني، يمكن الاستعانة بمصادر خارجية من منشأة توليف الكيميائية.
2. المخزن المؤقت للربط المتداخل
   1. خذ وصفة الوسط المختار للسلالة البكتيرية واستعد الوسائط مع العناصر الغذائية 2x. إضافة الفوسفات، على سبيل المثال، NaH₂PO_4، إلى متوسط إلى تركيز نهائي من 100 mM. ثم قم بضبط قيمة درجة الحموضة إلى 8 باستخدام 5 M NaOH (aq).
   2. قم بتعقيم محلول المخزن المؤقت وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى يتم استخدامه مرة أخرى.
      ملاحظة: اترك أي معادن انتقالية موجودة في الوسائط، حيث تحفز هذه المعادن أكسدة ثيولز إلى ديبريتيدات.
3. PEG-س-NB-diacrylate الحل
   1. لكل ملغ من aliquot PEG-س-NB-diacrylate (3,400 دا الوزن الجزيئي) مسحوق, إضافة 3.08 ميكرولتر من المياه فائقة الشراء للوصول إلى تركيز 49 mM من PEG-س-NB-diacrylate (98 mM تركيز الأكريلات).
   2. دوامة الحل حتى يتم خلطه جيدا وتخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
4. 4 ذراع حل PEG-ثيول
   1. لإعداد PEG-thiol (10,000 Da molecular weight) ذو الذراعين، أضف 4 ميكرولتر من الماء فائق البور لكل مسحوق ملغ للوصول إلى تركيز 20 مللي متر (80 مللي متر من تركيز الثيول).
   2. دوامة هذا الحل حتى يتم خلطها بشكل جيد وتخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.

3. إعداد الأغطية البيرفلوروالكيلاتية (غير التفاعلية)

1. ضع ما يصل إلى 5 شرائح زجاجية (25 مم × 75 مم × 1 مم) داخل مرسل شرائح البولي بروبلين. Sonicate الشرائح مع 2 ٪ (ث / الخامس) محلول المنظفات (جدول المواد) لمدة 20 دقيقة.
2. شطف الشرائح ثلاث مرات مع المياه فائقة البور، ثم سونيكاتي الشرائح في الماء لمدة 20 دقيقة. جفف الشرائح باستخدام تيار N₂.
3. البلازما نظيفة (انظر جدول المواد)على جانبي الشرائح الزجاجية وفقا للبروتوكول في القسم 4.1 لمدة 2 دقيقة.
4. ضع الشرائح البلازما تنظيفها مرة أخرى في البريد الشريحة وملء الحاوية مع 0.5٪ (v/v) حل trichloro (1H، 1H، 2H، 2H، -perfluorooctyl)السيلان في التولوين. السماح لهذه الشرائح الزجاجية لتكون وظيفية لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. بعد أن يتم وظيفية الشرائح، شطف الشرائح داخل البريد الشريحة، أولا مع toluene والإيثانول المقبل (ثلاث مرات مع كل المذيبات). بعد ذلك، قم بتجفيف كل شريحة وظيفية مع تيار N₂.

4. إعداد ثيول وظيفية (قاعدة) coverlips

1. تنظيف الأغطية الزجاجية باستخدام منظف البلازما
   1. ضع أغطية 18 مم × 18 مم في طبق بيتري. ثم، ضع طبق بيتري في غرفة نظافة البلازما والتبديل على قوة نظافة البلازما.
   2. قم بتشغيل مضخة الفراغ لتطهير الهواء داخل الغرفة حتى يقرأ مقياس الضغط 400 mTorr.
   3. افتح صمام القياس للسماح بدخول الهواء إلى الغرفة حتى يصل مقياس الضغط إلى ضغط ثابت (800-1000 متور). ثم حدد RF مع وضع "مرحبا" وفضح coverlips لمدة 3 دقائق.
   4. بعد 3 دقائق، إيقاف وضع RF ومضخة فراغ.
   5. أخرج طبق بيتري من الغرفة، وقلب الأغطية، ووضعها مرة أخرى في الغرفة لكشف البلازما على الجانب الآخر من غطاء الزجاج.
   6. كرر الخطوات 4.1.2-4.1.4 لتنظيف البلازما الجانب غير المعالج من غطاء الزجاج.
   7. بعد الانتهاء من العملية، قم بإزالة طبق بيتري من الغرفة ثم قم بإيقاف تشغيل مكنسة البلازما ومضخة المكنسة الكهربائية.
2. تنظيف و hydroxylation من الأغطية مع محلول البيرانا
   ملاحظة: يمكن استخدام بروتوكولات تنظيف أسماك البيرانا القياسية لتنظيف وقسائم الزجاج الهيدروكسيلات. حل البيرانا هو خليط 30:70 (v/v) من H₂O₂ و H₂SO₄. ويمكن أيضا استخدام طرق بديلة لتنظيف الزجاج coverslips.
   تنبيه: محلول البيرانا هو تآكل بقوة ومتفجرة مع المذيبات العضوية وينبغي التعامل معها بحذر شديد. وينبغي تنفيذ تدابير السلامة والاحتواء المناسبة، مثل استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، ومئزر مقاوم للمواد الكيميائية، ونظارات السلامة، ودرع الوجه، وقفازات بوتيل مقاومة للحمض). يجب أن تكون جميع الأواني الزجاجية وأسطح العمل التي تتلامس مع محلول البيرانا نظيفة وجافة وخالية من المخلفات العضوية قبل الاستخدام. يجب ألا يتم تخزين محلول البيرانا في حاوية مغلقة أو مغلقة جزئيا.
   1. ضع طبق زجاجي نظيف مقاس 100 مم × 50 مم على ستيرر مغناطيسي ساخن مع سرعة تحريك قابلة للتعديل تحت غطاء الدخان وأضف 14 مل من H₂SO₄ إلى الطبق.
   2. ضع بلطف شريط اثارة مغناطيسي صغير مغلف بالتيفلون باستخدام ملقط مغلف بالتيفلون داخل الطبق. ثم، بدوره ستيرر ببطء لتجنب الرش من الحمض.
   3. بعد ذلك، أضف بلطف 6 مل من H₂O₂ إلى الطبق واترك الحل يصبح مختلطا جيدا.
   4. إيقاف الستيرر، ثم إزالة شريط اثارة من الطبق باستخدام ملقط. بعد ذلك ، ضع الأغطية برفق داخل الطبق باستخدام ملقط وحدد درجة الحرارة إلى 60-80 درجة مئوية.
   5. بعد 30 دقيقة، قم بإزالة الأغطية برفق باستخدام ملقط وغمرها في الماء deionized (DI) مرتين لغسل محلول البيرانا المتبقي.
   6. بعد الشطف بالماء، قم بتخزين الأغطية في مياه DI في RT حتى يتم استخدامها مرة أخرى.
   7. إيقاف hotplate والسماح للحل البيرانا لتبرد.
   8. للتخلص من محلول البيرانا، ضع بلطف طبق الزجاج مقاس 100 مم × 50 مم الذي يحتوي على محلول البيرانا المبرد في كوب زجاجي أكبر وفارغ لا يقل حجمه عن 1.5 لتر. ثم أضف 1 لتر من الماء لتخفيف وإضافة مسحوق بيكربونات الصوديوم لتحييد. لاحظ أن بيكربونات الصوديوم سوف يسبب توليد الفقاعات والحرارة وينبغي إضافته ببطء شديد ، وإلا فإن الفقاعات قد تؤدي إلى رش الحمض. عندما لا يسبب إضافة المزيد من بيكربونات الصوديوم فقاعات، تحقق من رقم الحموضة مع ورقة الحموضة للتحقق من أنه تم تحييدها. بمجرد تحييد الحل وتبريده ، يمكن سكبه أسفل الحوض.
3. ثيول الوظيفية من الأغطية
   1. إعداد حل 5٪ (v/v) من 269 mM من (3-mercaptopropyl) حل trimethoxysilane (MPTS) في التولوين الجاف.
   2. أضف 10 مل من المحلول إلى أنابيب الطرد المركزي المخروطية الفردية سعة 50 مل وضع غطاء واحد نظيف في كل أنبوب وغمره داخل المحلول.
      ملاحظة: يستخدم واحد coverslip لكل أنبوب 50 مل لضمان ثيوليشن من كلا الجانبين من الركيزة دون أن يزعجه الركائز الأخرى.
   3. بعد 4 ساعة، اغسل كل غطاء (أربعة يغسل لكل غطاء) مع الطولوين، الإيثانول 1:1 (v/v): خليط الطولوين، والإيثانول.
      ملاحظة: يتم ذلك عن طريق غمر كل غطاء بالتتابع في أنابيب الطرد المركزي المخروطية التي تحتوي على الحلول المذكورة.
   4. بعد شطف الركيزة، غمرها في الإيثانول وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
      ملاحظة: اعتمادا على عدد coverslips، يمكن أن تصبح هذه الطريقة شاقة بسبب علاج coverslips واحد في وقت واحد. بالنسبة إلى الأغطية المتعددة، يمكن استخدام جرار كولومبيا التي تناسب عدة قطع تغطية في نفس الوقت.

5. تصنيع صفائف السيليكون microwell

1. طلاء باريلين: استخدم البروتوكول القياسي الموصوف في المقالات البحثية السابقة^20،21 لمعطف رقائق السيليكون مع الباريلين.
2. التصنيع الدقيق: اتبع البروتوكول الذي وصفه باروا وآخرون¹⁸ لتصميم وتصنيع صفيف microwell(الشكل التكميلي 1).
   ملاحظة: تم تطبيق التقنيات الضوئية القياسية التي وصفها تيم وآخرون¹⁷ لتصنيع صفائف ميكروويل على رقائق السيليكون المغلفة بالباريلين.

6. تشكيل هيدروجيل

1. تشكيل هيدروجيل السائبة على الأغطية الزجاجية
   1. محلول السلائف الهيدروجيل: أضف 12.5 ميكرولتر من العازلة المتقاطعة إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 0.5 مل،يليه 5.6 ميكرولتر من محلول PEG-o-NB-diacrylate. وأخيرا، إضافة 6.9 ميكرولتر من محلول PEG-ثيول 4-الذراع إلى الخليط.
      ملاحظة: إضافة 4-ذراع PEG ثيول إلى الخليط يبدأ رد فعل الربط المتبادل. وهكذا، ينبغي استخدام محلول السلائف هيدروجيل مباشرة بعد الاختلاط.
   2. لتغليف الخلية في محلول السلائف هيدروجيل، اتبع الخطوات 6.1.3-6.1.9.
   3. لتغليف الخلية، قبل الخطوة 6.1.1، تلقيح المخزن المؤقت crosslinking مع كثافة الخلية المطلوبة. كما ذكر سابقا¹⁹، لوحظ أن كثافة الخلية من 7.26 × 10⁷ CFU / مل في العازلة crosslinking يرتبط كثافة ~ 90 خلية / ملم² مغلفة عبر الهيدروجيل.
   4. ضع غطاء القاعدة ثيولايد على طبق بيتري نظيف. ضع اثنين من الفواصل (انظر جدول المواد)على الجانبين المتعارضين من الغطاء.
      ملاحظة: ثيول الوظيفية من coverlips ضروري لمرفق التساهمي من هيدروجيل إلى سطح coverslip. ويتم ذلك من خلال رد فعل مجموعات ثيول على السطح ومجموعات الأكريلات الموجودة في محلول السلائف الهيدروجيل.
   5. إصلاح الفواصل على coverlip قاعدة عن طريق تسجيل الفواصل إلى طبق بيتري.
   6. ماصة الحجم المطلوب من محلول السلائف على غير التفاعلية، شريحة الزجاج perfluoroalkylated.
   7. ضع الشريحة الزجاجية البيرفلوروالكيلاتيد على غطاء القاعدة (الشكل 1C). انتظر لمدة 25 دقيقة في RT لتشكيل الهيدروجيل لإكمال.
   8. بعد الهلام، قم بإزالة الشريحة الزجاجية البيرفلوروالكيلات بلطف. سيبقى الهيدروجيل ملتصقا بالزلة الأساسية.
      ملاحظة: للحصول على 18 ملم × 8 مم coverslips للحصول على غشاء سمكه 12.7 ميكرومتر، استخدم ~ 7 ميكرولتر من محلول السلائف (الشكل 1A، B). استخدام كميات أكبر من محلول السلائف قد يؤدي إلى هيدروجيل تحت غطاء القاعدة. وهذا قد يسبب غطاء قاعدة التمسك طبق بيتري وكسر عند محاولة إزالة. أيضا، بقايا الهيدروجيل تحت غطاء هو إشكالية للفحص المجهري. مطلوب إزالة لطيف من الشريحة الزجاجية perfluoroalkylated غير التفاعلية كما إزالة سريعة يمكن أن تلحق الضرر هيدروجيل.
   9. ضع الركيزة في طبق بيتري مقاس 60 مم × 15 مم في وسائط ثقافية محددة. هنا، تم استخدام وسائط ATGN المكملة ب 100 ميكروغرام/مل سبكتينوميسين لB. subtilis أو 100 ميكروغرام/مل أمبيسلين لإيكولاي عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة من أوقات الثقافة.

الشكل 1: يتم وضعتشكيل هيدروجيل على أغطية الزجاج ثيولايد. (أ) يتم وضع الفواصل مع سمك 12.7 ميكرومتر على جانبين متعاكسين من غطاء قاعدة تحتوي على مجموعات ثيول التفاعلية. (ب) يتم إخراج محلول السلائف الهيدروجيل على شريحة زجاجية غير تفاعلية مفلورة. (ج)يتم وضع الشريحة الزجاجية غير التفاعلية على الفواصل لتشكيل هيدروجيل سميك 12.7 ميكرومتر. (D) تتم إزالة الشريحة الزجاجية غير التفاعلية بلطف ، وترك الهيدروجيل متصلا بالزلة الأساسية. (ه)يمكن احتضان الهيدروجيل المعد في وسائل الإعلام للثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. تشكيل هيدروجيل على صفائف ميكروويل

1. بذر البكتيريا في صفائف ميكروويل
   ملاحظة: تم بذر 700 ميكرولتر من 0.1 تعليق خلية OD₆₀₀ على ركائز صفيف microwell ، وتم تطبيق طريقة رفع الباريلين لإزالة الخلايا من الخلفية باستخدام البروتوكول الذي وصفه تيموآخرون. ^22.
2. إعداد حل السلائف هيدروجيل بإضافة 5.6 ميكرولتر من PEG-س-NB-diacrylate مع 12.5 ميكرولتر من درجة الحموضة 8 الفوسفات العازلة ATGN المالحة والاختلاط مع 6.9 ميكرولتر من محلول تيول PEG رباعي الذراعين.
3. Pipette 12.5 μL من حل السلائف على غير رد الفعل، شريحة الزجاج perfluoroalkylated ووضع اثنين من الفواصل الصلب 38 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على الجانبين المتعارضين من الركيزة صفيف microwell تلقيح مع الخلايا.
4. عكس الشريحة الزجاجية perfluoroalkylated مع قطرة حل السلائف ووضع قطرة في منتصف الركيزة microwell. ثم، احتضان لمدة 25 دقيقة في RT لتشكيل الهيدروجيل.
5. إزالة بلطف الشريحة الزجاجية من الركيزة microwell. يجب أن يبقى غشاء الهيدروجيل ملتصقا بركيزة microwell. انتقل إلى الخطوة 6.1.9.

8. إعداد المواد لاستخراج الخلية

1. إعداد حامل PDMS
   1. الشريط كومة من عشرة 18 × 18 ملم coverslips معا والغراء هذا المكدس من coverlips إلى الجزء السفلي من طبق بيتري.
   2. لتصنيع حاملي PDMS، مزيج PDMS السلائف وعامل المعالجة بنسبة 10:1 نسبة حجم في كوب من البلاستيك، ديغا الخليط في مجفف فراغ، ومن ثم صب الخليط في طبق بيتري.
   3. علاج PDMS لمدة 90 دقيقة في 80 درجة مئوية. ثم قطع حول كتلة مسجلة لإزالة حامل PDMS ووضع حامل PDMS على شريحة زجاجية لتسهيل التعامل مع المجهر.
2. إعداد الميكروسرينج والأنابيب
   1. قطع 20 سم من أنابيب PTFE (0.05 في I.D.) وإرفاق نهاية واحدة من الأنابيب إلى حقنة ميكرولتر 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: لاستخراج، وتجنب استخدام ماصة كما رسم الخلايا الصادرة عن طريق طرف ماصة يمكن أن تلحق الضرر سطح الهيدروجيل ويؤدي إلى التلوث.

9. تدهور هيدروجيل مع أداة الإضاءة منقوشة

ملاحظة: الخطوات التالية الموضحة في هذا القسم متطابقة لكل من هيدروجيلس السائبة وصفائف microwell باستثناء أنماط التعرض للضوء الموضحة في الخطوات 9.6.4-9.6.6 و 9.6.7-9.6.10.

1. تشغيل المجهر (انظر جدول المواد). ثم قم بتشغيل أداة الإضاءة المنقوشة (انظر جدول المواد).
2. قم بتشغيل وحدة التحكم التناظرية والرقمية لمصدر ضوء LED 365 نانومتر. بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة التحكم في مصدر ضوء LED.
3. فتح برنامج المجهر والبرمجيات لأداة الإضاءة منقوشة. عند فتح إطار تكوين الأجهزة، حدد الزر تحميل.
   ملاحظة: سيتم تحميل ثلاثة أجهزة هنا. (كاميرا خارجية ووحدة تحكم وأداة إضاءة منقوشة)
4. اضغط على زر البدء. سيتم الآن فتح نافذة برنامج النقش الخفيف. حدد الخيار الأول، وهو زر التحكم في الجهاز، على الشريط الجانبي الأيسر للنافذة.
5. معايرة أداة الإضاءة المنقوشة.
   ملاحظة: يجب إجراء المعايرة بنفس الهدف المجهر والمرشح الذي سيتم استخدامه للتعرض للضوء.
   1. تعيين الهدف المجهر إلى التكبير 10x.
      ملاحظة: يسمح هذا التكبير بمسافة عمل كافية بين عدسة المجهر وسطح العينة. كما يسمح بمراقبة وتسجيل عملية الاسترجاع في الوقت الحقيقي من خلال نافذة الصورة.
   2. قم بتعيين عدسة المجهر والفلتر إلى الإعدادات المستخدمة للتعرض للضوء ووضع مرآة المعايرة تحت المجهر.
   3. في إطار التحكم في الجهاز، اضغط على علامة التبويب التحكم في LED. قم بتشغيل LED # 1 وحدد شدة الضوء على الرقم المطلوب. في تجارب الاستخراج القياسية، يتم تعيين هذا إلى 60٪.
   4. اضغط على علامة التبويب التي تحمل اسم منتج أداة الإضاءة المنقوشة في إطار التحكم في الجهاز. ثم اضغط الزر إظهار الشبكة.
      ملاحظة: سيتم إسقاط نمط شبكة على مرآة المعايرة.
   5. ضبط التركيز المجهر والتعرض الكاميرا للحصول على جودة صورة عالية من الشبكة وتدوير الكاميرا لمحاذاة خطوط الشبكة موازية لإطار إطار الكاميرا، إذا لزم الأمر.
   6. حدد زر معالج المعايرة أسفل علامة التبويب بعنوان اسم منتج أداة الإضاءة المنقوشة واتبع الإرشادات التي يوفرها البرنامج في هذه النافذة.
      ملاحظة: سيتم فتح إطار إعداد كاميرا خارجية.
   7. سيتم فتح نافذة تحديد نوع المعايرة. حدد المعايرة التلقائية واضغط على التالي.
   8. عند فتح نافذة "تعديل المعايرة المسبقة"، اتبع إرشادات البرنامج، واضغط على الزر التالي.
   9. عند فتح إطار معلومات التعيين حفظ هذه المعايرة وفقا لذلك في المجلد المطلوب. ويتم ذلك عن طريق وضع في التاريخ ، اسم المجهر ، عدسة الهدف ، والمرشح.
   10. بعد المعايرة، اضغط على الزر تعريف منطقة العمل الموجود أسفل علامة التبويب بعنوان اسم منتج أداة الإضاءة المنقوشة لتحديد منطقة عمل أداة الإضاءة المنقوشة إذا لزم الأمر.
6. مقطع تصميم التسلسل لإعداد النمط.
   1. اضغط على الزر تصميم تسلسل على الشريط الجانبي الأيسر من إطار البرنامج. ثم اضغط على الزر محرر تسلسل التشكيل الجانبي.
   2. عند فتح إطار محرر تسلسل التشكيل الجانبي، حدد الخيار ملف تعريف جديد ضمن قائمة ملف التعريف.
      ملاحظة: الآن، سيتم فتح إطار محرر نمط.
   3. إعداد النمط المطلوب للتعرض للضوء عن طريق اختيار أشكال وأحجام مختلفة للأنماط، أو رسم النمط يدويا، إذا رغبت في ذلك.
   4. بالنسبة للأنماط العرضية للدوائر والممرات المكسورة للهيدروجيل السائب، اتبع الخطوات 9.6.5- 9.6.6
   5. بالنسبة لأنماط الدائرة، حدد دائرة قطرها 30 ميكرومتر فوق مستعمرة البكتيريا المستهدفة لتغطية المستعمرة بأكملها. اختر لون تعبئة الشكل باللون الأبيض.
   6. بالنسبة للأنماط المتقاطعة المكسورة، اختر شكل المستطيل من إطار رسم النقش بأبعاد 3 ميكرومتر × 8 ميكرومتر. ضع أربعة مستطيلات بهذا البعد على حواف المستعمرة المستهدفة ، في حين أن نصف الأنماط لها تراكب مع المستعمرة.
   7. بالنسبة لأنماط الدائرة والحلقة للصفائف microwell اتبع الخطوات 9.6.8-9.6.10.
   8. بالنسبة لأنماط الدائرة، ارسم دائرة قطرها 10 ميكرومتر حول محيط البئر. اختر لون تعبئة الشكل باللون الأبيض.
   9. لنمط حلقة، رسم دائرة قطرها 20 ميكرومتر، وضعه على البئر واختيار شكل ملء اللون الأبيض.
   10. رسم نمط دائرة أخرى من قطر 10 ميكرومتر مع ملء شكل اللون الأسود ووضعه حول محيط البئر.
7. تحرير نمط وتعديل الأشكال على أساس الأسلوب المطلوب استخراج. تأكد من وجود النمط المطلوب داخل منطقة عمل أداة الإضاءة المنقوشة.
8. ضع العينة في حامل PDMS وماصة الوسائط المحددة أعلى العينة لمنع جفاف العينة وتوفير حل الناقل للخلايا الصادرة.
9. ثم استبدل هذا بمرآة المعايرة.
10. ضبط المجهر التركيز للحصول على صورة حادة من المستعمرات داخل هيدروجيل. تفقد المستعمرات لتحديد مستعمرة ذات أهمية.
11. هنا، قم بتصميم أنماط الضوء بينما تظهر طريقة عرض الكاميرا المستعمرات داخل العينة لاختبار أنماط مختلفة لاستخراج الخلايا.
12. حفظ النمط المعرف. بعد حفظ النمط المعرف، حدد قسم التحكم في الجلسة.
13. في هذا القسم، ضمن علامة التبويب بعنوان اسم منتج أداة الإضاءة المنقوشة، أضف التسلسل المحفوظ.
14. بعد إضافة التسلسل، اختر الخيار لمحاكاة النمط لعرض الموقع المطلوب للتعرض وتعديله.
    ملاحظة: يمكن ضبط موقع العينة هنا لضمان توقع النمط بدقة على المنطقة المستهدفة.
15. بعد ذلك، قم بضبط شدة الضوء إلى 60٪ ووقت التعرض إلى 40 ثانية تحت علامة التبويب التحكم LED وابدأ عملية التعريض الضوئي.
16. مراقبة تدهور الهيدروجيل في الوقت الحقيقي ووضع brightfield لضمان إطلاق الخلية.
    ملاحظة: منع أي تحركات للعينة أثناء التعرض للضوء لأنها يمكن أن تسبب تدهور المناطق غير المرغوب فيها من الهيدروجيل مما يؤدي إلى التلوث المتبادل.

10. استرجاع الخلية

ملاحظة: إجراء استرداد الخلية متطابقة لكل من hydrogels السائبة وصفوف microwell.

1. بعد التعرض للضوء 365 نانومتر وإطلاق الخلية، وجمع الخلايا باستخدام حقنة microliter وأنابيب microfluidic(الشكل 2).
   ملاحظة: يجب أن يتم استرجاع الخلية مباشرة بعد التعرض للنمط. يسمح هذا لاسترداد الخلية المترجمة قبل الخلايا التي تم تحريرها الابتعاد عن المنطقة المشععة.
2. تغيير المجهر من برايتفيلد إلى فلتر FITC أو TRITC للسماح تصور المنطقة المكشوفة للعينة بالعين المجردة.
3. بمجرد أن تقع المنطقة المكشوفة ، ضع نهاية الأنبوب على البقعة المشععة. ثم تغيير مرشح المجهر مرة أخرى إلى brightfield لمراقبة استرجاع الخلية في الوقت الحقيقي.
4. استخدم الحقنة المرفقة بالطرف الآخر من الأنبوب لسحب الخلايا الصادرة بعناية. سحب 200 ميكرولتر من المحلول وإدراج المحلول في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل لتحليل الحمض النووي أو الطلاء.

الشكل 2: التمثيل التخطيطي لطريقة استخراج لجمع الخلايا الصادرة من هيدروجيل. هنا ، مباشرة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر ، وتدهور الهيدروجيل ، وإطلاق الخلايا ، يتم استخدام المجهر لإلقاء الضوء على عينة الهيدروجيل مع الضوء من مرشح TRITC ، مما يؤدي إلى بقعة خضراء ساطعة تغطي المنطقة التي حدث فيها إطلاق الخلية. ويساعد ذلك المستخدم في تحديد الموقع المكاني لجمع العينات. بعد تصور هذه المنطقة ، يتم وضع أنابيب التجميع المرفقة بحقنة ميكروليتر في هذه البقعة ويتم جمع العينة. يتم استخدام المجهر برايتفيلد في التكبير 10x لرصد نهاية الأنابيب وسطح الهيدروجيل في الوقت الحقيقي لجمع الخلايا دقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

11. تنقية الحمض النووي الجينومي وقياس جودة الحمض النووي

1. استخدام مجموعة تنقية الحمض النووي (انظر جدول المواد)لاستخراج الحمض النووي من عزل البكتيريا.
   1. اتبع مواصفات الشركة المصنعة الموضحة في دليل مجموعة تنقية الحمض النووي²³ حتى الخطوة الأخيرة (الخطوة 7) ، مما يتطلب elution مع Buffer AE.
   2. بالنسبة لخطوة elution، اتبع مواصفات الشركة المصنعة، مع اختلاف استخدام 100 ميكرولتر من Buffer AE بدلا من 200 ميكرولتر.
   3. كرر الإلتواء مرة واحدة كما هو موضح في الخطوة 11.1.2. هذه الخطوة تؤدي إلى زيادة العائد العام للحمض النووي.
2. قياس جودة الحمض النووي باستخدام مطياف UV-Vis (انظر جدول المواد).
   1. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي. بعد تهيئة الجهاز، على الصفحة الرئيسية، حدد الخيار dsDNA على الشاشة.
   2. بعد ذلك، ارفع ذراع التمثال وانظف وضعية التمثال بماء DI ومناديل خالية من الوبر.
   3. ماصة 2 ميكرولتر من حل فارغ، هنا AE العازلة، على موقف التمثال وجلب بلطف الذراع التمثال إلى أسفل وحدد فارغة على الشاشة.
   4. بعد ذلك، ارفع التمثال وانظف موضع التمثال بماء DI لإزالة أي مواد متبقية من القياس السابق.
   5. قم بتحميل العينة (2 ميكرولتر) على موضع قاعدة التمثال، واحضر ذراع قاعدة التمثال لأسفل، وحدد زر القياس على الشاشة.
   6. إعادة الخطوات 11.2.4 و 11.2.5 لجميع العينات.
   7. بمجرد الانتهاء من القياس، حدد "إنهاء التجارب" على الشاشة. أدخل محرك أقراص الفلاش في الجهاز واضغط على "تصدير البيانات" على الشاشة.

12. تحديد صلاحية الخلية من مستخلصات الهيدروجيل والميكروويل

1. تمييع التعليق البكتيري بعامل تمييع 10⁵ باستخدام لوحة 96 بئرا.
2. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق البكتيرية المخفف وبقعة ثلاث مرات على لوحات ATGN لكل تعليق البكتيريا.
3. إمالة لوحات لنشر الخلايا على أسطح أجار. الهواء الجاف لوحات ATGN التي تحتوي على تعليق البكتيرية.
4. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. عد أرقام وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) وسجلها. عد جميع ينتشر الثلاثة من تعليق البكتيرية على كل لوحة.
   ملاحظة: تنفيذ الخطوات 12.1-12.4 في خزانة السلامة البيولوجية لتجنب تلوث لوحة.

Results

للتحقيق في قدرة ضوء الأشعة فوق البنفسجية على إحداث تدهور الهيدروجيل الخاضع للرقابة لإطلاق الخلايا ، تم تغليف الهيدروجيلات أولا فوق الأغطية الثيولايد دون وجود البكتيريا. تعرض كل هيدروجيل لثلاثة أنماط دائرة متكررة من الضوء في كثافة وأوقات التعرض المختلفة. تم حساب تدهور هلام النسبة المئوية بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في كل كثافة ضوء ، ثم تم قياس وقت التعرض عن طريق اقتران مجموعات ثيول قلادة مع صبغة فلوريسين-5-maelimide للتصوير الفلوري^19،24. ويظهر مثال تمثيلي عن كيفية تأثير هذين المعلمين على تدهور الهيدروجيل في الشكل 3. وكما هو واضح، فإن الضوء المنقوش الذي توفره أداة الإضاءة المنقوشة يوفر التحكم المكاني والزماني لتدهور الهيدروجيل بدقة يمكن أن تمكن من إطلاق عدد قليل فقط من الخلايا.

الشكل 3:السيطرة على تدهور الهيدروجيل. جرعة ضوء الأشعة فوق البنفسجية وما ينتج عن ذلك من معدل تدهور الهيدروجيل غير قادرين عن طريق أداة الإضاءة المنقوشة. (مجموعة داخلية) تم اختيار اثنين من كثافة الضوء المختلفة لتدهور الهيدروجيل المنقوش. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر، وصفت الهيدروجيلات مع الفلوريسين-5-maleimide للتصوير الفلوري. أعيد طبعها (تكييفها) بإذن من Fattahi وآخرون¹⁹ حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لاستخراج الخلية، استخدمت أنماط ضوء مختلفة للتحقيق في إطلاق الخلية (الشكل 4). هنا، تم تغليف خلايا البكتيريا Agrobacterium في هيدروجيلس السائبة على الأغطية الزجاجية ثيولايد، ثم استزراعها في المستعمرات الصغيرة. ثم تم فحص الهيدروجيل في المجهر برايتفيلد، وتعرضت المستعمرات الدقيقة المستهدفة لأنماط مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية. ولوحظ أن أنماط التعرض المختلفة أثرت على مورفولوجيا الخلايا المفرج عنها. هذا هو مفيد محتمل للتطبيقات المختلفة. على سبيل المثال، فضح نمط حلقة حول مستعمرة الهدف النتائج في الإفراج عن مستعمرة بأكملها لا تزال مغلفة في هيدروجيل PEG واقية ودون التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية(الشكل 4A)،والتي قد تحافظ على الخلايا وتوفير تنقية المصب سهلة. في المقابل، من خلال تعريض جزء أو كل من مستعمرة للأشعة فوق البنفسجية، يمكن استخراج الخلايا إما كتجمعات الخلايا المجمعة(الشكل 4B)أو كما الحرة، والخلايا الفردية (الشكل 4C).

الشكل 4: السيطرة على مورفولوجيا الخلايا المستخرجة. (أ) استخدام نمط حلقة للافراج عن مستعمرة الخلية بأكملها، محمية في مصفوفة PEG. (ب) استخدام نمط تقاطع مكسور لتحرير الخلية في التجميعات. (ج) استخدام نمط الصليب للافراج عن خلايا فردية. أعيد طبعها (تكييفها) بإذن من Fattahi وآخرون.

حاسمة في بروتوكول التغليف هو كل من كثافة البذر الخلية وسماكة الهيدروجيل، كما يمكن أن تؤثر على كل من هذه المعلمات على عدد من الخلايا المدرجة في هيدروجيل للمراقبة. ولإثبات ذلك، تم تغليف عينات خلايا A. tumefaciens في هيدروجيلس بسماكتين مختلفتين باستخدام الفواصل الرقيقة (12.7 ميكرومتر) أو الفواصل السميكة (40 ميكرومتر) المستزرعة، والمصورة وفقا للبروتوكولات المعمول بها. أدى الهيدروجيلات الأرق إلى كثافة مستعمرات صغيرة تبلغ 90 مستعمرة /مم² في جميع أنحاء الهيدروجيل ، حيث لوحظ تداخل الحد الأدنى للمستعمرة(الشكل 5A). في المقابل، أدى سمك الهيدروجيل أكبر من 12.7 ميكرومتر في تشكيل مستعمرات متداخلة في الاتجاه الرأسي(الشكل 5B)،مما قد يؤدي إلى استخراج مستعمرات متعددة. يمكن أن يسبب تداخل المستعمرات تلوثا متقاطعا أثناء الاستخراج بسبب الطبيعة ثنائية الأبعاد لنمط الضوء. على سبيل المثال، يمكن استهداف مستعمرة عليا، في حين يتم استخراج مستعمرة أساسية أيضا معها(الشكل 5C). لذلك، باستخدام الفواصل 12.7 ميكرومتر ينصح لإعداد هيدروجيل.

الشكل 5: سمك هيدروجيل يؤثر على نقاء الاستخراج. (أ)باستخدام الفواصل بسماكة 12.7 ميكرومتر لتشكيل الهيدروجيل، تتشكل المستعمرات داخل طائرة محورية واحدة 10x. (ب)يمكن ملاحظة تراكب المستعمرات عند التكبير 10x إذا تم استخدام الفواصل ذات سمك أكبر من 12.7 ميكرومتر. (ج)يمكن أن يحدث التلوث المتبادل مع تراكب المستعمرات أثناء إطلاق الخلية: (1) يتم استخدام نمط حلقة لإطلاق مستعمرة الخلية المستهدفة، (2) مستعمرة الخلية المستهدفة تصبح منفصلة عن الهيدروجيل، و (3) ثانية، تتم ملاحظة مستعمرة كامنة أثناء التعرض للضوء تحت المستعمرة المستهدفة. تتم إزالة هذه المستعمرة أيضا، مما أدى إلى التلوث المتبادل. أعيد طبعها (تكييفها) بإذن من Fattahi وآخرون¹⁹ حقوق الطبع والنشر 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ونظرا للضرر المحتمل للبكتيريا مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية، ودرس تأثير المتنوعة الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة micropatterns على صلاحية الخلية باستخدام نموذج، البكتيريا إيجابية الغرام(B. subtilis)ونموذج، البكتيريا السلبية غرام(E. coli). تم تغليف كل منها داخل الهيدروجيلات السائبة وتثقف في مستعمرات صغيرة الحجم وفقا للبروتوكولات القياسية ، والتحقق من توافقها مع الهيدروجيل. ثم تعرضت المستعمرات الدقيقة المستهدفة ذات الأحجام المكافئة (قطر 26 ± 1 ميكرومتر) لجرعة ضوء ثابتة (168 مج/ملم^2)،إما في شكل أنماط دائرة تعرض الألوان الدقيقة بأكملها للأشعة فوق البنفسجية أو الأنماط المتقاطعة التي تتحلل فقط حواف الهيدروجيل لتقليل التعرض للضوء إلى الخلايا. ثم تم استرداد الخلايا ومطليتها لتحديد كميا CFU / mL تعافى من كل مستعمرة. لم يتم العثور على فرق كبير في مستوى استرداد الخلية(الشكل 6A). ولزيادة التحقيق في نقاء الخلايا المستخرجة، تم استخراج الحمض النووي من عينات الإشريكية القولونية وتحليله باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. لكلا النمطين، تقع مستويات جودة الحمض النووي ضمن نطاق A₂₆₀/A₂₈₀ بين 1.8 و 2.0 (الشكل 6B)، والذي هو في النطاق المثالي لتسلسل الجينوم²⁵. وهذا يدل على أن أنماط الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة للإفراج في ظل الظروف الموصوفة لها تأثير ضئيل على كمية الخلايا القابلة للحياة التي تم استردادها من الهيدروجيلات السائبة أو على جودة الحمض النووي الجينومي بعد الاستخراج.

الشكل 6: تأثير أنماط التعرض للضوء المختلفة على صلاحية الخلية وجودة الحمض النووي للبكتيريا الصادرة من الهيدروجيلات السائبة. (أ) مستويات استعادة الخلايا لكل من الإشريكية القولونية وB. subtilis بعد الاستخراج باستخدام أنماط الصليب وأنماط الدائرة. لهذه التجربة، تم الاستخراج من المستعمرات الكروية ذات القطر نفسه (26 ميكرومتر ± 1 ميكرومتر) لضمان أن عدد الخلايا المفرج عنها من كل مستعمرة كان مكافئا. ثم تم طلاؤها الحلول المستخرجة لحساب CFU / مل المكتسبة من كل نمط. ولم يظهر التحليل الإحصائي أي فرق كبير في CFU/mL تم الحصول عليه من أنماط الصليب والدائرة لكل من الإشريكية القولونية وB. subtilis (P-value > 0.05، n = 6 لكلا النوعين). (ب)القياس الكمي الطيفي لجودة الحمض النووي لخلايا الإشريكية القولونية المعزولة باستخدام أنماط الصليب والدائرة. هنا، لم يظهر التحليل الإحصائي فرقا كبيرا في جودة الحمض النووي للأنماط المستخدمة (P-value > 0.05، n = 6) (C) صور Brightfield للمستعمرات ذات الأقطار المتساوية المعرضة لأنماط الصليب والدائرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

توفر صفائف Microwell واجهة فحص بديلة تعمل على رقاقة تقدم ميزات فحص أكثر تحكما مقارنة ب الهيدروجيلات السائبة. على سبيل المثال، تمكن صفائف microwell من بذر البكتيريا في مواقع ثقافية منفصلة حيث يمكن التحكم في عدد الخلايا في الخلايا. كما يتم التحكم في السمات الهندسية للماكروويلات مثل عمق الآبار وقطرها من خلال طرق التصنيع الدقيق القياسية. مع هذه الفوائد، كانت الماكروويلات مفيدة لدراسة نمو البكتيريا تحت الحبس المكاني^26،ومؤخرا لاكتشاف التفاعلات التكافلية والعدائية بين الأنواع البكتيرية المختلفة عندما تقتصر معا في microscale¹⁸. استخراج الخلوية من الآبار للتحليل الجينومي مثل تسلسل amplicon 16S أمر بالغ الأهمية لهذه التطبيقات. باستخدام نفس المواد الهيدروجيل، يمكن أن يتعرض ضوء الأشعة فوق البنفسجية على بئر تحتوي على خلايا ذات أهمية، إما كأنماط دائرة أو حلقة. وهذا الأخير يضمن تدهور الهيدروجيل فقط في محيط ميكروويل لمنع التشعيع المباشر للخلايا. لإثبات ذلك ، تم زرع خلايا A. tumefaciens التي تعبر عن mCherry في الآبار ، ثم تم إرفاق الهيدروجيل بمجموعة microwell. تم استزراع الخلايا ثم تشعيعها إما بأنماط دائرة أو حلقة. ثم لطخ الغشاء بصبغة الفلورسين-5-ماليميد. كشفت صور مضان لونين أن كل من الغشاء والخلايا داخل الآبار تتم إزالتها لكلا أنماط التشعيع¹⁷. على عكس تنسيق هيدروجيل السائبة، وقد لوحظ استخراج الخلية هنا فقط في شكل مجموعات الخلية¹⁸.

الشكل 7:صور المجهر البؤري التمثيلي التي تظهر تأثير نمط الضوء على عزل الخلية من صفائف microwell. (أ)Microwells بأقطار 40 ميكرومتر تحتوي على البكتيريا (الحمراء) بعد البذر والثقافة. (ب) التعرض للضوء باستخدام أنماط الدائرة والحلقة (الأزرق). (ج)انخفاض الفلورسينس الأحمر يدل على أن الخلايا يتم استخراجها من الآبار المشععة. (د) صورة مضانة لونين من الأغشية والبكتيريا بعد التشعيع، مما يدل على إزالة كل من الهيدروجيل (الأخضر) والبكتيريا (الحمراء) من الآبار المستهدفة. (ه) Z-كومة، صورة مضان لونين من الآبار المستهدفة. يشير الخط الأحمر في (D) إلى مستوى xz المصور في (E)، والخط الأخضر في (E) يدل على مستوى xy المصور في (D). تم غسل عينات في الصور(C-E)لإزالة الخلايا الصادرة ، ثم تم إصلاحها وصورتها. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. أعيد طبعها (تكييفها) بإذن من فان دير Vlies^{وآخرون.} حقوق الطبع والنشر 2019 Soceity الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لقياس قدرة خلايا البكتيريا على البقاء وجودة الحمض النووي بعد الاستخراج في هذا الشكل ، تم بذر خلايا B. subtilis و E. coli ، واستزراعها ، ثم إطلاقها من صفائف microwell باستخدام أنماط الدائرة والحلقة(الشكل 8A، B). ثم تم طلاء الخلايا المفرج عنها على لوحات أجار ATGN، وتم قياس جودة الحمض النووي للخلايا المستخرجة كميا. لضمان وجود عدد ثابت من الخلايا أثناء كل عملية استخراج، استهدفت بويلات صغيرة ذات كثافة فلورية مماثلة (~6000 وحدة أمريكية) وبالتالي تم استهداف عدد مماثل من الخلايا للإفراج عنها. عدد الخلايا القابلة للحياة المستخرجة باستخدام نمط دائرة لا يختلف اختلافا كبيرا عن عدد الخلايا القابلة للحياة المستخرجة باستخدام نمط حلقة لأي من البكتيريا(الشكل 8C). أيضا، لم تكن مستويات جودة الحمض النووي تختلف اختلافا كبيرا بين الدائرة وأنماط حلقة لأي من البكتيريا(الشكل 8D). ومن ثم، وعلى غرار النتائج التي تم التوصل إليها في الهيدروجيلات السائبة، كان لتطبيق الأشعة فوق البنفسجية في شدة ومدة المحددة هنا تأثير ضئيل على صلاحية ونوعية الحمض النووي للخلايا المستخرجة من صفائف microwell. وتبين هذه النتائج أن خلايا البكتيريا القابلة للحياة يمكن استرجاعها بشكل انتقائي من الخلايا الدقيقة مع الحد الأدنى من الضرر لتحليل المصب.

الشكل 8:تأثير أنماط التعرض للضوء المختلفة على صلاحية الخلية وجودة الحمض النووي للبكتيريا المنبعثة من صفائف microwell. (أ,ب) لكل من الإشريكية القولونية وB. subtilis، تم استخدام أنماط الدائرة وأنماط الحلقة لاستخراج الخلايا من 10 ميكروويلات ميكروويل. تم استخدام نمط الدائرة بقطر 10 ميكرومتر ونمط الحلقة بقطر داخلي يبلغ 10 ميكرومتر وقطر خارجي يبلغ 20 ميكرومتر في هذه التجربة لاستخراج الخلايا. واستخدمت بويلات صغيرة بنفس القطر لضمان أن يكون عدد الخلايا المنبعثة من كل ميكروويل هو نفسه. (ج)ثم مطلي الحلول المستخرجة لحساب CFU / مل المكتسبة من كل نمط التعرض. ولم يظهر التحليل الإحصائي أي فرق يعتد به في CFU/mL الذي تم الحصول عليه من نمط الدائرة والحلقة لكل من الإشريكية القولونية وB. subtilis (P-value > 0.05، n = 6 لكلا النوعين). (د)تم استخدام قياس الطيف لقياس جودة الحمض النووي لكل من خلايا الإشريكية القولونية وB. subtilis باستخدام أنماط الدائرة والحلقة. هنا، لم يظهر التحليل الإحصائي أي فرق كبير في جودة الحمض النووي للأنماط المستخدمة (P-value > 0.05، n = 6 لكلا النوعين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تصميم وتصنيع صفائف ميكروويل. (أ)تم تطبيق تقنيات التصنيع الدقيق القياسية لتصنيع صفائف microwell على رقائق السيليكون. (ب) تألف كل ركيزة من 7 × 7 صفائف من آبار قطرها 10 ميكرومتر مع عمق 20 ميكرومتر و30 ميكرومتر في الملعب. (ج)كل صفيف يتكون من 225 ميكروويل. وقد تم تعديل هذا الرقم من باروا وآخرون¹⁸. حقوق الطبع والنشر 2021 الحدود وسائل الإعلام. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

توضح هذه المخطوطة استخدام الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا وعزلها. تمكن المواد والنهج ثقافة عالية الإنتاجية ، والسيطرة على وسائل الإعلام النمو وظروف النمو ، واستخراج الخلايا نظيفة ودقيقة بطريقة واضحة وفعالة من حيث التكلفة. استخراج يتطلب فقط المجهر الفلورسنت إلى جانب أداة الإضاءة منقوشة ويمكن القيام به بطريقة متتابعة لعزل أهداف الخلايا المتعددة. كل استخراج يستغرق 5-10 دقيقة لأداء، وتم إزالة ما يصل إلى 30 المستعمرات المستهدفة من هيدروجيل واحد. ومن المزايا الرئيسية للنهج قدرته على التكيف مع مجموعة متنوعة من أشكال المقايسة المختلفة، كما يتضح هنا مع الفحص من كل من الهيدروجيلات السائبة وصفائف microwell. وقد استخدمت عملية الفصل في كلا الشكلين بنجاح لعزل البكتيريا التي تظهر سلوك النمو الفريد للجنوة المصب بعد الثقافة والمراقبة المجهرية، وهي قدرة حاسمة لربط النمط الجيني الخلية إلى النمط الظاهري. حتى الآن ، وشملت التوصيفات الجينومية للبكتيريا المستخرجة من هذه الواجهات تسلسل 16S amplicon لتحديد مجموعات متعددة الأنواع من البكتيريا من الميكروبيوم البيئية التي تولد سلوك النمو الناشئ¹⁸، وتسلسل الجينوم الكامل لتحديد بنجاح الطفرات الوراثية التي تسبب ملامح النمو النادر في الخلايا الموجودة داخل المكتبات المتحولة¹⁹.

استخدام الهيدروجيلات السائبة لفحص الخلايا والعزل هو الشكل الأكثر مباشرة وبسيطة. تتشكل الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي السائبة بسرعة (25 دقيقة) بعد خلط السلائف على أغطية زجاجية شفافة لتغليف الخلايا في مصفوفة ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد التي يتم تصويرها بمجهر مضان قياسي مستقيم أو مقلوب. وبالتالي، فإن هذه الطريقة لديها القدرة على أن تكون تحويلية إلى مختبرات الأحياء المجهرية المشتركة التي ليس لديها موارد أو خبرة في التصنيع الدقيق. عيب في هذا الشكل هو أن الخلايا هي موجهة عشوائيا في جميع أنحاء هيدروجيل ثلاثي الأبعاد. لذلك، يمكن أن تظهر الخلايا خارج المستوى البؤري عند التصوير مع أهداف التكبير أعلى واستخراج يمكن أن يكون من الصعب إذا كانت مستعمرات الخلايا موجهة قريبة جدا من بعضها البعض أو إذا كان هناك تراكب عمودي من المستعمرات. إيداع هيدروجيل رقيقة (<13 ميكرومتر) كما هو موضح أمر بالغ الأهمية للتخفيف من هذا العيب. التعرض في أنماط الضوء عبر مكسورة (الشكل 4B) هو الأفضل هنا، وهذا النمط يؤدي إلى خلايا خالية من الهيدروجيل التي لديها الحد الأدنى من التعرض للأشعة فوق البنفسجية ويمكن استردادها بسهولة من خلال الطلاء.

في المقابل، يوفر تنسيق صفيف microwell واجهة أكثر تحكما، حيث يتم تقسيم خلايا البكتيريا إلى ميكروويلات منفصلة تعمل كمواقع ثقافة صغيرة أو ثقافات مشتركة^17و18و26. يتم تصنيع البعد والملعب والكثافة الدقيقة بدقة باستخدام التقنيات الضوئية القياسية. بالمقارنة مع الهيدروجيلات السائبة ، يمكن استخراج البكتيريا من صفائف microwell بدرجة أعلى من التحديد وفرصة أقل للتلوث المتبادل ، حيث أن الخلايا موجودة فقط في مواقع محددة مسبقا ، وليس موزعة عشوائيا في جميع أنحاء الهيدروجيل. تركيز ونسب خلايا البكتيريا في محلول البذر يمكن أيضا أن تختلف للسيطرة على كمية وتكوين inoculum microwell من خلال عملية البذر التي تم وصفها في التقارير السابقة²⁶، مما يعطي المستخدم المرونة في التصميم التجريبي للشاشة. العيب الرئيسي للفحص مع شكل صفيف microwell هو الوقت الإضافي والخبرة اللازمة ل microfabrication. وقدرت تكلفة تصنيع الحيوانات الدقيقة بحوالي 10 دولارات لكل صفيف، بما في ذلك تكاليف المواد ونفقات غرف التنظيف. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما تكون صفائف microwells مصنوعة من السيليكون ، مما قد يسبب صعوبات في التصوير لأن الركائز غير شفافة. وعلاوة على ذلك، فإن كمية عالية من الضوء المتناثر من سطح السيليكون يمكن أن تحد من التصوير داخل microwells ويمكن أن تقلل من دقة النمط أثناء التعرض الهيدروجيل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية من أداة الإضاءة منقوشة (ينظر في الشكل 8A،B). وقد تم تلفيق microwells مماثلة على ركائز الكوارتز شفافة لمعالجة هذه الأنواع من القيود²⁷; ومع ذلك ، فإن هذا تلفيق هو أكثر صعوبة بكثير. التعرض لأنماط الحلقة التي تضيء محيط البئر هو الأفضل هنا لتحرير الخلايا الحرة من الآبار مع تقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

المشكلة الأكثر شيوعا التي تحدث في أي شكل من الأشكال هو انفصال الهيدروجيل من الركيزة الكامنة خلال الثقافة بسبب تورم الهيدروجيل. إذا كانت هذه مشكلة بالنسبة للهيدروجيلات السائبة، فيجب التحقق من وجود وكثافة وتوحيد مجموعات ثيول في طبقة المرفق الكيميائية (MTPS) عبر سطح غطاء الزجاج الأساسي باستخدام تقنية توصيف سطحي مناسبة (XPS و ATR-FTIR و AFM وما إلى ذلك). الكثافات المنخفضة لمجموعات ثيول السطحية بسبب عدم كفاءة التشغيل السطحي يمكن أن تؤدي إلى تفاعل ضعيف بين الركيزة والهيدروجيل. إذا حدث مستوى منخفض من التكثير السطحي، يجب التحقق من استقرار حل MTPS. يجب توخي الحذر عند التنظيف الأولي للشريحة الزجاجية لضمان سطح نظيف قبل معالجة MTPS ، ويجب توخي الحذر لضمان استخدام التولوين اللامائية أثناء تفاعل سطح MTPS (قسم البروتوكول 4). في حالة صفائف microwell ، لا يتم thiolated السطوح ، وhyedrogels نعلق بدلا من ذلك من خلال ملء جزئي للأبار مع الهيدروجيل ، الذي يرسو الهيدروجيل إلى ركيزة السيليكون¹⁷. إذا كان مفرزة الهيدروجيل مشكلة في هذا النظام ، يمكن حفر المزيد من microwells أو غيرها من الميزات الصغيرة في الصفيف لزيادة ترسيخ الهيدروجيل إلى الركيزة لتعزيز ارتباط أقوى.

وهناك قيود على هذه التقنية في أي شكل من الأشكال هو الاستقرار المحدود للهيدروجلز في وجود البكتيريا. وقد لوحظ أن بعض البكتيريا، مثل A. tumefaciens،يمكن أن تتحلل الهيدروجيل على مدى 5-7 أيام^17،19، مما يحد من وقت التجربة. ويجري حاليا بحث آليات التحلل البكتيري؛ فمن المفترض أن مجموعات إستر موجودة من مونومرات diacrylate تخضع للتحلل المائي بوساطة البكتيريا و / أو التدهور الأنزيمي، كما لوحظ في النظم الأخرى¹⁷. تطوير كيمياء هيدروجيل أكثر استقرارا سوف تمتد الوقت الذي البكتيريا يمكن أن تبقى في الهيدروجيل وسوف تمتد الشاشة إلى الكائنات الحية الدقيقة مع معدلات نمو أبطأ. والقيود الثانية هي أن استعادة الخلايا واستخراجها يحدثان في بيئة مفتوحة، مما يؤدي إلى كميات استخراج عالية نسبيا (30-100 ميكرولتر)، والتي يمكن أن تكون عرضة للتلوث الخارجي. وبالتالي، يجب توخي الحذر لضمان وجود خلايا كافية من المستعمرات المستهدفة مع تقليل حجم محلول الاستخراج. للحصول على ما يكفي من الخلايا للطلاء والانتعاش أو لاستخراج مواد الحمض النووي، لوحظ أنه في الهيدروجيلات السائبة، يجب زراعة الخلايا لفترة كافية للوصول إلى أقطار مستعمرة لا تقل عن 10 ميكرومتر. لخفض حجم المطلوب لاستخراج الخلية، لوحظ أن استخدام حقنة microliter والأنابيب (الشكل 2) كان أكثر كفاءة من pipetting. سمح الأنابيب بانساق العزلات من نقطة الإطلاق بدقة أكبر ، مما يتطلب حجم حل أقل ويقلل من فرصة التلوث.

العمل في المستقبل ينطوي على فهم تأثير الخصائص الميكانيكية هيدروجيل على نمو الخلايا، كما يتم التحكم بشكل جيد السمات الميكانيكية لهذه الهيدروجيلات من خلال اختيار السلائف المونومر PEG المستندة المناسبة من مختلف الأوزان الجزيئية^28،والتفاعلات الميكانيكية من المرجح أن تلعب دورا هاما في سلوك البكتيريا²⁹. وبما أنه يمكن دمج مواد الهيدروجيل بسهولة في مجموعة متنوعة من الأنظمة والأجهزة المختلفة، فإن المزيد من التطوير يركز أيضا على دمج هذه المواد في أنظمة microfluidic. وهذا من شأنه أن يقلل من حل استخراج ل femtoliter إلى أحجام picoliter، مقارنة مع التقليدية 30-100 ميكرولتر المجلدات المطلوبة حاليا في شكل جمع مفتوحة. ومن شأن أحجام الحلول الأصغر أن تقلل إلى حد كبير من التلوث المحتمل وأن تحرك النهج نحو عزل الخلية الواحدة وتوصيفها.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl) triethoxysilane	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95٪
مسحوق منظف Alconox	Alconox	1104
كبريتات الأمونيوم	فيشر الكيميائية	A702-500	معتمد ACS الأوتوكلاف الحبيبي
SK300C	ياماتو Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	مركز العصيات الوراثية	1A1135
مجهر برايتفيلد المستقيم	Olympus Corporation	BX51
كلوريد الكالسيوم ،	فيشر الكيميائي	اللامائي C614-500	لكريات المجففات ، 4-20
شبكة الطرد المركزي 5702	Eppendorf	5702
حامض الستريك أحادي الهيدرات	Sigma-Aldrich	C1909-500G	كاشف ACS ، > 99.0٪
D-Glucose ( سكر العنب)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & amp مجموعة الأنسجة	Qiagen	69504	طقم تنقية الحمض النووي
DOWSIL 184 قاعدة مطاط معدني من السيليكون	Dow Sillicones Corporation		درجة حرارة التخزين: -30-60 درجة ؛ C
DOWSIL 184 عامل معالجة المطاط الصناعي السيليكون	Dow Sillicones Corporation		درجة حرارة التخزين: < 32 C
EPOCH2 مقياس الطيف الضوئي الدقيق	BioTek Instruments	EPOCH2
الإشريكية القولونية ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
الإيثانول ، اللامائي	فيشر الكيماوية	459844
Fisherbrand غطاء المجهر الزجاجي	فيشر ساينتفيك	12540A
فيشرفست شرائح مجهر فاخرة عادي	فيشر ساينتفيك	12-544-4
محلول بيروكسيد الهيدروجين	سيجما ألدريتش	216763-500 مل	يحتوي على مثبط ، 30٪ بالوزن في H2O
Incu-Shaker	Mini Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
كبريتات المغنيسيوم ، 7-هيدرات	ماكرون فاين كيماولز	6066-04	Avantor Performance Materials، Inc.
كاشف الميثانول	سيجما ألدريتش	179337-4L	ACS ، > 99.8٪
NanoDrop واحد مقياس الطيف	الضوئي الحراري العلمي	ND-ONEC-W
نيتروجين ، مضغوط	ماثيسون	UN1066
منظف بلازما الأكسجين	هاريك بلازما	PDC-001-HP
Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 أذرع-PEG)	NOF America كوربوريشن	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	مخزن بين 15 درجة ؛ C– 30 درجة ؛ C
بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) سليجارد 184	داو كورنينج	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
شرائح مجهر فاخرة	فيشر ساينتفيك	12-544-4	25 × 75 × 1 مم
بيكربونات الصوديوم	سيجما ألدريتش	S5761-500G
كلوريد الصوديوم	سيجما لايف ساينس	S5886-500G	الكاشف الحيوي ، مناسب لزراعة الخلايا
هيدروكسيد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra ، > 98٪ ، كريات (لامائية)
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ثنائي الهيدرات	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra ، للبيولوجيا الجزيئية ، > 99.0٪ (T) مقياس
سمك الفولاذ المقاوم	للصدأ منتجات العلامة التجارية	الدقيقة 77739
حامض الكبريتيك	سيجما ألدريتش	320501-2.5 لتر
تولوين ، لامائي ، 99.8٪	سيجما ألدريتش	244511-1 لتر	لامائي ، > 99.8٪
ثلاثي كلورو (1 ساعة ، 1 ساعة ، 2 ساعة ، 2 ساعة ، 2 ساعة بيرفلور أوكتيل) سيلان (TPS) ، 97٪	سيجما ألدريتش	448931-10 جرام
مرق الصويا التريب	سيجما ألدريتش	22092-500 جرام	لعلم الأحياء
سوبر نوفا رقمي لوح ساخن نمام	حراري علمي	S131825
الموجات فوق الصوتية	فيشر العلمية	FS-110H