مقالة منهجية

التألق بين الأطوار في الموقع تهجين مسحات نخاع العظم من المايلوما المتعددة

DOI:

10.3791/63083

⸱

أبريل 15, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Wuhan National Laboratory for Optoelectronics, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحسين نجاح التألق بين المراحل في الكشف عن التهجين في الموقع على مسحات نخاع العظم من مرضى المايلوما المتعددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الكشف عن التهجين الفلوري في الموقع (FISH) طريقة لا غنى عنها في التقسيم الطبقي للمخاطر الجينية في الورم النقوي المتعدد (MM) ، وهو أحد أكثر الأورام الخبيثة الدموية شيوعا. السمة المميزة ل MM هي خلايا البلازما الخبيثة المتراكمة في نخاع العظام. تركز تقارير FISH ل MM بشكل أساسي على خلايا البلازما النسيلية النقية أو المحددة ، بدلا من جميع الخلايا النووية ، عن طريق الفرز باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل CD138 أو وضع علامة باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي السيتوبلازمي κ أو λ. عادة ما يتم الحصول على نوى نخاع العظم بين الأطوار من خلايا نخاع العظم الطازجة. ومع ذلك ، فإن التخصيب المرضي لعينات خلايا البلازما يتطلب كميات كبيرة من نخاع العظم الطازج المضاد للتخثر الهيبارين ، والذي لا يمكن الحصول عليه في حالة استخراج نخاع العظم الصعب أو الصنبور الجاف لنخاع العظم. هنا ، نقوم بإنشاء طريقة جديدة لتحسين نجاح اكتشاف FISH على مسحات نخاع العظم الملطخة أو غير الملطخة. من الأسهل الحصول على مسحات نخاع العظم من عينات نخاع العظم المضادة للتخثر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الورم النقوي المتعدد (MM) هو مرض خبيث في خلايا البلازما (PC) مع عدم تجانس بيولوجي قوي وفروق فردية كبيرة في الفعالية السريرية ، مع فترات بقاء تتراوح من أشهر إلى عقود. الخصائص الوراثية الخلوية هي مؤشرات تنبؤية مهمة ل MM. أصبح نظام التقسيم الطبقي للمخاطر والعلاجات الفردية القائمة على الخصائص الوراثية موضوعين ذوي اهتمام كبير في الأبحاث السريرية على MM1. تشمل انحرافات أجهزة الكمبيوتر التي تم اختبارها في لوحة التهجين الفلوري في الموقع (FISH) من نخاع العظم (BM) del 13q14 (RB1) و del 17p13 (TP53) و t(4;14) (IGH / FGFR3) و t (11;14) (IGH / MYEOV) و t (14;16) (IGH / MAF) و t (14:20) (IGH / MAFB) و 1q21 (CKS1B) الكسب / التضخيم و 1p (CDKN2C) الحذف.

يجب تضمين علم الوراثة الخلوية الطوري القياسي في التقييم الأولي لمرضى MM. على الرغم من أن النمط النووي التقليدي ذو النطاق G يوفر فائدة تحليل الكروموسوم الكامل، إلا أن انخفاض العائد لهذه الطريقة يؤدي إلى العديد من النتائج السلبية الخاطئة2. تقليديا ، كان ينظر إلى أجهزة الكمبيوتر الشخصية على أنها غير قادرة إلى حد كبير على الانقسام لأنها منتجات المرحلة النهائية من تمايز الخلايا الليمفاوية B. هذا يجعل من الصعب الحصول على صور مقسمة. قد يكون التحليل الوراثي الخلوي المحسن في MM مع الثقافات طويلة الأجل (6 أيام) وتحفيز الثقافات بواسطة السيتوكينات طريقة واعدة لتحديد التشوهات الوراثية الخلوية في مرضى MM الذين تم تشخيصهم حديثا3. حتى عندما تم إطالة وقت الزرع إلى 6 أيام ، ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن تشوهات وراثية خلوية بدقة في 30٪ -50٪ من مرضى MM 4. علاوة على ذلك ، يتميز MM بانحرافات وراثية خلوية معقدة تعكس عدم تجانسه التنبؤي. ومع ذلك ، فإن دقة تقنية ربط الكروموسومات التقليدية منخفضة ، مما قد يؤدي بسهولة إلى عدم اكتشاف تشوهات الكروموسومات في MM.

لا غنى عن FISH Interphase ، ويفضل بعد فرز الكمبيوتر الشخصي القائم على الخرز المغناطيسي الإيجابي CD138 أو وضع علامة عليه باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي السيتوبلازمي κ / λ ، في تحليل MM5,6. يوصى بشدة باستخدام عينة مختارة إيجابية CD138 للحصول على العائد الأمثل للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن الكمية الدقيقة للانحرافات الجينية الخلوية تتطلب ما لا يقل عن 4 مل من BM المضاد للتخثر لفرز الكمبيوتر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مجموعات فرز الخرزة المناعية المغناطيسية CD138 مع FISH أو الغلوبولين المناعي لسلسلة الضوء κ / λ السيتوبلازمية مع اختبار FISH (cIg-FISH) تزيد من العديد من التكاليف التجريبية وتستغرق وقتا طويلا.

عادة ، يتم تقييم نسبة الكمبيوتر الشخصي أولا من الفحص المورفولوجي لمسحات BM الملطخة أو أقسام خزعة BM 7,8. تستخدم عينات BM ذات الجودة العالية (عينات شفط النخاع الأولى) للاختبار المورفولوجي ، في حين أن العينات المرسلة ل FISH أو الكشف الآخر غالبا ما تكون عينات الشفط الثانوية ذات نسب عالية من التخفيف بالدم المحيطي.

في وقت مبكر من 1990s ، أظهرت دراسات متعددة أن مسحات BM يمكن استخدامها مباشرة لفحوصات FISH الخلالية ، والتي أثبتت أنها طريقة موثوقة وقابلة للتكرار 9. أكدت دراسة أنيقة تستند إلى مورفولوجيا الخلايا والكيمياء الخلوية الإستراز جنبا إلى جنب مع FISH من الدم المحيطي ومسحات BM أهميتها السريرية الكبيرة لتوضيح تشوهات الكروموسومات في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم المحبب واللمفاوي 10.

هنا ، نقدم طريقة جديدة لتحسين نجاح الكشف عن FISH بين المراحل في مرضى MM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في مستشفى تشونغنان بجامعة ووهان (رقم 2019065). تم جمع العينات من مريض MM في قسم أمراض الدم ، مستشفى تشونغنان بجامعة ووهان (الصين).

1. إعداد مسحات BM

  1. ضع أول 0.2 مل من محلول BM على شريحة زجاجية نظيفة يمكن التخلص منها.
  2. انشر مسحات BM إلى سمك موحد مع ذيول حادة عن طريق إزالة BM بسرعة. ثم ، تجف بشكل طبيعي.
  3. قم بتغطية أفلام BM ب 1 مل من محلول Wright-Giemsa لمدة 10 ثوان تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات إلى الشرائح.
    ملاحظة: احرص على منع محلول الصبغة من الجفاف أو التدفق من الشرائح.
  5. امزج محلول الصبغة بلطف وحافظ عليه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. شطف الشرائح بالماء النظيف وتجفيفها في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
  7. استخدم الفحص المجهري الضوئي الأمامي للكشف عن أجهزة الكمبيوتر الخبيثة. يجب أن تكون أجهزة الكمبيوتر مشتتة بشكل جيد.

2. الأسماك المعالجة المسبقة لمسحات BM

  1. قم بتغطية المنطقة الهجينة بمحلول مثبت لمدة 10 دقائق لتغيير لون أجهزة الكمبيوتر وإصلاحها.
    1. لإعداد محلول مثبت طازج ، امزج الميثانول مع حمض الخليك الجليدي بنسبة حجم 3: 1.
  2. شطف الشريحة بالماء منزوع الأيونات (dH2O) وجففها في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
  3. سخني جرة تحتوي على 2x SSC عازل إلى 56 درجة مئوية في حمام مائي. قم بتخفيف المخزن المؤقت حديثا إلى 20x SSC قبل الاستخدام.
    1. لإعداد 20x SSC ، امزج جيدا 176 جم من كلوريد الصوديوم و 88 جم من سترات الصوديوم مع 800 مل من dH2O. قم بقياس الرقم الهيدروجيني واضبط على الرقم الهيدروجيني 5.3 ± 0.2. ثم أضف dH2O ليصل الحجم النهائي إلى 1 لتر.
  4. اغسل مسحة BM المحضرة في المخزن المؤقت 2x SSC المسخن مسبقا لمدة 10 دقائق ، متبوعا بغمسه في ماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة.
  5. تجفيف اللطاخة في تدرج الإيثانول (70 ٪ ، 85 ٪ ، و 100 ٪ من الإيثانول ، لكل منها لمدة 1 دقيقة). جفف اللطاخة في الهواء لمدة 10 دقائق.

3. BM تشويه الأسماك والغسيل

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات في غرفة مظلمة لمنع التبريد الفلوري.

  1. أضف خليط مسبار TP53 / centromere من الكروموسوم 17 (CEP17) إلى منطقة التهجين وقم بتغطيته بغطاء. اضغط برفق باستخدام ملاقط مدببة بدقة لإزالة فقاعات الهواء من الأسفل.
  2. أغلق جميع جوانب الغطاء بالأسمنت المطاطي لضمان ضيق جيد.
  3. بعد تصلب الأسمنت المطاطي ، ضع الشريحة على آلة FISH أوتوماتيكية. قم بإجراء تمسخ عند 78 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، يليه التهجين عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. التقط الشريحة من آلة FISH. استخدم ملاقط مدببة بدقة لإزالة الأسمنت المطاطي بلطف.
  5. اغمر الشريحة في 2x SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 أو 2 دقيقة تقريبا لغسل الغطاء.
  6. اغسل الشريحة في 68 درجة مئوية محمى من الفئة العمرية 0.4x SSC / 0.3٪ NP-40 في حمام مائي لمدة دقيقتين.
    1. قم بإعداد محلول 0.4x SSC / 0.3٪ NP-40 عن طريق خلط 20 مل من 20x SSC (درجة الحموضة 5.3) مع 950 مل من dH2O. ثم ، أضف 3 مل من NP-40 واخلطه جيدا حتى يذوب تماما. قياس الرقم الهيدروجيني والتكيف مع 7.0-7.5 مع NaOH. ثم أضف dH2O ليصل الحجم النهائي للحل الكلي إلى 1 لتر.
  7. اغسل الشرائح باستخدام 2x SSC في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. ضعيه في وضع مستقيم في الظلام ليجف جيدا لمدة 10 دقائق.
  8. أضف 10 ميكرولتر من DAPI إلى المنطقة الهجينة وقم بتغطيتها بغطاء.

4. تحليل الأسماك وتصويرها

  1. شاهد الشريحة الهجينة باستخدام مرشح مناسب مضبوط على مجهر فلوري.
  2. استخدم مرشحا بصريا فلوروفوريا أزرق أحادي اللون لمراقبة شدة التألق في نواة الخلية. التقط صورا لنواة الخلية ضمن مجموعة مرشحات DAPI.
  3. استخدم مسبار الكروموسوم المركزي لإظهار عدد الكروموسومات التي تحتوي عليها الخلية. تسمية CEP17 مع التألق الأخضر. استخدم مرشحا بصريا فلوريا أخضر الطيف لمراقبة موقع CEP17. التقط صورة إشارات CEP17 أسفل مجموعة المرشحات الخضراء.
  4. قم بتسمية جين TP53 بالتألق البرتقالي. استخدم مرشحا بصريا فلوروفوريا برتقاليا لمراقبة TP53. التقط صورة إشارات TP53 ضمن هذه المجموعة.
  5. ادمج هذه الصور الثلاث وافحصها بحثا عن تشوهات عددية.
    ملاحظة: في خلية طبيعية بين الأطوار ، لوحظت إشارتان برتقاليتان وإشارتان خضراوان داخل نواة ذات تألق أزرق ، مما يشير إلى زوج واحد من الكروموسوم الطبيعي 17 (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في التقييم المورفولوجي الأولي لمريض MM تم تشخيصه حديثا ، وجد أن 15٪ من أجهزة الكمبيوتر الشخصية في مسحة BM تحتوي على نوى أكبر وأكثر قتامة إلى جانب كميات أكبر من السيتوبلازم من أجهزة الكمبيوتر العادية (الشكل 2A). كشف الأنبوب الأول من BM المضاد للتخثر الهيبارين الذي تم اكتشافه بواسطة تقنية النمط الظاهري المناعي عن 2.3٪ فقط من أجهزة الكمبيوتر الشاذة وحيدة النسيلة. ومع ذلك ، فإن BM المستنشق محدود في حالة كونه صنبورا جافا. تم استخدام مسحات BM لاختبار FISH بين المراحل. تم توطين جهاز كمبيوتر تمثيلي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن الضروري تطبيق FISH على التقسيم الطبقي للمخاطر الجينية في MM. الجزء الحاسم من تقارير FISH ليس كل الخلايا النواة ، ولكن أجهزة الكمبيوتر النسيلة التي تم تنقيتها أو تحديدها على وجه التحديد عن طريق الفرز باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل CD138 أو وضع علامة باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي السيتوبلازمي κ أو λ. وجد أن FISH بين المراحل بعد فرز الكمبيوتر الشخصي أو cIg-FISH مهم في تشخيص MM بسبب النسبة المنخفضة نسبيا من أجهزة الكمبيوتر في BM. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لديها بعض أوجه القصور ، بما في ذلك العمليات المعقدة ،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا المشروع من قبل صندوق الابتكار التابع ل WNLO 2018WNLOKF023.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
آلة FISH الأوتوماتيكيةLeica  شركةS500-24FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPIAbbott Molecular Inc.06J49-001برنامج تحليل الأسماك DAPI
IMSTAR  شركةIMSTARFISH Analysis Software
FISH ProbeAbbott Molecular Inc.05N56-020Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe
Kit ماصة ذات حجم ثابتEppendorf China Ltd.M33768H10   ميكرولتر
مجهر مضانأوليمبوس شركةBX53المجهر الفلوري
برنامج تحليل النمط النوويIMSTAR   ؛ شركةIMSTARKaryotype تحليل البرمجيات
المجهر الخفيفأوليمبوس   شركةBX41مجهر الضوء الأمامي
NP-40شركة أبوت الجزيئية07J05-001NP-40
صباغة تلطيخ البلاستيكقوانغتشو Kaixiu للتجارة المحدودةRSJ-501  24 شرائح
البلاستيك تلطيخ صباغة خزانقوانغتشو Kaixiu للتجارة المحدودةRSJ-516  24 شريحة
مطاط الأسمنتMarabu  GmbH & شركة KGFixoGum الأسمنت المطاطي
شركةSSC Abbott Molecular Inc.02J10-03220 مرة; SSC
حمام مائيشنغهاي Boxun الطبية الحيوية المحدودةDK-8Dحمام مائي متعدد درجات الحرارة
الأمامي رف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
  2. Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
  3. Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
  4. Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
  5. Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
  6. Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
  7. Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
  8. Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).
  9. Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
  10. Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
  11. Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
  12. Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
  13. McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  14. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TP53 17 CD138

مقالات ذات صلة