تم تحديد تركيز السكروز الأمثل لاستخراج الجليكوجين في الكبد باستخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز. أثبتت إضافة خطوة الغليان لمدة 10 دقائق لتثبيط إنزيمات تحلل الجليكوجين أنها مفيدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخراج جزيئات الجليكوجين في الكبد لتحديد بنية الجليكوجين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الجليكوجين في الكبد هو بوليمر جلوكوز مفرط التفرع يشارك في الحفاظ على مستويات السكر في الدم لدى. تتأثر خصائص الجليكوجين ببنيته. ومن ثم ، فإن طريقة الاستخراج المناسبة التي تعزل عينات تمثيلية من الجليكوجين أمر بالغ الأهمية لدراسة هذا الجزيء الكبير. بالمقارنة مع طرق الاستخراج الأخرى ، فإن الطريقة التي تستخدم خطوة الطرد المركزي لتدرج كثافة السكروز يمكن أن تقلل من الضرر الجزيئي. بناء على هذه الطريقة ، يصف منشور حديث كيف اختلفت كثافة محلول السكروز المستخدم أثناء الطرد المركزي (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) للعثور على التركيز الأنسب لاستخراج جزيئات الجليكوجين من مجموعة متنوعة من الأحجام ، مما يحد من فقدان الجسيمات الأصغر. تم تقديم خطوة الغليان لمدة 10 دقائق لاختبار قدرتها على تشويه الإنزيمات المهينة للجليكوجين ، وبالتالي الحفاظ على الجليكوجين. تبين أن أقل تركيز للسكروز (30٪) وإضافة خطوة الغليان لاستخراج العينات الأكثر تمثيلا من الجليكوجين.
المقدمة
الجليكوجين هو بوليمر معقد مفرط التفرع من الجلوكوز الموجود في والفطريات والبكتيريا1. في الثدييات ، يعمل الجليكوجين في الكبد كمخزن مؤقت للجلوكوز في الدم ، ويحافظ على التوازن ، بينما يعمل الجليكوجين العضلي كخزان للجلوكوز على المدى القصير لتوفير الطاقة مباشرة2. غالبا ما يتم وصف بنية الجليكوجين بثلاثة مستويات (كما هو موضح في الشكل 1): 1. تتشكل السلاسل الخطية بواسطة مونومرات الجلوكوز عبر روابط جليكوسيدية (1→4) -α ، مع توصيل نقاط فرعية عبر (1→6) -α روابط جليكوسيدية. 2. جزيئات β متفرعة للغاية (~ 20 نانومتر في القطر) والتي ، خاصة في الأنسجة مثل العضلات الهيكلية ، تعمل كجزيئات جليكوجين مستقلة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
كبد الفأر المستخدم لتحسين هذا الإجراء21 كانت من 12 ذكورا من الفئران الخلفية BKS-DB / Nju (7.2 أسابيع من العمر ، انظر جدول المواد). تمت الموافقة على استخدام من قبل مستشفى رنمين التابع للجنة رعاية والأخلاقيات بجامعة ووهان ، إصدار IACUC رقم. 20181113 WDRM.
1 الأنسجة الحيوانية
- وزن كبد الفأر (1-1.8 غرام من الكبد الكامل من كل فأر).
- قم بتجميد كبد الفأر بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
2. إعداد العازلة والكواشف
- تحضير عازلة عزل الجليكوجين تحتوي على 5 mM Tris ، 150 mM NaCl ، 2 mM EDTA ، 50 mM NaF ، و 5 mM بيروفوسفات الصوديوم م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في حين أن الإجراء الموصوف أعلاه هو الطريقة المثلى (30٪ سكروز مع إضافة خطوة غليان مدتها 10 دقائق) ، يتم توفير البيانات هنا للجليكوجين المستخرج عبر ثلاثة تركيزات من السكروز (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) ، مع وبدون خطوة غليان ، كما هو موضح سابقا21. وفقا للبروتوكول ، يتم إعطاء النقاء والعائد الخام وإنتاج الجليكوجين للجليكوجين الجاف المستخرج بظروف مختلفة في الجدول 1 ، المستنسخ من21. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في المحصول الخام وإنتاج الجليكوجين بين المجموعات المستخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بنية الجليكوجين مهمة لخصائصه. على سبيل المثال ، يؤثر الحجم الجزيئي على معدل تحلل الجليكوجين10 ، ويؤثر توزيع طول السلسلة على قابليته للذوبان26. لفهم هذه العلاقات بشكل صحيح ، من المهم استخراج الجليكوجين بإجراء يعزل ، قدر الإمكان ، عينة تمثيلية وغير تالفة. تستخدم الطرق التقليدية للاستخراج إما الظروف القلوية الساخنة أو الحمض البارد. في حين أن هذه الطرق فعالة في فصل الجليكوجين عن مكونات الأنسجة الأخرى ، إلا أنها قاسية كيميائيا وقد ثبت أنها تؤدي إلى .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
ويعرب المؤلفان عن امتنانهما للسيد غاوشينغ وو والآنسة يونوين تشو على المساعدة التقنية التي قدمها مع FACE والسيد زينشيا هو والسيد دنغبين للمساعدة التقنية مع لجنة الأوراق المالية والبورصات. ويدعم ماس زمالة كوينزلاند المتقدمة لبحوث الصناعة، ومؤسسة ماتر، وأمناء الأسهم، ومؤسسة إل جي ماكالام إست وجورج ويبر تراستس. تم دعم هذا العمل من خلال البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو ، ومنحة مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية C1304013151101138 ، وبرنامج مواهب جيانغسو للابتكار وريادة الأعمال لعام 2017. تم إنشاء الشكل 1-5 باستخدام BioRender.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 8-أمينوبيرين -1،3،6-ثلاثي سلفونات (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M محلول |
| حمض الخليك | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 م ، محلول الأس الهيدروجيني 3.5 |
| Agilent 1260 Infinity SEC | نظام Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) | |
| BKS-DB / Nju الفئران خلفية | نانجينغ مؤسسة البحوث الطبية الحيوية بجامعة نانجينغ | ||
| مجموعة فحص الجلوكوز D-(تنسيق GOPOD) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| الخالط | IKA | T 25 | |
| حمض الهيدروكلوريك | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M محلول |
| حمض الهيدروكلوريك | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M |
| نظام P / ACE MDQ plus | Ab Sciex ، | الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور الأمريكي | |
| كاشف معامل الانكسار | Optilab UT-rEX ، وايت ، سانتا باربرا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | استبعاد الحجم (SEC) | |
| أسيتات الصوديوم | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 م ، محلول الأس الهيدروجيني 4.5 |
| أزيد الصوديوم | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| كلوريد الصوديوم | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| سيانوبوروهيدريد الصوديوم | SIGMA Aldrich | 156159 | محلول 1 م |
| فلوريد الصوديوم | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | SIGMA Aldrich | 43617 | محلول 0.1 M |
| نترات الصوديوم | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| بيروفوسفات الصوديوم | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA قبل العمود ، 1,000 و 10,000 عمود | خدمات معايير البوليمر ، ماينز ، ألمانيا | كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) | |
| أنابيب الطرد المركزي Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Beckman | 4 مل ، أنبوب فائق الوضوح Thinwall مفتوح ، 11 × 60 مم |
المراجع
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
