يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخراج جزيئات الجليكوجين في الكبد لتحديد بنية الجليكوجين

7.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63088

⸱

فبراير 8, 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 2Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 3Jiangsu Provincial Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 5Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 6Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 7Glycation and Diabetes Group, Mater Research Institute-The University of Queensland, Translational Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

تم تحديد تركيز السكروز الأمثل لاستخراج الجليكوجين في الكبد باستخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز. أثبتت إضافة خطوة الغليان لمدة 10 دقائق لتثبيط إنزيمات تحلل الجليكوجين أنها مفيدة.

الملخص

الجليكوجين في الكبد هو بوليمر جلوكوز مفرط التفرع يشارك في الحفاظ على مستويات السكر في الدم لدى. تتأثر خصائص الجليكوجين ببنيته. ومن ثم ، فإن طريقة الاستخراج المناسبة التي تعزل عينات تمثيلية من الجليكوجين أمر بالغ الأهمية لدراسة هذا الجزيء الكبير. بالمقارنة مع طرق الاستخراج الأخرى ، فإن الطريقة التي تستخدم خطوة الطرد المركزي لتدرج كثافة السكروز يمكن أن تقلل من الضرر الجزيئي. بناء على هذه الطريقة ، يصف منشور حديث كيف اختلفت كثافة محلول السكروز المستخدم أثناء الطرد المركزي (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) للعثور على التركيز الأنسب لاستخراج جزيئات الجليكوجين من مجموعة متنوعة من الأحجام ، مما يحد من فقدان الجسيمات الأصغر. تم تقديم خطوة الغليان لمدة 10 دقائق لاختبار قدرتها على تشويه الإنزيمات المهينة للجليكوجين ، وبالتالي الحفاظ على الجليكوجين. تبين أن أقل تركيز للسكروز (30٪) وإضافة خطوة الغليان لاستخراج العينات الأكثر تمثيلا من الجليكوجين.

المقدمة

الجليكوجين هو بوليمر معقد مفرط التفرع من الجلوكوز الموجود في والفطريات والبكتيريا1. في الثدييات ، يعمل الجليكوجين في الكبد كمخزن مؤقت للجلوكوز في الدم ، ويحافظ على التوازن ، بينما يعمل الجليكوجين العضلي كخزان للجلوكوز على المدى القصير لتوفير الطاقة مباشرة2. غالبا ما يتم وصف بنية الجليكوجين بثلاثة مستويات (كما هو موضح في الشكل 1): 1. تتشكل السلاسل الخطية بواسطة مونومرات الجلوكوز عبر روابط جليكوسيدية (1→4) -α ، مع توصيل نقاط فرعية عبر (1→6) -α روابط جليكوسيدية. 2. جزيئات β متفرعة للغاية (~ 20 نانومتر في القطر) والتي ، خاصة في الأنسجة مثل العضلات الهيكلية ، تعمل كجزيئات جليكوجين مستقلة 3,4 ؛ 3. جزيئات الجليكوجين α الأكبر (يصل قطرها إلى 300 نانومتر) والتي تتكون من وحدات الجليكوجين β الأصغر ، والتي توجد في الكبد5 ، القلب6 ، وفي بعض الأنواع غير الثديية7. جزيئات α الكبدية من الفئران المصابة بالسكري هشة جزيئيا ، مع ميل إلى التحلل إلى جزيئات β عند إذابتها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، في حين أن الجسيمات α من الضوابط غير السكرية تظل دون تغيير بشكل عام. إحدى الفرضيات هي أن هذه الهشاشة قد تؤدي إلى تفاقم ضعف توازن الجلوكوز في الدم الذي يظهر في مرض السكري ، حيث من المحتمل أن تؤدي جزيئات α الهشة إلى نسب أعلى من الجسيمات β المتدهورة بسرعة8،9،10،11.

تستخدم طرق استخراج الجليكوجين التقليدية الظروف القاسية نسبيا لتعريض أنسجة الكبد لمحلول قلوي ساخن12 أو محاليل حمضية مثل حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) 13 أو حمض البيركلوريك (PCA) 14. في حين أن هذه الطرق فعالة في فصل الجليكوجين عن المكونات الأخرى لأنسجة الكبد ، إلا أن هذه الطرق تؤدي حتما إلى تدهور بنية الجليكوجين إلى حد ما15,16. على الرغم من أن هذه الطرق مناسبة للقياس الكمي لمحتوى الجليكوجين ، إلا أنها ليست مثالية للدراسات التي تركز على الحصول على معلومات هيكلية عن الجليكوجين بسبب هذا الضرر الهيكلي. منذ تطوير هذه الطرق ، تم تطوير إجراء استخراج أكثر اعتدالا يستخدم المخزن المؤقت البارد Tris (يظهر أنه يمنع تدهور الجلوكوزيداز) مع الطرد المركزي الفائق لتدرج كثافة السكروز17،18،19. مع التحكم في درجة الحموضة عند ~ 8 ، لا تخضع هذه الطريقة الجليكوجين للتحلل المائي الحمضي أو القلوي الذي شوهد في الإجراءات السابقة.

يمكن للطرد المركزي الفائق المتدرج لكثافة السكروز لأنسجة الكبد المتجانسة فصل جزيئات الجليكوجين عن غالبية مواد الخلية. إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء تنقية إضافية عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحضيري ، مما يؤدي إلى جمع الجليكوجين المنقى مع البروتينات المرتبطة بالجليكوجينالمرفقة 20. على الرغم من أن هذه الطريقة ، مع ظروف أكثر اعتدالا ، من المرجح أن تحافظ على بنية الجليكوجين ، إلا أنه من الصعب منع فقدان جزء من الجليكوجين في المادة الطافية ، وخاصة جزيئات الجليكوجين الأصغر التي تكون أقل كثافة15. سبب آخر محتمل لفقدان الجليكوجين هو أن الظروف الأكثر اعتدالا تسمح ببعض التدهور الأنزيمي ، مما يؤدي إلى انخفاض غلة الجليكوجين مقارنة بطرق الاستخراج الأكثر قسوة. أفادت الأبحاث الحديثة عن تحسين طريقة استخراج الكبد والجليكوجين للحفاظ على بنية الجليكوجين21. هنا ، تم اختبار تركيزات السكروز المختلفة (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) لتحديد ما إذا كانت تركيزات السكروز المنخفضة تقلل من فقدان جزيئات الجليكوجين الأصغر. كان الأساس المنطقي هو أن الكثافة المنخفضة ستسمح للجسيمات الأصغر والأقل كثافة باختراق طبقة السكروز وتجميعها في الحبيبات مع بقية الجليكوجين.

في هذه الدراسة ، تمت مقارنة طرق الاستخراج مع وبدون خطوة غليان مدتها 10 دقائق لاختبار ما إذا كان يمكن تغيير طبيعة إنزيمات تحلل الجليكوجين ، مما أدى إلى استخراج المزيد من الجليكوجين الذي كان أيضا خاليا من التحلل الجزئي. تم استخدام توزيعات الحجم الجزيئي الكامل وتوزيعات طول سلسلة الجليكوجين لتحديد بنية الجليكوجين المستخرج ، على غرار تحسين استخراج النشا المنشور سابقا22. تم استخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) مع اكتشاف معامل الانكسار التفاضلي (DRI) للحصول على توزيعات حجم الجليكوجين ، والتي تصف الوزن الجزيئي الكلي كدالة للحجم الجزيئي. تم استخدام الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE) لتحليل توزيعات طول السلسلة ، والتي تصف العدد النسبي لسلاسل الجلوكوزيد لكل حجم معين (أو درجة البلمرة). تصف هذه الورقة منهجية استخراج الجليكوجين من أنسجة الكبد بناء على دراسة التحسين السابقة21. تشير البيانات إلى أن الطريقة الأكثر ملاءمة للحفاظ على بنية الجليكوجين هي تركيز السكروز بنسبة 30٪ مع خطوة غليان مدتها 10 دقائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كبد الفأر المستخدم لتحسين هذا الإجراء21 كانت من 12 ذكورا من الفئران الخلفية BKS-DB / Nju (7.2 أسابيع من العمر ، انظر جدول المواد). تمت الموافقة على استخدام من قبل مستشفى رنمين التابع للجنة رعاية والأخلاقيات بجامعة ووهان ، إصدار IACUC رقم. 20181113 WDRM.

1 الأنسجة الحيوانية

  1. وزن كبد الفأر (1-1.8 غرام من الكبد الكامل من كل فأر).
  2. قم بتجميد كبد الفأر بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.

2. إعداد العازلة والكواشف

  1. تحضير عازلة عزل الجليكوجين تحتوي على 5 mM Tris ، 150 mM NaCl ، 2 mM EDTA ، 50 mM NaF ، و 5 mM بيروفوسفات الصوديوم مع الماء منزوع الأيونات ، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.
  2. تحضير 30٪ (وزن / وزن) محلول السكروز (وجد أنه الأكثر مثالية للجليكوجينفي الكبد 21).
  3. تحضير العازلة خلات الصوديوم (1 M ، درجة الحموضة 4.5) ، عازلة حمض الخليك (0.1 M ، درجة الحموضة 3.5) ، محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.1 M) ، و cyanoborohydride الصوديوم (1 M).
  4. تحضير محلول 8-أمينوبيرين-1،3،6-ثلاثي سلفونات (APTS) بإضافة 5 ملغ من APTS إلى 50 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي 15٪.
  5. تحضير محلول نترات الأمونيوم الذي يحتوي على 50 mM نترات الأمونيوم مع 0.02 ٪ أزيد الصوديوم.

3. استخراج الجليكوجين (الشكل 2)

  1. انقل أنسجة الكبد المجمدة (~ 1 جم) إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 6 مل من محلول عزل الجليكوجين.
  2. إبقائه على الجليد ، تجانس أنسجة الكبد باستخدام خالط الأنسجة.
  3. انقل نصف المعلق (3 مل) إلى أنبوب جديد واغلي لمدة 10 دقائق (ثبت أنه الأمثل للدراسات الهيكلية للجليكوجين21). احتفظ بالنصف الآخر من المعلق (3 مل) على الثلج لاستخراج الجليكوجين الذي يحتوي على البروتينات المرتبطة التي لا يتم تغيير طبيعتها.
    ملاحظة: يجب دائما حفظ العينات غير المغلية على الثلج أثناء خطوات استخراج الجليكوجين. إذا لم تكن بروتينات الجليكوجين مهمة للدراسة ، يمكن أن تخضع العينة بأكملها لخطوة الغليان لمدة 10 دقائق.
  4. قم بإزالة قسمة 8 ميكرولتر من كل أنبوب ، واحتفظ بالحصص على الجليد ، واستخدمها لتحديد محتوى الجليكوجين (انظر القسم 4).
  5. أجهزة الطرد المركزي التعليق المتبقي عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. نقل المواد الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، وأجهزة الطرد المركزي لهم في 3.6 × 105 غرام لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  7. تخلص من المواد الطافية المتبقية وأعد تعليق الكريات في 1.5 مل من محلول عزل الجليكوجين.
  8. ضع العينات فوق 1.5 مل من محلول السكروز 30٪ في أنابيب الطرد المركزي الفائق 4 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 3.6 × 105 جم لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  9. تخلص من المواد الطافية المتبقية وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
  10. أضف 800 ميكرولتر من الإيثانول المطلق إلى المعلقات واخلطها جيدا لترسيب الجليكوجين23,24. قم بتخزين المخاليط في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل للسماح بهطول الأمطار.
  11. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
  12. كرر عملية ترسيب الإيثانول هذه 3x وأعد تعليق حبيبات الجليكوجين النهائية في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
  13. قم بإزالة قسامة 8 ميكرولتر من كل أنبوب لتحديد محتوى الجليكوجين (انظر القسم 4).
  14. قم بتجميد المواد الطافية المتبقية في النيتروجين السائل وتجميدها جافة (lyophilize) طوال الليل. قم بتخزين عينات الجليكوجين الجافة في الفريزر عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب أن تكون عينات الجليكوجين الجافة مستقرة عند -20 درجة مئوية ؛ ومع ذلك ، لا توجد بيانات تشير إلى المدة التي تستغرقها دون أي تغييرات هيكلية.

4. تحديد محتوى الجليكوجين (الشكل 3)

  1. أضف 8 ميكرولتر من طافات الجليكوجين ، (انظر القسمين 3.13 و 3.4) ، و 5 ميكرولتر من الأميلوجلوكوزيداز (3269 وحدة / مل) ، و 100 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم (1 M ، درجة الحموضة 4.5) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واملأ الأنبوب إلى علامة 500 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات.
  2. قم بإعداد عناصر التحكم التي تستخدم الماء منزوع الأيونات بدلا من الأميلوجلوكوزيداز.
  3. احتضان العينات على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع الحفاظ على أدوات التحكم على الجليد.
  4. أجهزة طرد مركزي عند 6000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واخلط 300 ميكرولتر من كل مادة طافية ناتجة مع 1 مل من كاشف الجلوكوزيداز أوكسيديز / بيروكسيديز (GOPOD).
  5. قم ببناء منحنى معايرة عن طريق خلط 300 ميكرولتر من الماء المشين الذي يحتوي على 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 50 ميكروغرام من الجلوكوز D مع 1 مل من كاشف GOPOD.
  6. احتضان المخاليط على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
  7. اقرأ الامتصاص (510 نانومتر) لكل عينة باستخدام 96 لوحة بئر (150 ميكرولتر لكل بئر) باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.
  8. اطرح امتصاص عينات التحكم (بدون أميلوجلوكوسيداز) من امتصاص العينات التجريبية ، ثم احسب محتوى الجليكوجين بناء على منحنى معيار الجلوكوز D.

5. العائد الخام ، محصول الجليكوجين ، وتحديد النقاء

  1. بالنسبة للمحصول الخام ، قم بوزن عينة الجليكوجين المجففة بالتجميد واحسب المحصول كنسبة مئوية من أنسجة الكبد الرطبة.
    ملاحظة: يجب تعديل هذا العائد لتصحيح الحصص المأخوذة في كل خطوة من خطوات محتوى الجليكوجين.
  2. لنقاء الجليكوجين ، حدد محتوى الجليكوجين في الكريات النهائية ، كما هو موضح في القسم 4. احسب النقاء كنسبة مئوية من محتوى الجليكوجين المحدد بالنسبة إلى العائد الخام (انظر الخطوة 5.1).
  3. بالنسبة لإنتاجية الجليكوجين ، حدد محتوى الجليكوجين للعينات المتجانسة دون غليان وقبل أي طرد مركزي ، كما هو موضح في القسم 4. احسب محصول الجليكوجين كنسبة مئوية من محتوى الجليكوجين في الكريات النهائية (انظر الخطوة 5.2) إلى محتوى الجليكوجين المحدد في التجانس الأولي.

6. تحليل توزيعات طول السلسلة (الشكل 4)

  1. تزن 0.5 ملغ من الجليكوجين المجفف بالتجميد في أنابيب سعة 1.5 مل.
  2. أضف 90 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 1.5 ميكرولتر من أزيد الصوديوم (0.04 جم / مل) إلى الأنابيب.
  3. أضف 5 ميكرولتر من محلول حمض الأسيتيك (0.1 م ، درجة الحموضة 3.5) و 2 ميكرولتر من محلول الأيزو أميلاز (180 وحدة / مجم) إلى الأنابيب لإزالة الجليكوجين.
  4. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  5. أضف 5 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.1 M) إلى العينات لزيادة الرقم الهيدروجيني إلى 7.0.
  6. قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل وتجميدها (lyophilize) طوال الليل.
  7. أضف 2 ميكرولتر من محلول APTS (5 ملغ من APTS في 50 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي 15٪) و 2 ميكرولتر من سيانوبوروهيدريد الصوديوم (1 متر) إلى الجليكوجين المجفف بالتجميد.
  8. أجهزة الطرد المركزي العينات في 4000 × غرام لمدة 2 دقيقة.
  9. احتضان العينات عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في الظلام.
    ملاحظة: يمكن تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم لحماية المحتويات من الضوء.
  10. أضف 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى العينات وقم بدومها حتى يذوب كل الراسب.
  11. أجهزة الطرد المركزي العينات في 4000 × غرام لمدة 2 دقيقة.
  12. نقل حصص من 50 ميكرولتر إلى قوارير دقيقة من الكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE) لتحليلها.
    ملاحظة: تظهر البيانات على أنها الوفرة النسبية للسلاسل (غير المتفرعة) (Nde (X)) لكل درجة من درجات البلمرة (DP ، الرمز X).

7. تحليل توزيعات الحجم الجزيئي (الشكل 5)

  1. قم بإذابة 0.5 مجم من الجليكوجين المجفف بالتجميد في 50 مللي مول من نترات الأمونيوم و 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 1 مجم / مل.
  2. احتضان العينات في خلاط حراري عند 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات عند 300 دورة في الدقيقة.
  3. قم بحقن العينات في نظام SEC باستخدام عمود مسبق وأعمدة 1000 Å و 10000 Å عند 80 درجة مئوية بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة (انظر جدول المواد). استخدم كاشف معامل الانكسار لتحديد الوزن النسبي للجزيئات عند كل حجم شطف.
  4. باستخدام معايير بولولان (PSS) مع كتل مولية تتراوح من 342 إلى 1.22 × 106 ، ارسم منحنى معايرة عالمي SEC لتحويل وقت الشطف إلى Rh (نصف القطر الهيدروديناميكي). التعبير عن البيانات من كاشف معامل الانكسار التفاضلي (DRI) كتوزيع وزن SEC w (log Rh) كدالة ل Rh.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في حين أن الإجراء الموصوف أعلاه هو الطريقة المثلى (30٪ سكروز مع إضافة خطوة غليان مدتها 10 دقائق) ، يتم توفير البيانات هنا للجليكوجين المستخرج عبر ثلاثة تركيزات من السكروز (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) ، مع وبدون خطوة غليان ، كما هو موضح سابقا21. وفقا للبروتوكول ، يتم إعطاء النقاء والعائد الخام وإنتاج الجليكوجين للجليكوجين الجاف المستخرج بظروف مختلفة في الجدول 1 ، المستنسخ من21. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في المحصول الخام وإنتاج الجليكوجين بين المجموعات المستخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بنية الجليكوجين مهمة لخصائصه. على سبيل المثال ، يؤثر الحجم الجزيئي على معدل تحلل الجليكوجين10 ، ويؤثر توزيع طول السلسلة على قابليته للذوبان26. لفهم هذه العلاقات بشكل صحيح ، من المهم استخراج الجليكوجين بإجراء يعزل ، قدر الإمكان ، عينة تمثيلية وغير تالفة. تستخدم الطرق التقليدية للاستخراج إما الظروف القلوية الساخنة أو الحمض البارد. في حين أن هذه الطرق فعالة في فصل الجليكوجين عن مكونات الأنسجة الأخرى ، إلا أنها قاسية كيميائيا وقد ثبت أنها تؤدي إلى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

ويعرب المؤلفان عن امتنانهما للسيد غاوشينغ وو والآنسة يونوين تشو على المساعدة التقنية التي قدمها مع FACE والسيد زينشيا هو والسيد دنغبين للمساعدة التقنية مع لجنة الأوراق المالية والبورصات. ويدعم ماس زمالة كوينزلاند المتقدمة لبحوث الصناعة، ومؤسسة ماتر، وأمناء الأسهم، ومؤسسة إل جي ماكالام إست وجورج ويبر تراستس. تم دعم هذا العمل من خلال البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو ، ومنحة مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية C1304013151101138 ، وبرنامج مواهب جيانغسو للابتكار وريادة الأعمال لعام 2017. تم إنشاء الشكل 1-5 باستخدام BioRender.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
8-أمينوبيرين -1،3،6-ثلاثي سلفونات (APTS)SIGMA Aldrich93410.1 M محلول
حمض الخليكSIGMA Aldrich6950920.1 م ، محلول الأس الهيدروجيني 3.5
Agilent 1260 Infinity SECنظام Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC)
BKS-DB / Nju الفئران خلفيةنانجينغ مؤسسة البحوث الطبية الحيوية بجامعة نانجينغ
مجموعة فحص الجلوكوز D-(تنسيق GOPOD)MegazymeK-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA)SIGMA Aldrich431788
الخالطIKAT 25
حمض الهيدروكلوريكSIGMA Aldrich21040.1 M محلول
حمض الهيدروكلوريكSIGMA Aldrich21040.1 M
نظام P / ACE MDQ plusAb Sciex ،الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور الأمريكي
كاشف معامل الانكسارOptilab UT-rEX ، وايت ، سانتا باربرا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)استبعاد الحجم (SEC)
أسيتات الصوديومSIGMA Aldrich2412451 م ، محلول الأس الهيدروجيني 4.5
أزيد الصوديومSIGMA AldrichS2002
كلوريد الصوديومSIGMA AldrichS9888
سيانوبوروهيدريد الصوديومSIGMA Aldrich156159محلول 1 م
فلوريد الصوديومSIGMA Aldrich201154
هيدروكسيد الصوديومSIGMA Aldrich43617محلول 0.1 M
نترات الصوديومSIGMA AldrichNISTRM8569
بيروفوسفات الصوديومSIGMA Aldrich221368
SucroseSIGMA AldrichV90016
SUPREMA قبل العمود ، 1,000 و 10,000 عمودخدمات معايير البوليمر ، ماينز ، ألمانياكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC)
أنابيب الطرد المركزي TrizmaSIGMA AldrichT 1503
Beckman4 مل ، أنبوب فائق الوضوح Thinwall مفتوح ، 11 × 60 مم
(FACE) كروماتوغرافيا

المراجع

  1. Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
  2. Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
  3. Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
  4. Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
  5. Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
  6. Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
  7. Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
  8. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  9. Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
  10. Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
  11. Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
  12. Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
  13. Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
  14. Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
  15. Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526(2020).
  16. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  17. Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
  18. Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
  19. Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
  20. Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
  21. Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887(2020).
  22. Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214(2020).
  23. Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
  24. Kerly, M. The solubility of glycogen. The Biochemical Journal. 24, 67-76 (1930).
  25. Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
  26. Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
  27. Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
  28. Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استخلاص الجليكوجينتدرج كثافة السكروزنقاء الجليكوجينتجانس الأنسجةالترسيب بالإيثانولخطوة الغليانجزيئات جليكوجين بيتامرض تخزين الجليكوجين
استخراج جزيئات الجليكوجين في الكبد لتحديد بنية الجليكوجين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.