Method Article

معالجة عينات البروتينات البندقية آلية بواسطة روبوت مختبر مفتوح المصدر

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير بروتوكول مفصل وثلاثة نصوص بايثون لتشغيل نظام مناولة سائل روبوتي مفتوح المصدر لإجراء إعداد عينة بروتين شبه آلية لتجارب قياس الطيف الكتلي ، والتي تغطي إزالة المنظفات ، وهضم البروتين ، وخطوات تحلية الببتيد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب تجارب بروتينات البندقية القائمة على قياس الطيف الكتلي خطوات متعددة لإعداد العينات، بما في ذلك هضم البروتين الأنزيمي وتنظيفه، والتي يمكن أن تستغرق ساعات كبيرة من العمل على مقاعد البدلاء وتمثل مصدرا للتباين من دفعة إلى أخرى. يمكن أن تؤدي أتمتة المختبرات باستخدام روبوتات السحب إلى تقليل العمل اليدوي وزيادة الإنتاجية وزيادة قابلية إعادة إنتاج البحوث. ومع ذلك ، فإن الأسعار الأولية الباهظة لمحطات الأتمتة القياسية تجعلها غير ميسورة التكلفة للعديد من المختبرات الأكاديمية. توضح هذه المقالة سير عمل إعداد عينات البروتينات باستخدام نظام أتمتة مفتوح المصدر ميسور التكلفة (The Opentrons OT-2)، بما في ذلك إرشادات لإعداد خطوات تقليل البروتين والألكلة والهضم والتنظيف شبه الآلية؛ بالإضافة إلى مرافقة نصوص بايثون مفتوحة المصدر لبرمجة نظام OT-2 من خلال واجهة برمجة التطبيقات الخاصة به.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد بروتينات البندقية القائمة على قياس الطيف الكتلي أداة قوية لقياس وفرة العديد من البروتينات في العينات البيولوجية في وقت واحد. يتم استخدام تجارب البروتينات مع تحليل المعلوماتية الحيوية بشكل روتيني لتحديد المؤشرات الحيوية واكتشاف المجمعات والمسارات البيولوجية المرتبطة بها التي تدعم الآليات المرضية. بفضل خصوصيتها التحليلية العالية ودقتها الكمية المحتملة ، تتمتع بروتينات البندقية أيضا بإمكانات ممتازة لاعتمادها من قبل مرافق البحوث ومختبرات التشخيص لتحليل العينات السريرية دون الحاجة إلى الاعتماد على الأجسام المضادة1,2.

لإعداد عينات البروتين لتحليل البروتينات البندقية ، عادة ما تحتاج ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إيداع نصوص Python المطورة على GitHub على: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. وترد نسخة من البرامج النصية في الملف التكميلي 1. يرجى الرجوع إلى مستودع GitHub للحصول على أحدث الإصدارات.

1. الاستعدادات التجريبية

  1. تحقق من الأجهزة المطلوبة قبل بدء البروتوكول.
    ملاحظة: مكونات الأجهزة التالية مطلوبة: ماصات OT-2 ، نصائح الماصة ، مجموعة حامل الأنبوب 4 في 1 ، مجموعة كتل الألومنيوم ، الوحدة المغناطيسية ، وحدة درجة الحرارة ، لوحات الآبار العميقة 96-well 2 مل (انظر جدول المواد).

2. إعداد عينة قياس الطيف الكتلي (MS) باستخدام ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير ثلاثة نصوص Python هنا متوافقة مع الروبوت OT-2 ، والتي تقوم بإعداد عينة لبروتينات قياس الطيف الكتلي مع ألبومين مصل البقر القياسي للبروتين الواحد (النسخ المتماثلة التقنية n = 5 عمليات الهضم) وعينة من تحلل القلب البشري المحتوي على المنظفات (n = 5 عمليات هضم). يتم تقسيم كل منتج هضم إلى تفاعلين لتنظيف الببتيد. يظهر الشكل 4 والشكل 5 عدد تطابقات طيف الببتيد المحددة (PSMs) والببتيدات والبروتينات في كل جولة من عينات BSA والقلب. تم تحديد متوسط 728 PSMs و 65 البب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
للحصول على أفضل أداء، يجب استخدام البرامج المخبرية والوحدات والمواد الاستهلاكية المتوافقة مع OT-2 التي تم التحقق منها من Opentrons. يمكن إنشاء برامج مختبرية مخصصة باتباع تعليمات Opentrons في Reference14. تأكد من معايرة سطح OT-2 والماصات وأدوات المختبر عند استخدامها لأول مرة. من الأهمية بمكان أيضا اتباع الإرشادات من الشركة المصنعة لخرز SP3 لإعداد الخرز لتنظيف الببتيد والبروتين. والجدير بالذكر أنه أثناء تفاعل ربط الخرزة والببتيد ، يجب أن يكون حج.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ أي تعارضات للإعلان عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة F32-HL149191 إلى YH. R00-HL144829 إلى EL ؛ R21-HL150456، R00-HL127302، R01-HL141278 إلى MPL. يتم إنشاء الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 بمساعدة أداة توضيح علمية على شبكة الإنترنت ، BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 وميكرو ؛ نصائح ماصة Lمجموعة رف الأنبوب Opentrons
4 في 1Opentronsتشتمل كل مجموعة على 2 حوامل قاعدة و 4 أسطح حامل أنبوب 1.5 مل و 2 مل و 15 مل + 50 مل و 15 مل و 50 مل. نستخدم 2 مل و 15 مل + 50 مل قمم في هذه الدراسة.
إشادة PepMap 100 C18 HPLC العمودالحراري العلمي# 1645683 & م جسيم 100 & أرينج; المسام; 75 و مو ؛ م × 150 مم
أسيتونيتريل LC-MS درجةVWR
مجموعة بلوك الألومنيومOpentronsتشتمل مجموعة الكتل هذه على 3 قمم متوافقة مع أنابيب 96 بئر و 2.0 مل وشريط PCR لاستخدامه مع وحدة درجة الحرارة OT-2. نستخدم حامل الأنبوب سعة 2.0 مل في هذه المخطوطة.
بيكربونات الأمونيومسيجما ألدريتش# A6141
معيار ألبومين مصل الأبقار ، 2 مجم / ملحراري علمي# 23210
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) LC-MS درجةحراري علمي# 85190
DithiothreitolSigma-Aldrich#D5545
أعمدة HPLC سهلة الرشحراريعلمية#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
دليل على الإيثانول 195-200فيشر# 04-355-720
حمض الفورميك LC-MS درجةحراري علمي# 85178
تحلل قلب الإنسانNovus BiologicalsNB820-59217
IodoacetamideSigma-Aldrich#I1149
رفأنبوب مغناطيسيThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al. ، 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini CentrifugeThermo Scientific# 75004061جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة للدوران السريع
NEST 2 مل 96 بئر لوحة بئر عميقة ، وحدة مغناطيسية V BottomOpentrons
OT-2OpentronsGEN1
ماصة أحادية القناة OT-2 P300OpentronsGEN1
OT-2 P50 ماصة أحادية القناةروبوت ماصة OpentronsGEN1
OT-2OpentronsOT-2
OT-2OpentronsGEN1
بيرس كمية فحص الببتيد اللونيةالحرارية العلمية# 23275
أنابيب البروتين LoBind 2.0 ملEppendorf# 022431102
قاعدة بيانات تسلسل البروتينUniProt / SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640٪
20 مراجعة: نعم
الجسيمات المغناطيسية المعدلة من الكربوكسيل Sera-Mag SpeedBead ،Cytivaللماء # 65152105050250
الجسيمات المغناطيسية المعدلة من الكربوكسيل Sera-Mag SpeedBead ، HydrophylicCytiva# 45152105050250
SpeedVacThermo Scientificالمبخر
Thermo Q Exactive HF مطياف الكتلةالحراري العلمي#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
التربسين MS الصفالحراري العلمي# 90057
الماء LC-MS الصفVWR#BDH83645.400
#JT9829 وحدة درجة الحرارة الكارهة فراغ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue anal....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Shotgun ProteomicsSample PreparationLab AutomationOpen Source RobotProtein DigestionMass SpectrometryLiquid Handling SystemPython Automation ScriptsProtein ReductionPeptide Cleanup

Related Articles