مقالة منهجية

عزل وتكاثر وتحديد الأنواع البكتيرية ذات خصائص استقلاب الهيدروكربون من الموائل المائية

DOI:

10.3791/63101

⸱

ديسمبر 7, 2021

 , 
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم عملية عزل وتكاثر وتوصيف البكتيريا المسببة للهيدروكربون من الموائل المائية. يحدد البروتوكول العزل البكتيري ، والتعرف عليه بطريقة 16S rRNA ، واختبار قدرتها على تحلل الهيدروكربونات. ستساعد هذه المقالة الباحثين في توصيف التنوع البيولوجي الميكروبي في العينات البيئية ، وعلى وجه التحديد فحص الميكروبات ذات إمكانات المعالجة البيولوجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الملوثات الهيدروكربونية متمردة على التدهور وتراكمها في البيئة سام لجميع أشكال الحياة. تشفر البكتيريا العديد من الإنزيمات التحفيزية وهي قادرة بشكل طبيعي على استقلاب الهيدروكربونات. يسخر العلماء التنوع البيولوجي في النظم الإيكولوجية المائية لعزل البكتيريا ذات التحلل البيولوجي وإمكانية المعالجة البيولوجية. توفر هذه العزلات من البيئة مجموعة غنية من المسارات والإنزيمات الأيضية ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لتوسيع نطاق عملية التحلل على نطاق صناعي. في هذه المقالة ، نوضح العملية العامة لعزل الأنواع البكتيرية من الموائل المائية وانتشارها وتحديدها وفحص قدرتها على استخدام الهيدروكربونات كمصدر وحيد للكربون في المختبر باستخدام تقنيات بسيطة. يصف هذا البروتوكول عزل الأنواع البكتيرية المختلفة وتحديدها لاحقا باستخدام تحليل 16S rRNA. ويعرض البروتوكول أيضا خطوات لتوصيف العزلات البكتيرية لإمكانية تحلل الهيدروكربونات. سيكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين الذين يحاولون عزل الأنواع البكتيرية عن الموائل البيئية لتطبيقاتها في مجال التكنولوجيا الحيوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم الهيدروكربونات (HC) على نطاق واسع كوقود وفي التطبيقات الكيميائية. تستخدم الهيدروكربونات العطرية مثل البنزين والتولوين والزيلين على نطاق واسع كمذيبات1. تعمل الألكينات مثل الإيثيلين والبروبيلين كسلائف في تخليق بوليمرات البولي إيثيلين والبولي بروبيلين ، على التوالي. بلمرة هيدروكربون آخر ، الستايرين يشكل البوليسترين. تدخل الأنشطة البشرية الهيدروكربونات في البيئة أثناء إنتاجها ونقلها. إن تلوث التربة والمياه بالهيدروكربون له مخاوف جدية على البيئة وصحة الإنسان. تلعب الميكروبات دورا رئيسيا في الحفاظ على النظام البيئي من خلال تنظيم الدورات البيوجيوكيميائية واستخدام مجموعة واسعة من الركائز ، والتي تشمل الملوثات و xenobiotics أيضا ، وتحويلها إلى مصدر للكربون والطاقة. تعرف عملية إزالة السموم من الملوثات البيئية بواسطة الكائنات الحية الدقيقة باسم المعالجة الحيوية3،4،5،6،7.

تم العثور على الكائنات الحية الدقيقة مع القدرة على تحلل الهيدروكربونات في الموائل المائية والتربة8،9،10. تم تحديد العديد من البكتيريا التي لديها القدرة على تحلل الألكانات وHCs العطرية ، مثل Pseudomonas و Acinetobacter و Rhodococcus و Marinobacter و Oleibacter11. ساعد تطوير مناهج متقدمة تقنيا مستقلة عن الثقافة في اكتشاف مجتمعات ميكروبية جديدة مهينةHC 12. يتم تضخيم المواد الجينومية المعزولة مباشرة من عينات المصدر وتسلسلها بطرق إنتاجية عالية مثل تسلسل الجيل التالي (NGS) متبوعا بالتحليل مما يلغي الحاجة إلى زراعة الكائنات الحية الدقيقة. طرق NGS ، مثل تحليل metagenome ، باهظة الثمن وتعاني من عيوب تتعلق بعملية التضخيم13. لا تزال تقنيات الزراعة مثل ثقافة التخصيب الانتقائي14 التي تستهدف عزل الميكروبات المهينة للهيدروكربونات مفيدة لأنها تسمح للباحثين بالتحقيق والتلاعب بالمسارات الأيضية في العزلات البكتيرية.

يكشف عزل الحمض النووي الجينومي والتسلسل اللاحق للمادة الجينومية عن معلومات قيمة عن أي كائن حي. يساعد تسلسل الجينوم الكامل في تحديد الجينات التي ترمز لمقاومة المضادات الحيوية ، وأهداف الأدوية المحتملة ، وعوامل الفوعة ، والناقلات ، وإنزيمات استقلاب الزينوبيوتيك ، إلخ15،16،17. ثبت أن تسلسل جين تشفير 16SrRNA هو تقنية قوية لتحديد السلالات البكتيرية. إن الحفاظ على تسلسل الجينات ووظيفتها على مر السنين يجعلها أداة موثوقة لتحديد البكتيريا غير المعروفة ومقارنة العزلة مع أقرب الأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طول هذا الجين هو الأمثل لتحليل المعلوماتية الحيوية18. كل هذه الميزات إلى جانب سهولة تضخيم الجينات باستخدام الاشعال العالمية وتحسين تكنولوجيا تسلسل الجينات تجعلها معيارا ذهبيا لتحديد الميكروبات.

هنا ، نصف إجراء لاستعادة الكائنات الحية الدقيقة القابلة للزراعة مع إمكانية تحلل HC من العينات البيئية. توضح الطريقة الموضحة أدناه جمع وتحديد البكتيريا المهينة ل HC وتنقسم إلى خمسة أقسام: (1) جمع البكتيريا من عينات المياه ، (2) عزل الثقافات النقية ، (3) استكشاف قدرة تحلل HC للعزلات البكتيرية (4) عزل الحمض النووي الجينومي ، و (5) تحديد الهوية بناء على تسلسل جين 16S rRNA وتحليل BBLAST. يمكن تكييف هذا الإجراء لعزل البكتيريا للعديد من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جمع العينات ومعالجتها وتحليلها

ملاحظة: نقدم هنا بروتوكولا لعزل البكتيريا عن الموائل المائية. قد تكون بعض العزلات مسببة للأمراض ، لذلك ، ارتداء القفازات وتطهير منطقة العمل قبل وبعد الاستخدام.

  1. اجمع 500 مل من عينة الماء في خمس زجاجات زجاجية معقمة من مواقع مختلفة من الجسم المائي. قم بقياس درجة الحموضة ودرجة الحرارة لكل عينة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ومقياس الحرارة ، على التوالي.
    ملاحظة: البروتوكول ليس خاصا بالموقع ويمكن تكييفه بسهولة لعزل الكائنات الحية عن المسطحات المائية الملوثة بالهيدروكربونات أيضا.
  2. قم بتصفية العينة في دفعة من 100 مل إلى صفائح ترشيح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر ، في ظروف معقمة.
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز قطر ورق الترشيح قطر طبق بتري. على سبيل المثال ، ورق الترشيح الذي لا يتجاوز قطره 85 مم هو الأمثل لطبق بتري 100-120 مم.
  3. احتفظ بأوراق الترشيح على لوحات وسائط المغذيات المختلفة (PYE 19 و R2A 20 وM9 و LB و NB و TSB و M63 21 و M2G22). تسمح الأنواع المختلفة من وسائط النمو باختيار وإثراء الكائنات الحية الدقيقة المختلفة. يتم سرد تركيبات وسائط النمو المختلفة في الجدول 1. استخدم ورقة واحدة لكل لوحة وسائط وانزع بعد 2 ساعة باستخدام ملقط معقم.
  4. قم بتخفيف عينات المياه غير المفلترة بشكل متسلسل (106 تخفيف) في ماء مقطر مزدوج معقم بإضافة 100 ميكرولتر من عينة الماء المجمعة في 900 ميكرولتر من الماء المعقم. ينتج عن هذا تخفيف 1:10. من هذه العينة ، خذ 100 ميكرولتر وأضف 900 ميكرولتر من الماء المعقم للحصول على تخفيف 1: 100. كرر التخفيف حتى تصبح طية التخفيف 1: 1,000,000. تخلط عن طريق الماصة. سيكون الحجم النهائي لكل تخفيف 1 مل.
  5. انشر 100 ميكرولتر من عينة الماء المخفف بشكل فردي على جميع ألواح وسائط النمو المذكورة في الخطوة 3 في ثلاث نسخ.
  6. احتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة اعتمادا على نمو المستعمرات.
    ملاحظة: تنمو معظم العزلات البيئية عند درجة حرارة مثالية تبلغ 30 درجة مئوية. في حالة عزل العينات من بيئة ذات درجات حرارة قصوى ، احتضان الألواح في نفس درجة حرارة موقع التجميع.
  7. بعد ذلك ، اختر المستعمرات باستخدام عود أسنان معقم أو طرف ماصة وقم بإجراء خطوط رباعية للحصول على مستعمرات معزولة.
  8. احتضان لوحات بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بفحص المستعمرات بناء على ميزاتها المورفولوجية مثل اللون والملمس والشكل والحجم والهامش والارتفاع وما إلى ذلك. أعد المستعمرات للحصول على ثقافات نقية.
  9. أداء تلطيخ غرام من كل ثقافة نقية23 والمضي قدما في إعداد الأسهم الجلسرين.
  10. لتحضير مخزون الجلسرين ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة في 3 مل من وسائط النمو المناسبة واحتضانها عند 30 درجة مئوية. من الثقافة الليلية ، خذ 700 ميكرولتر وأضف 300 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ (معقم بواسطة التعقيم) في cryovials24. قم بتجميد القوارير عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

2. تدهور الهيدروكربونات

ملاحظة: المثال أدناه هو فحص العزلات التي يمكن أن تتحلل من الستايرين. وهو تعديل طفيف للطريقة التي تم تكييفها في تقرير سابق25. اتبع الخطوات في ظل ظروف معقمة.

  1. من طبق مخطط حديثا ، اختر مستعمرة وقم بتلقيحها في 5 مل من مرق الصويا التربتيك (TSB) / مرق المغذيات (NB). قم بتنمية الثقافة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة حتى يصل الامتصاص ~ 2.
    ملاحظة: بخلاف TSB/NB، يمكن اختيار أي وسط نمو تصل فيه البكتيريا إلى كثافة عالية للخلايا.
  2. في اليوم التالي ، قم بحبيبات الخلايا عند 2862 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  3. اغسل الحبيبات مرتين ب 2 مل من محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم) وقم بتدويره عند 2862 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: المحلول الملحي متساوي التوتر ، وبالتالي فهو يحافظ على الضغط الاسموزي داخل الخلايا البكتيرية.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من الوسط القاعدي السائل الخالي من الكربون (LCFBM). قياس الامتصاص (OD600).
  5. خذ دورقين من Erlenmeyer معقمين بسعة 150 مل للتحكم والمجموعة التجريبية. قم بتسميتها ك A و B.
  6. في المجموعة غير الملقحة / الضابطة ، (القارورة A) ، أضف 40 مل من LCFBM والستايرين (5 mM).
  7. في القارورة B ، أضف 35 مل من LCFBM والستايرين (اضبط التركيز النهائي للستايرين على 5 mM). أضف تعليق الخلية مع ODنهائي 600 من الخلايا ≈ 0.1 وتشكل الحجم المتبقي مع LCFBM حتى 40 مل. احتضان القوارير عند 30 درجة مئوية مع الهز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 يوما.
    ملاحظة: يمكن أن تكون الهيدروكربونات الزائدة سامة للميكروبات ، وبالتالي ، تبدأ بتركيز منخفض وتزيده تدريجيا.
  8. كرر ما سبق لكل سلالة إضافية يجب تقييمها لتدهور الهيدروكربونات.
  9. قم بقياسOD 600 لكل قارورة كل 5 أيام وارسم منحنى النمو. زيادة الحضانة لمدة تصل إلى 45 يوما إذا تمكنت البكتيريا من استخدام الستايرين. تشير الزيادة في OD600 إلى أن البكتيريا يمكنها استقلاب الستايرين.

3. فحص تحلل الكاتيكول بواسطة العزلات البكتيرية

ملاحظة: إن تحلل الهيدروكربونات العطرية مثل الستايرين والبنزين والزيلين والنفتالين والفينولات وما إلى ذلك ينتج الكاتيكولات كوسيط تفاعل. يتم استقلاب الكاتيكولات بشكل أكبر بواسطة البكتيريا بمساعدة إنزيمات الكاتيكول 1،2-ديوكسيجيناز والكاتيكول 2،3-ديوكسيجيناز من خلال مسارات الانقسام الأورثو والتلوي ، على التوالي26. تشارك هذه الإنزيمات أيضا في تحلل الهيدروكربونات الأخرى مثل كلورو بنزين27. يستخدم البروتوكول المذكور أدناه محللات الخلية الكاملة لمقايسة إنزيم الكاتيكول 2 ، 3-ديوكسيجيناز28. يمكن استخدام نفس طريقة التحلل لفحص نشاط الكاتيكول 1،2-ديوكسيجيناز. ومع ذلك ، فإن تكوين خليط التفاعل يختلف. كلا الإنزيمين قابلان للحث بطبيعتهما ويمكن تحفيزهما بإضافة الفينول إلى وسط النمو.

  1. بمساعدة حلقة معقمة ، قم بتلقيح المستعمرة البكتيرية من صفيحة مخططة حديثا إلى وسط الأملاح المعدنية (MSM) المكمل ب 1-4 مللي متر من الفينول. احتضان الثقافة عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. حصاد الاستزراع عند 4 درجات مئوية عندما يصل OD 600 بين 1.4-1.6 (أي في المرحلة الأسية المتأخرة) عن طريق الدوران عند4500 × جم لمدة 20 دقيقة.
  2. اغسل بيليه الخلية بمحلول الفوسفات (0.5 م ، درجة الحموضة 7.5).
  3. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للفوسفات المذكور أعلاه واضبط OD600 ≈ 1.0 النهائي.
  4. تحلل الخلايا عن طريق صوتنة نابضة لمدة 1.5 دقيقة ، ومدة كل نبضة 15 ثانية. بعد هذه الخطوة ، يجب أن يكون التعليق واضحا أو أقل تعكرا. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بزيادة عدد النبضات وتحقق مما إذا كان التعليق واضحا. بعد كل نبضة ، احتفظ بالعينة على الثلج لتجنب تدهور البروتين.
  5. قم بإزالة بقايا الخلايا والخلايا غير المكسورة عن طريق الطرد المركزي عند 9000 × جم لمدة 30 دقيقة ، مع الحفاظ على درجة الحرارة الباردة (4 درجات مئوية).
  6. ماصة بعناية طاف واضح. يحتوي هذا الجزء على المستخلص الخام لفحص الإنزيم.
  7. حدد تركيز البروتين في المستخلص الخام إما بطريقة برادفورد أو لوري29,30.
  8. لتحديد نشاط الكاتيكول 2،3-ديوكسيجيناز ، قم بقياس تكوين المنتج النهائي للتفاعل (2-هيدروكسي موكونيك سيميالدهيد) بواسطة مقياس الطيف.
  9. تحضير خليط التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من الكاتيكول (50 مللي مول) ، 960 ميكرولتر من الفوسفات العازلة (50 مللي مول ، درجة الحموضة 7.5) ، و 20 ميكرولتر من المستخلص الخام.
  10. للتحكم السلبي ، استبدل المستخلص الخام بمخزن الفوسفات واضبط الحجم النهائي على 1 مل.
  11. احتضان خليط التفاعل لمدة 30 دقيقة. في فترات زمنية محددة ، قم بقياس الامتصاص عند 375 نانومتر. تشير الزيادة في الامتصاص إلى تكوين المنتج النهائي للتفاعل ، 2-hydroxymuconic acid semialdehyde (2-HMS). قم بإجراء التجربة في ثلاث نسخ.
    ملاحظة: الكاتيكول حساس للضوء وحساس للأكسجين. قم بتخزين خليط التفاعل في الظلام وأغلق الأنابيب بإحكام لمنع التدهور الطبيعي للكاتيكول.

4. عزل الحمض النووي الجينومي للثقافة النقية

ملاحظة: هذا هو البروتوكول العام لعزل الحمض النووي الجينومي. تم إجراء تلطيخ الجرام أثناء خطوة جمع العينات ومعالجتها وتحليلها. بسبب الاختلاف في سمك جدار الخلية للبكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام ، يتم تعديل طريقة تحلل الخلية وفقا لذلك. ارتد قفازات أثناء عزل وتطهير طاولة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول لتجنب النيوكلياز من تدهور الحمض النووي. بعض المواد الكيميائية المذكورة أدناه يمكن أن تسبب حروقا شديدة على الجلد ويجب توخي الحذر المناسب أثناء التعامل معها.

  1. عزل الحمض النووي الجينومي من البكتيريا سالبة الجرام31.
    1. اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيحها في وسط نمو جديد في أنابيب اختبار معقمة.
    2. ضع الأنابيب في شاكر حاضنة عند 200 دورة في الدقيقة واسمح للبكتيريا بالنمو طوال الليل عند 30 درجة مئوية.
    3. في اليوم التالي ، بيليه 1.5 مل من الثقافة المزروعة بين عشية وضحاها عند 12,400 × جم لمدة 3 دقائق.
    4. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول التحلل (40 مللي متر من أسيتات Tris ، درجة الحموضة 7.8 ، 20 مللي متر أسيتات الصوديوم ، 1 مللي مول EDTA ، 1٪ SDS).
    5. أضف 66 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم (5 م) واخلطه جيدا.
    6. يخفق الخليط الناتج عند 12400 × جم لمدة 10 دقائق (4 درجات مئوية).
    7. ماصة طاف واضح في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وإضافة حجم متساو من الكلوروفورم.
    8. اقلب خلط المحلول عدة مرات حتى يتم ملاحظة محلول حليبي.
    9. قم بالدوران عند 12400 × جم لمدة 3 دقائق وانقل المادة الطافية إلى قنينة نظيفة.
    10. أضف 1 مل من الإيثانول المثلج 100٪ ؛ امزج عن طريق الانعكاس حتى تترسب خيوط بيضاء من الحمض النووي.
    11. قم بطرد الحمض النووي المترسب عند 2200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    12. اغسل حبيبات الحمض النووي ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ واترك حبيبات الحمض النووي تجف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    13. بمجرد التجفيف ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من 1x Tris-EDTA (TE) buffer ، وقم بتخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية.
    14. قياس التركيز (A260/280) باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتشغيل الحمض النووي على هلام الأغاروز (1٪) لتقييم جودة الحمض النووي24.
  2. عزل الحمض النووي الجينومي من سلالة إيجابية الجرام32
    1. اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيحها في وسط نمو جديد في أنابيب اختبار معقمة.
    2. ضع الأنابيب في شاكر حاضنة عند 200 دورة في الدقيقة واسمح للبكتيريا بالنمو طوال الليل عند درجة حرارة نمو مناسبة.
    3. في اليوم التالي ، خذ 1.5 مل من المستزرع المزروع وأجهزة الطرد المركزي عند 8600 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت TE.
    5. اضبط OD600 = 1.0 باستخدام المخزن المؤقت TE وانقل 740 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب microfuge نظيف.
    6. أضف 20 ميكرولتر من الليزوزيم (100 مجم / مل من المرق ) واخلطه جيدا عن طريق الماصة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (في حمام جاف).
    7. أضف 40 ميكرولتر من 10٪ SDS واخلطها جيدا.
    8. أضف 8 ميكرولتر من بروتيناز K (10 مجم / مل). تخلط جيدا وتحتضن عند 56 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعات (في حمام جاف). يجب أن يصبح التعليق واضحا الآن مع زيادة اللزوجة ، مما يشير إلى تحلل الخلية الفعال.
      ملاحظة: يمكن ترك التعليق طوال الليل إذا لم يتم تحليل الخلايا بشكل صحيح.
    9. سخني خليط CTAB / NaCl على حرارة 65 درجة مئوية (في حمام جاف) وأضيفي 100 ميكرولتر من هذا الخليط إلى تعليق الخلية. تخلط جيدا.
    10. احتضان في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (في حمام جاف).
    11. أضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (24: 1) واخلطه جيدا. تدور عند 16900 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية.
    12. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مع تجنب المرحلة العضوية (المرحلة اللزجة في الأسفل).
    13. أضف بعناية 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (25:24:1) واخلطه جيدا. تدور عند 16900 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية.
    14. خذ المرحلة المائية في أنبوب طرد مركزي جديد. أضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (24: 1) واخلطه جيدا.
    15. نقل المرحلة المائية وإضافة 0.6 حجم الأيزوبروبانول (المبردة مسبقا في -20 درجة مئوية).
    16. يجب أن تكون خيوط الحمض النووي المترسبة مرئية في صورة خيطية. احتضان في -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إلى ليلة وضحاها.
    17. أجهزة طرد مركزي عند 16,900 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتكوير الحمض النووي.
    18. صب الأيزوبروبانول بعناية واغسل الحبيبات ب 1 مل من الإيثانول البارد 70٪ (المبرد مسبقا عند -20 درجة مئوية) لإزالة أي شوائب.
    19. أجهزة طرد مركزي عند 16900 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
    20. اترك الحبيبات تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة أو احتفظ بالأنبوب عند 37 درجة مئوية. تأكد من عدم تجفيف الحبيبات أكثر من اللازم.
    21. أعد التعليق في 100 ميكرولتر من 1x TE buffer وقم بتخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا أصبحت الحبيبات جافة بشكل مفرط ويصعب إنعاشها ، فقم باحتضان أنبوب الطرد المركزي الدقيق بحبيبات الحمض النووي والماء الخالي من النيوكلياز عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة وأعد تعليقه مرة أخرى عن طريق الماصة.
    22. قم بقياس التركيز (A260/280) باستخدام مقياس الطيف الضوئي بعد إجراء تخفيف 1: 100 في 1x TE buffer وتشغيل الحمض النووي على هلام الأغاروز (1٪) لتقييم جودة الحمض النووي24.

5. تسلسل 16S rRNA

ملاحظة: البروتوكول الموضح أدناه مخصص لتضخيم وتسلسل 16S rRNA لتحديد البكتيريا. تستخدم المعلومات المستمدة من تسلسل 16S rRNA لتحديد كائن غير معروف وإيجاد العلاقة بين الكائنات الحية المختلفة.

  1. لتحديد السلالات ، قم بتضخيم الحمض النووي المعزول من الثقافات البكتيرية النقية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات العالمية التي تستهدف تسلسل 16S rRNA للبكتيريا: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') و 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') 33.
  2. تحضير مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعلات 25 ميكرولتر) على الجليد مع 18 ميكرولتر من الماء المطهر / الخالي من النيوكلياز ، 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x ، 0.5 ميكرولتر من كل من البادئات الأمامية والخلفية (مخزون 100 ميكرومتر) ، 2 ميكرولتر من مزيج dNTPs (مخزون 100 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (2-15 نانوغرام / ميكرولتر) و 1 وحدة من Taq Polymerase.
  3. استخدم شروط الدورة التالية لتضخيم جين 16S rRNA: تمسخ أولي عند 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، (تمسخ نهائي عند 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، تلدين تمهيدي عند 56 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، تمديد عند 74 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة) × 30 دورة ، تمديد نهائي عند 74 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. بعد انتهاء الدورة ، امزج 5 ميكرولتر من العينة و 1 ميكرولتر من صبغة تحميل الحمض النووي 5x. تشغيل على 1 ٪ هلام الاغاروز للتحقق من التضخيم. قم بتخزين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في درجة حرارة 4 درجات مئوية على المدى القصير أو قم بتجميدها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  5. بالنسبة لتسلسل جين 16S rRNA ، قم بإعداد نفس التفاعل كما هو مذكور أعلاه لحجم أكبر (100 ميكرولتر).
  6. قم بتنقية الأمبليكونات لتسلسل سانجر24,34 باستخدام مجموعة تنقية منتج PCR أو امزج العينة بأكملها مع صبغة تحميل الحمض النووي وتحميلها على هلام الأغاروز لأداء طريقة استخراج الهلام.
  7. بمجرد الانتهاء من التسلسل ، قم بتحويل ملف النتائج بتنسيق FASTA وتحقق من تشابه التسلسل مع أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST) على NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 35.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمثيل الرسم التخطيطي الذي يحدد الإجراء الكامل لعزل وفحص البكتيريا من الموائل المائية وتحديدها لاحقا بواسطة تحليل 16S rRNA في الشكل 1. تم جمع عينات المياه من الأراضي الرطبة في دادري ، الهند في زجاجات زجاجية معقمة وأخذت على الفور إلى المختبر لمعالجتها. تم تمرير العينات من خلال صفائح الترشيح بحجم مسام 0.22 ميكرومتر ، وتم الاحتفاظ بأوراق الترشيح على اتصال بألواح الوسائط المختلفة. بعد ساعتين ، تمت إزالة أوراق الترشيح ، وتم تحضين الألواح طوال الليل عند 30 درجة مئوية لتشكيل الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من الثابت أن ما يقرب من 1٪ فقط من البكتيريا على الأرض يمكن زراعتها بسهولة في المختبر6. حتى بين البكتيريا القابلة للزراعة ، لا يزال الكثير منها غير مميز. أعطت التحسينات في الأساليب الجزيئية بعدا جديدا لتحليل وتقييم المجتمعات البكتيرية. ومع ذلك ، فإن مثل هذه التقنيات لها قيود ، لكنها لا تجعل تحليلات الثقافة زائدة عن الحاجة. تظل تقنيات الاستزراع النقي لعزل الأنواع البكتيرية الفردية هي الآلية الأساسية لتوصيف الخصائص الفسيولوجية. تؤوي التربة والموائل المائية العديد من البكتيريا ذات الإنزيمات والمسارات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور كارثيك كريشنان وأعضاء مختبر RP على تعليقاتهم واقتراحاتهم المفيدة. يتم دعم DS من قبل زمالة SNU-PhD وزمالة معهد Earthwatch الهند. يتم دعم مختبر RP من خلال منحة CSIR-EMR وأموال بدء التشغيل من جامعة شيف نادار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AgaroseSigma-AldrichA4718هلام الرحلان الكهربائي
كلوريد الأمونيوم (NH4< / sub>Cl)Sigma-AldrichA9434نمو مكون متوسط
كبريتات الأمونيومSigma-AldrichA4418مكون متوسط النمو
Bacto-AgarMillipore1016141000تحضير الوسائط الصلبة
كلوريد الكالسيوم (CaCl2)MERCKC4901-500Gمكون متوسط النمو
CatecholSigma-Aldrich135011مقايسة تحلل الهيدروكربونات
Cetyltrimethylammonium bromide ، CTABSigma-AldrichH6269عزل الحمض النووي الجيني
الكلوروفورمHIMEDIAMB109عزل الحمض النووي الجيني
فوسفات ثنائي الصوديوم (Na2< / sub>HPO4< / sub>)Sigma-AldrichS5136مكون متوسط النمو
EDTASigma-AldrichE9884مكون عازلة gDNA
كبريتات الحديد ، سباعي الهيدرات (FeSO4< / sub>.7H2< / sub>0)Sigma-Aldrich215422مكون متوسط النمو
الجلوكوزسيجما-ألدريتشG7021متوسط
النمو الجلسرينمكون متوسط النمو Sigma-AldrichG5516؛ مخزون الجلسرين
الأيزوبروبانولHIMEDIAMB063عزل الحمض النووي الجيني
LB AgarDifco244520وسط
النمو لوريا بيرتاني (LB)Difco244620متوسط النمو
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4< / sub>) MERCKM2643مكون
متوسط النموالمنغنيز (II) كبريتات أحادية الهيدرات (MnSO4. H2< / sub>0)Sigma-Aldrich221287
مرق المغذيات متوسط المكون للنمو (NB)ميرك(ميليبور)03856-500Gمتوسط النمو
الببتونميرك91249-500Gمتوسط المكون
الفينولسيجما-ألدريتشP1037عزل الحمض النووي الجيني
فوسفات البوتاسيوم ، ثنائي القاعدة (K2< / sub>HPO4) < / sub>Sigma-AldrichP3786متوسط النمو
فوسفات البوتاسيوم ، أحادي القاعدة (KH2< / sub>PO4< / sub>)Sigma-AldrichP9791مكون متوسط
النمو Proteinase KThermoFisher ScientificAM2546عزل الحمض النووي
الجيني QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN160016235DNA تنقية
QIAquick PCR طقم تنقيةQIAGEN163038783تنقية الحمض النووي
R2A AgarMillipore1004160500متوسط النمو
SmartSpec Plus مقياس الطيف الضوئيBIO-RADقياسالامتصاص
4006221 أسيتات الصوديومSigma-AldrichS2889عزل الحمض النووي الجيني
كلوريد الصوديوم (NaCl)Sigma-AldrichS9888متوسط النمو
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) Sigma-AldrichL3771عزل الحمض النووي الجيني
ستايرينسيجما ألدريتشS4972التحلل البيولوجي للستايرين
Taq DNA PolymeraseNEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283إعادة تعليق الحمض النووي
مرق الصويا Tryptic (TSB)Merck22092-500Gمتوسط
النمو مستخلص الخميرةSigma-AldrichY1625-1KGنمو متوسط مكون
كبريتات الزنك سباعي الهيدرات (ZnSO4< / sub>.7H2< / sub>0)Sigma-Aldrich221376مكون متوسط النمو
مكون نمو مكون مكون الجيني

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
  2. Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578(2020).
  3. Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
  4. Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
  5. Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408(2020).
  6. Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
  7. Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
  8. Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
  9. Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
  10. Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
  11. Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879(2021).
  12. Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530(2012).
  13. Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459(2016).
  14. Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543(2018).
  15. Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482(2018).
  16. Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
  17. Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
  18. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  19. Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
  20. Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
  21. Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
  22. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
  23. R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  24. Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890(2012).
  25. Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
  26. Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
  27. Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
  28. Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  30. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  31. Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260(1993).
  32. William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
  33. Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
  34. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  35. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
  36. Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
  37. Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594(2020).
  38. Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  39. Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840(2004).
  40. Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
  41. Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
  42. du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
  43. Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  44. Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
  45. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
  46. Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
  47. Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71(2010).
  48. Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191(2000).
  49. Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

16S rRNA PCR

مقالات ذات صلة