يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصنيف حالة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في المختبر باستخدام التألق الذاتي

1.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63110

⸱

أبريل 12, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول استراتيجيات تحديد وإثراء حالة الخلية في مزارع الخلايا الجذعية العصبية الأولية للفئران البالغة عن طريق التصوير الذاتي باستخدام أنا) مجهر متحد البؤر ، ب) فارز الخلايا المنشط بالفلورسنت لإجراء تصوير الشدة ، أو ج) مجهر متعدد الفوتون لإجراء التصوير الفلوري مدى الحياة.

الملخص

تقسم الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) وتنتج الخلايا العصبية حديثي الولادة في دماغ البالغين من خلال عملية تسمى تكوين الخلايا العصبية للبالغين. الخلايا العصبية العصبية البالغة هادئة في المقام الأول ، وهي حالة خلوية قابلة للانعكاس حيث خرجت من دورة الخلية (G0) ومع ذلك تظل مستجيبة للبيئة. في الخطوة الأولى من تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، تتلقى الخلايا العصبية الهادئة (qNSCs) إشارة وتنشط ، وتخرج من السكون وتعود إلى دورة الخلية. وبالتالي ، فإن فهم منظمي السكون والخروج من السكون في NSC أمر بالغ الأهمية للاستراتيجيات المستقبلية التي تستهدف تكوين الخلايا العصبية للبالغين. ومع ذلك ، فإن فهمنا لسدوء NSC محدود بسبب القيود الفنية في تحديد NSCs الهادئة (qNSCs) وNSCs المنشطة (aNSCs). يصف هذا البروتوكول نهجا جديدا لتحديد وإثراء qNSCs و aNSCs التي تم إنشاؤها في الثقافات المختبرية عن طريق تصوير التألق الذاتي NSC. أولا ، يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام المجهر متحد البؤر لتحديد علامات الفلورسنت الذاتي ل qNSCs و aNSCs لتصنيف حالة تنشيط NSC باستخدام شدة التألق الذاتي. ثانيا ، يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام فارز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS) لتصنيف حالة تنشيط NSC وإثراء العينات ل qNSCs أو aNSCs باستخدام شدة التألق الذاتي. ثالثا ، يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام مجهر متعدد الفوتون لإجراء التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) بدقة خلية واحدة ، وتصنيف حالة تنشيط NSC ، وتتبع ديناميكيات الخروج الهادئ باستخدام كل من شدة التألق الذاتي وعمر التألق. وبالتالي ، يوفر هذا البروتوكول مجموعة أدوات دقة خلية حية وخالية من الملصقات وحيدة الخلية لدراسة سكون NSC وخروج السكون.

المقدمة

تخلق الخلايا العصبية العصبية حديثي الولادة طوال الحياة في العديد من الكائنات الحية في عملية يشار إليها باسم تكوين الخلايا العصبية للبالغين1،2. لإنتاج الخلايا العصبية حديثي الولادة ، يجب أن يتم تنشيط qNSC أولا ، والدخول في دورة الخلية لتوسيع عدد السكان وإنتاج أسلاف عصبية3،4،5،6. على الرغم من وجود الكثير من المعلومات حول سكون مركز الأمن القومي ، إلا أن قدرتنا على تحديد الدوافع والمنظمين لسكون NSC مقيدة بالقيود التقنية الموجودة لعزل وتحديد qNSCs وانتقالها إلى التنشيط. كان التصوير الذاتي الفلوري ناجحا سابقا في دراسة التغيرات في حالة الخلية في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا التائية ، عن طريق حل إعادة التمثيل الغذائي ، والتي تؤثر على الخصائص البصرية للعوامل المساعدة الأيضية الفلورية الذاتية مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات (NAD (P) H) والفلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FAD) 7،8. تعيد NSCs تشكيل شبكات التمثيل الغذائي الخاصة بها بشكل كبير لأنها تخضع لمخرج الهدوء9،10،11،12،13،14. وبالتالي ، للاستفادة من هذه الاختلافات ، تم استخدام التألق الذاتي NSC مؤخرا لتحديد وإثراء حالة تنشيط NSC من خلال اكتشاف التحولات في التألق الذاتي المنسوبة إلى إعادة التمثيل الغذائي التي تحدث عند خروج NSCs من السكون15. يوفر التألق الذاتي للتصوير العديد من المزايا التقنية: أنا) لا يتطلب إضافة ملصقات خارجية ، والتي يمكن أن تؤثر على سلوك الخلية ؛ ب) يمكن أن يوفر بيانات خلية واحدة عالية الدقة حول حالة تنشيط NSC ؛ و 3) لا يتطلب تدمير الزنزانة7 ، 16. يحدد هذا البروتوكول ثلاث استراتيجيات لتسخير التألق الذاتي NSC لدراسة حالات الخلايا الهادئة والمنشطةNSC 15.

في الآونة الأخيرة ، تم العثور على NSCs المعزولة من ذكور الفئران البالغة من العمر 6 أسابيع من المنطقة تحت الحبيبية للحصين ، وتم استزراعها ووضعها بشكل عكسي في الهدوء في المختبر10،13،17،18،19،20،21 ، تظهر مستويات متزايدة من التألق الذاتي المنقط (PAF) الذي يثير ما بين 400-600 نانومتر وتنبعث منه ما بين 500-700 نانومتر. كانت هذه الإشارة خاصة ب qNSCs مقارنة ب NSCs المنشطةوركوب الدراجات 15. تعد القدرة على الفصل البصري بين هاتين المجموعتين دون استخدام علامات إضافية للأجسام المضادة أو المراسلين مفيدة للعديد من الأسئلة التجريبية حول طبيعة qNSCs ومخارج الهدوء. وبالتالي ، أولا ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات لتصوير PAF في qNSCs باستخدام مجهر متحد البؤر ، والذي يمكن استخدامه لتحديد حالة تنشيط NSC. ثانيا ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات الكشف عن PAF باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) ويصف أيضا كيفية الفرز بناء على هذه الإشارة لإثراء qNSCs أو aNSCs. توفر هذه الاستراتيجيات مقياسا واحدا يمكن استخدامه لتجميع وفصل NSCs بناء على حالة الخلية.

لتطوير طريقة عالية الدقة لفصل الخلايا النانوية الإشعاعية ليس فقط في حالات متميزة ولكن أيضا أثناء انتقالها من خلال مخرج الهدوء نحو التنشيط الكامل ، تم إجراء التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) باستخدام مجهر متعدد الفوتون لتصوير التألق الذاتي NAD (P) H (يسمى القناة 1) والتألق الذاتي الأخضر (يسمى القناة 2 ؛ والذي يكتشف كلا من التألق الذاتي FAD و PAF في qNSCs) مع شدتها. يستفيد هذا النهج من حقيقة أن الخصائص البصرية للجزيئات في الخلية تعتمد على خصائصها الفيزيائية16،22. على سبيل المثال ، NAD (P) (NAD و NADP لا يمكن تمييزهما بصريا ، وبالتالي يتم استخدام NAD (P) للإشارة إلى كلا النوعين) ليس ذاتي الفلورسنت في الحالة المؤكسدة ولكنه ذاتي الفلورسنت في حالته المختزلة (NAD (P) H) 23. علاوة على ذلك ، يمكن استقراء الخصائص الفيزيائية الإضافية لجزيئات الفلورسنت الذاتي ، مثل حالة ارتباطها بالإنزيمات ، عن طريق إجراء تصوير عمر التألق7،22،24. على سبيل المثال ، NAD (P) H له عمر مضان أقصر عندما لا يكون مرتبطا بإنزيم22. نظرا لأن جزيئات الفلورسنت الذاتي مثل NAD (P) H ، التي تشارك في مئات التفاعلات الأيضية ، يتم استخدامها بشكل مختلف بواسطة الخلايا التي تتقدم عبر حالات أو سلوكيات خلوية مختلفة ، يمكن اكتشاف هذه التحولات وقياسها كميا باستخدام مجهر متعدد الفوتون يكتشف عمر التألق الذاتي23. جنبا إلى جنب مع وفرة أو شدة التألق الذاتي ، توفر هذه المقاييس معلومات متعددة الأبعاد لفصل NSCs إلى حالة خلية أو أخرى ومن خلال التحولات الديناميكية بين الحالات. ثالثا ، يصف هذا البروتوكول أداء وتحليل وتفسير FLIM ومقاييس الشدة لإشارات القناة 1 (NAD (P) H) والقناة 2 (PAF) باستخدام مجهر متعدد الفوتونات. باختصار ، يصف هذا البروتوكول مجموعة أدوات خلية حية خالية من الملصقات لدراسة سكون NSC التي توفر بيانات خلية واحدة عالية الدقة حول حالة NSC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة ويسكونسن ماديسون.

1. استخدام مجهر متحد البؤر لتصوير PAF في qNSCs و aNSCs لتحديد حالة خلية NSC

  1. إنشاء qNSCs و aNSCs في المختبر من ثقافات NSC الأولية.
    1. مزرعة NSCs منقاة من أدمغة الفئران البالغة في وسط تكاثري للتوسع (الجدول 1) 18 ، 20 ، 21. وبالتالي ، بشكل افتراضي ، فإن ثقافات NSC في المختبر هي aNSCs.
    2. لإنشاء qNSCs ، استخدم البروتوكول التالي لوضع aNSCs على الأواني الزجاجية المطلية ثم معالجتها بوسط qNSC للحث على الهدوء على مدار 3 أيام.
    3. قم بإعداد الأواني الزجاجية ذات معامل الانكسار المناسب لأهداف الغمر في الزيت للالتصاق ب NSCs عن طريق الطلاء أولا بمحلول بولي L-ornithine (PLO ؛ 10 مجم / مل في الماء للبلاستيك ، 50 مجم / مل في الماء للزجاج) يكفي لتغطية قاع الطبق (لبئر تصوير 1 سم2 ، استخدم ~ 150 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في ddH2O.
    4. قم بإزالة محلول PLO واغسله 3 مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    5. قم بتغطيتها بمحلول اللامينين (5 مجم / مل) كافية لتغطية قاع الطبق (لبئر تصوير 1 سم2 ، استخدم ~ 150 ميكرولتر) في PBS واحتضانه لمدة 3 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية ، أو بين عشية وضحاها.
    6. قم بإزالة محلول اللامينين ، ثم أضف وسط ثقافة كاف لتغطية قاع الطبق (للحصول على كوفيت تصوير 1 سم2 ، استخدم ~ 150 ميكرولتر).
    7. قم بإعداد الخلايا للتربسين عن طريق الطرد المركزي aNSCs (يمكن أن تبدأ كطبقات أحادية أو مجالات عصبية) عند 120 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT ، ~ 25 درجة مئوية).
    8. قم بتربسين aNSCs المحببة من الخطوة السابقة في 100 ميكرولتر من مزيج التربسين لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ثم قم بإخماد التربسين ب 200 ميكرولتر من مزيج مثبطات التربسين (الجدول 1).
    9. اسمح للمراكز الوطنية للاتصالات بالجلوس لمدة دقيقتين ، ثم قم بترتيبيتها ميكانيكيا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات.
    10. أضف 5 مل من وسط aNSC ، وقم بتدوير الخلايا عند 120 × جم لمدة 4 دقائق.
    11. أعد تعليق الخلايا العصبية العصبية في 1 مل من وسط aNSC وقم بلوحة الخلايا عند التقاء 10٪ -20٪ في وسط aNSC. على سبيل المثال ، قم بلوحة ~ 5,000 خلية في بئر واحد من بئر تصوير 1 سم2 مع وسط 150 ميكرولتر.
    12. بعد السماح لمدة 24 ساعة حتى تلتصق aNSCs بسطح الطبق ، قم بإزالة وسط aNSC واستبدله بوسط qNSC يكفي لتغطية قاع الطبق (للحصول على بئر تصوير 1 سم2 ، استخدم ~ 150 ميكرولتر ؛ الجدول 1- كما هو موضحسابقا 10،13،17،18) في الآبار التي سيتم فيها إحداث السكون.
    13. قم بتغيير وسيط aNSC و qNSC مرة واحدة على الأقل كل يومين. بعد 3 أيام في وسط qNSC ، تكون الخلايا العصبية السرطانية هادئة ويمكن استخدامها لتجارب التصوير.
  2. استخدم مجهر متحد البؤر لتصوير qNSCs و aNSCs الحية في المختبر.
    ملاحظة: كل مجهر له برنامج احتكاري. وبالتالي ، اتبع هذه الخطوات عن طريق تنفيذ إجراءات مماثلة لتكوين مجهر معين. سيوفر هذا البروتوكول تعليمات للعمل في NIS-Elements.
    1. قم بتكوين المجهر متحد البؤر للتصوير الذاتي الفلوري.
      1. انقر فوق 405 Laser (ليزر) ، واكتب نافذة الإرسال داخل قائمة 405 Laser . انقر فوق TD لتجميع صورة ضوئية مرسلة وتعيين قيمة HV لتصور العينة.
      2. اضبط طاقة الليزر على 3.5٪ والكسب على 75. اضبط التكبير/التصغير على 2. قم بإعداد معلمات المسح متحد البؤر، واضبط Pixel Dstay على 0.5، واضبط الدقة على 2048 × 2048 بكسل.
    2. اجعل الخلايا في التركيز تحت عدسة موضوعية بالغمر بالزيت ~ 60x باستخدام المجال الساطع للتركيز.
    3. قم بالتبديل إلى وضع المسح متحد البؤر بالنقر فوق منفذ العين ، مما يضمن أن مسار الضوء ينتقل الآن إلى رأس المسح وعدم وجود مكعب مرشح في مسار الضوء.
    4. يتم إثراء PAF في qNSCs وهو قابل للإثارة والانبعاث على نطاق واسع (انظر الشكل 1). اختر أفضل تكوين بصري بناء على قدرات النظام باستخدام الشكل 1 كدليل. للحصول على أقوى وأنظف إشارة ، قم بالإثارة باستخدام ليزر بين ~ 400-500 نانومتر ، واجمع ~ 580-620 نانومتر ، واستخدم عدسة موضوعية غمر الزيت ~ 60x.
      ملاحظة: يتطلب التصوير الذاتي التألق قوى ليزر أعلى للإثارة مما تتطلبه تجارب التصوير النموذجية. في حالة تصوير جزيئات الفلورسنت الذاتي الأخرى أو الملصقات الأخرى مع PAF ، قم بتصميم التكوين البصري بعناية لتجنب النزيف في قنوات التألق الذاتي.
    5. الحصول على صور للتألق الذاتي في qNSCs و aNSCs. انقر فوق مسح ضوئي، ثم ركز على الصورة، ثم انقر فوق التقاط. للحصول على أفضل الصور ، اجمع صورا أحادية المستوى مع سيتوبلازم الخلايا (بناء على التألق الذاتي الباهت المنتشر في جميع أنحاء الخلية) في التركيز للحصول على مقطع عرضي تمثيلي لكل خلية.
    6. استخدم تكوينا بصريا متطابقا (على سبيل المثال ، نفس طاقة الليزر) وعينات صور في نفس اليوم إذا كنت تهدف إلى مقارنة الصور المختلفة مباشرة.
    7. تعتمد القوى الدقيقة لليزر والكاشف على كل نظام محدد. ابدأ باستخدام قوى ليزر منخفضة ثم قم بزيادة القوى ببطء حتى يمكن اكتشاف الإشارة دون تشبعها.
  3. تحليل PAF في qNSCs و aNSCs الحية في المختبر.
    1. بعد الحصول على صور التألق الذاتي في qNSCs أو aNSCs ، حدد الصور عن طريق فتح ملف في ImageJ25.
    2. استخدم الخيار Process > Filters > Gaussian Blur (Sigma: 2) على صورة التألق الذاتي qNSC / aNSC لتنعيم وحدات البكسل غير المستوية.
    3. استخدم Image > Adjust > Threshold لتحديد وحدات البكسل التي تمثل PAF (إزالة وحدات بكسل الخلفية) وانقر فوق تطبيق. استخدم نفس معلمات العتبة لجميع الصور التي ستتم مقارنتها مباشرة.
    4. استخدم عملية > مستجمعات المياه الثنائية > لفصل PAFs على مقربة مكانية قريبة.
    5. باستخدام فأرة الكمبيوتر ، ارسم منطقة اهتمام (ROI) حول الخلية ، كما هو محدد إما من خلال النظر إلى صورة المجال الساطع أو من خلال النظر إلى التألق الذاتي المنتشر الموجود بالتساوي في جميع أنحاء السيتوبلازم للخلية.
      ملاحظة: من الجيد عموما استبعاد العمليات الطرفية الرقيقة وتضمين النواة لأن التألق الذاتي غير موجود عادة في هذه المواقع وبالتالي لن يعطل التحليل.
    6. استخدم تحليل > تحليل الجسيمات (الحجم: 0.1 ميكرومتر لا نهاية ؛ التعميم : 0-1) مع تلخيص فحص.
      ملاحظة: ستنتج ImageJ بعد ذلك نافذة إخراج تحتوي على بيانات عن الجسيمات في المنطقة محل الاهتمام ، مما يسمح بجدولة عدد PAF في كل خلية. يمكن إقران جزيئات الفلورسنت الأخرى بتصوير PAF. ومع ذلك ، نظرا لأن PAF هي إشارة خافتة نسبيا ، فمن المهم التحقق من أن الفلوروفورات الأخرى لا تنزف في قناة PAF. عادة ، يمكن إقران الفلوروفورات التي تمتص 600+ نانومتر وتنبعث منها 650+ نانومتر مع التصوير PAF ، مثل LipidSpot 610.

2. استخدام FACS لإثراء حالة تنشيط NSC في NSCs المستنبتة على أساس التألق الذاتي

  1. إنشاء qNSCs و aNSCs كما هو موضح في القسم 1.
  2. قم بفرز مزيج من qNSCs و aNSCs الحية بناء على التألق الذاتي.
    ملاحظة: على سبيل المثال، سيناقش هذا البروتوكول كيفية إثراء aNSCs أو qNSCs في عينة تم إنشاؤها عن طريق خلط qNSCs و aNSCs بنسبة 1: 1.
    1. قبل التربسين وفرز الخلايا ، قم بتسمية الخلايا التي تتقدم خلال المرحلة S عن طريق إضافة 10 ميكرومتر 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU ؛ نظير ثيميدين يدمج في الخلايا التي تصنع الحمض النووي ، كما هو الحال في المرحلة S من دورة الخلية) إلى وسط زراعة الخلية لمدة 1 ساعة.
    2. قم بتربسين qNSCs و aNSCs كما تمت مناقشته في الخطوات 1.1.8 ، وأعد تعليقه في 0.5 مل من المخزن المؤقت FACS (الجدول 1) ثم ضعه على الجليد.
      ملاحظة: تلتصق qNSCs بقوة بالطبق. عند التقاء أعلى نسبيا ، يمكن فصل qNSCs ميكانيكيا عن الطبق. ومع ذلك ، إذا كانت qNSCs عند التقاء أقل نسبيا أو يصعب إزالتها من الطبق ميكانيكيا عن طريق سحب العينات ، فاستخدم التربسين لإزالتها من الطبق.
      1. قم بإزالة وسط الاستزراع من qNSCs وأضف 0.25٪ تربسين يكفي لتغطية قاع الطبق (لكوفيت تصوير 1 سم2 ، استخدم ~ 150 ميكرولتر) ، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      2. بعد الحضانة ، قم بإخماد تفاعل التربسين عن طريق إضافة وسيط يتوافق مع كل نوع خلية يساوي حجم التربسين المضاف. فصل الخلايا ميكانيكيا عن الطبق قبل التجميع والطرد المركزي.
    3. باستخدام فوهة ~ 130 ميكرومتر ، قم بتحليل qNSCs و aNSCs باستخدام مقياس التدفق الخلوي أو FACS مع الظروف البصرية بناء على قدرات الجهاز واكتشاف PAF كما هو موضح في الشكل 1. على سبيل المثال ، استخدم ليزر 405 نانومتر لإثارة العينة واستخدم مرشح 580-620 نانومتر للكشف.
    4. اجمع ما لا يقل عن 10,000 qNSCs و aNSCs مفردة في ملف بيانات ثم استخدمها لتصميم بوابات لجمع إثراء qNSCs أو aNSCs. على سبيل المثال، قم بتعيين البوابات لتجميع أعلى 25٪ أو 25٪ السفلية من NSCs بناء على شدة التألق الذاتي في العينة المختلطة aNSC:qNSC (1:1).
    5. بعد ضبط البوابات لفرز المفردات ذات التألق الذاتي الأكثر إشراقا أو باهتة كما هو موضح أعلاه ، قم بفرز الخلايا إلى آبار مطلية بطبقة من اللامينين مملوءة بوسط aNSC (10,000 خلية / سم2 ، انظر الخطوة 1.1.3).
    6. بعد FACS ، اسمح لمراكز الأمن القومي بالجلوس لمدة 3 ساعات في الحاضنة. قم بإصلاح الخلايا عن طريق معالجتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد تكفي لتغطية قاع الطبق (لكوفيت تصوير 1 سم2 ، استخدم ~ 150 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: لتصور EdU في الخلايا ، من الأسهل الحصول على مجموعة تجارية للكشف عن EdU واتباع البروتوكول الموصى به من الشركة المصنعة.
    7. أولا ، قم باختراق الخلايا عن طريق العلاج باستخدام 0.25٪ تريتون في PBS لمدة 15 دقيقة في RT.
    8. بعد ذلك ، عالج الخلايا بمحلول تلطيخ EdU في RT لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: سيختلف التركيب الدقيق لمحلول تلطيخ EdU اعتمادا على مصدر الكواشف ولكنه يتكون تقريبا من مخزن مؤقت للتفاعل ، ومضافات عازلة للتفاعل ، وكبريتات النحاس ، وجزيء ألكين أو أزيد معدل. انظر جدول المواد للحصول على مجموعة موصى بها.
    9. بعد التلوين لتصور EdU ، اغسل العينات 3 مرات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS.

3. استخدام مجهر متعدد الفوتون للكشف عن التألق الذاتي للقناة 1 والقناة 2 وإجراء FLIM على NSCs في المختبر لتحديد مجموعات حالة خلية NSC والتحولات

ملاحظة: كل مجهر له برنامج احتكاري. وبالتالي ، اتبع هذه الخطوات عن طريق تنفيذ إجراءات مماثلة لتكوين مجهر معين. سيوفر هذا البروتوكول تعليمات للعمل في Prairie View.

  1. إنشاء qNSCs و aNSCs كما هو موضح في القسم 1.
  2. قم بإعداد المجهر متعدد الفوتون للتصوير مدى الحياة الفلورية.
    1. استخدم عدسة شيئية بتكبير 40x أو أكبر (~1.15 NA).
    2. استخدم مجهرا متعدد الفوتون مع المكونات التالية أو ما يعادلها: ليزر فائق السرعة قابل للضبط ، وثنائي اللون بطول 720 نانومتر ، وأنبوب مضاعف ضوئي لفوسفيد زرنيخيد الغاليوم (GaAsP) (PMT) ، وإلكترونيات عد الفوتون أحادي المرتبط بالوقت ، ومقياس طاقة تناظري.
    3. بالنسبة لتصوير القناة 1 ، اضبط الليزر القابل للضبط على 750 نانومتر واستخدم مكعب مرشح انبعاث 440/80 نانومتر. بالنسبة للتصوير في القناة 2 ، اضبط الليزر على 890 نانومتر واستخدم مكعب مرشح انبعاث 550/100 نانومتر.
      ملاحظة: قم بإطفاء أضواء الغرفة قبل تشغيل PMT.
  3. وظيفة استجابة الأداة
    1. التقط وظيفة استجابة الأداة (IRF) عن طريق تصوير بلورة اليوريا المسحوقة لحساب الاستجابة الزمنية للأداة في الاضمحلال المقاس.
      ملاحظة: يتم تضمين IRF مع الاضمحلال لحساب منحنى ملاءمة الاضمحلال بدقة. للاقتناء ، يتم ضبط الليزر على 890 نانومتر ، ويتم استخدام مكعب مرشح الانبعاث 440/80 نانومتر. يتم تعيين GaAsP PMT عند كسب 800 ، ويتم ضبط pockels (طاقة الليزر) منخفضة جدا في البداية ، وعادة ما تكون 1.
    2. حدد مجال رؤية باليوريا البلورية وقم بزيادة الكرات قليلا (بحد أقصى 15).
    3. بعد ذلك ، احصل على صورة باستخدام نفس المعلمات المستخدمة لتصوير الخلية: تمييز الكسر الثابت (CFD) 1 × 104 - 1 × 105 ، دقة 256 × 256 ، وقت السكون المحدد عند 4.8 ميكرو ثانية ، ضبط التكبير البصري على 1.5x ، ووقت تكامل 60 ثانية.
  4. إجراء التصوير الفلوري مدى الحياة والتصوير الشديد للقناة 1 والقناة 2 التألق الذاتي على qNSCs و aNSCs الحية في المختبر
    1. ابحث عن مجال رؤية للصورة: استخدم العينين للعثور على مجال رؤية مناسب وتغيير مسار الضوء إلى العينة على المجهر لتمكين التصوير.
      ملاحظة: سيتم الحصول على صورة القناة 1 أولا، تليها صورة القناة 2 لمجال الرؤية نفسه.
    2. الإعداد لجمع صورة القناة 1: انقر فوق علامة التبويب Power / Gain واضبط الكسب على PMT على 800 ، وانقر فوق علامة التبويب 2-P Laser وحدد 750 نانومتر لليزر ، وتأكد من استخدام مكعب المرشح المناسب (440/80 نانومتر).
    3. جمع صورة القناة 1.
      1. ابدأ وضع المعاينة بالانتقال إلى علامة التبويب Power / Gain وتعيين Pockels على 30 ، ثم الانتقال إلى قسم المسح الضوئي في تلك الشاشة والنقر فوق Live Scan.
      2. قم بزيادة Pockels للعثور على مجال رؤية جيد بطاقة ليزر منخفضة (أقل من 3.6 ميجاوات). بمجرد العثور على مجال الرؤية ، اضبط Pockels بحيث يقرأ عداد الطاقة ~ 3.6 ميجاوات على الطاقة بعد خلية البوكل ، ويقيس محدد الكسر الثابت (CFD) في علامة التبويب معدلات العد 1 × 104 - 1 × 105.
    4. انتقل إلى قسم المسح الضوئي وانقر فوق مسح واحد بمجرد استيفاء هذه المعلمات. سيؤدي ذلك إلى الحصول على صورة القناة 1 على مدى 60 ثانية.
    5. لجمع صورة القناة 2 ، انقر فوق علامة التبويب 2-P Laser وحدد 890 نانومتر لليزر ، وقم بتبديل مكعب المرشح إلى مكعب انبعاث القناة 2 (550/100 نانومتر).
    6. ابدأ وضع المعاينة كما هو موضح في 3.4.3 ، وقم بزيادة Pockels حتى يقرأ عداد الطاقة ~ 7 ميجاوات ، وتكون أعداد العقود مقابل الفروقات مرة أخرى 1 × 104 -1 × 105.
    7. انتقل إلى قسم المسح وانقر فوق مسح واحد بمجرد استيفاء هذه المعلمات. سيؤدي هذا إلى الحصول على صورة للقناة 2 على مدى 60 ثانية.
    8. الحصول على المزيد من الصور - بعد الحصول على صورة القناة 1 والقناة 2، ابحث عن مجال رؤية جديد وكرر الخطوات 3.4.2 - 3.4.4. عادة ما يكون جمع 4-6 حقول رؤية للصورة ~ 50-100 خلية كافيا لشرط واحد في التجربة.
      ملاحظة: يمكن استخدام mCherry كملصق فلوري إضافي دون النزيف في قناتي القناة 1 والقناة 2.
  5. تحليل صور العمر الفلوري.
    1. قم بإنشاء مصفوفات اضمحلال لصور العمر المضان في SPCImage باتباع الخطوات 3.5.2-3.1.14.
      ملاحظة: للحصول على معلومات إضافية ، راجع الكتيبات المحدثة المتاحة مجانا عبر الإنترنت26.
    2. افتح SPCImage وافتح صورة IRF FLIM التي تم جمعها في القسم 3.3.
    3. اضبط الأشرطة السوداء الرأسية في الرسم البياني لتقتصر على منحنى اضمحلال IRF. من شريط القائمة العلوي ، انقر فوق IRF > نسخ إلى الحافظة.
    4. افتح ملف صورة FLIM ضمن مجموعة البيانات المراد تحليلها ، والتي تم الحصول عليها في القسم 3.4.
    5. من شريط القائمة العلوي ، انقر فوق IRF > لصق من الحافظة.
    6. في الجزء السفلي الأيمن من البرنامج ، اضبط المكونات على 2.
    7. في شريط القائمة العلوي للبرنامج ، انقر فوق خيارات > نموذج. ثم حدد MLE للطريقة الملائمة، والتجميع المكاني إلى المربع، والعتبة إلى الذروة، وضمن الإعدادات، حدد اضمحلال الأسي المتعدد.
    8. في الجزء السفلي الأيسر من البرنامج ، قم بزيادة الحاوية حتى يصل عدد الفوتونات إلى 100 على الأقل في وحدات البكسل السيتوبلازمية التمثيلية في ذروة عدد الفوتونات مباشرة بعد الإثارة.
    9. في الجزء السفلي الأيسر من البرنامج ، قم بتعيين العتبة. بالنسبة للقناة 1 ، استخدم عتبة "50". بالنسبة إلى القناة 2، استخدم حدا "0".
    10. في شريط القائمة العلوي للبرنامج (يصف هذا البروتوكول كيفية تشغيل الإصدار 8.3) ، انقر فوق حساب > Decay Matrix.
      ملاحظة: تأكد من أن قيم Chi2 هي ~ 0.8-1.2 في جميع أنحاء الصورة. هذا يؤكد أن البيانات ستكون قوية من خلال التحقق من صحة نمذجة الاضمحلال ثنائي الأس.
    11. في شريط القائمة العلوي ، انقر فوق حفظ > الملف.
    12. في شريط القائمة العلوي للبرنامج ، انقر فوق File > Export ، وقم بتصدير ما يلي:
      القيمة المرمزة بالألوان، T1، T2، تشي2، كثافة البكسل، A1[٪]، A2[٪] والصورة المرمزة بالألوان (مع وسيلة الإيضاح)
      ملاحظة: تم الآن إعداد SPCImage للقيام بعملية دفعية ، وتحليل جميع صور قناة معينة (تحليل صور FLIM للقناة 1 معا ثم كرر بدءا من الخطوة 3.5.2 لصور FLIM في القناة 2).
    13. لإجراء عملية دفعية ، انقر فوق حساب > معالجة الدفعات وحدد صور FLIM المراد معالجتها.
    14. في شريط القائمة العلوي ، انقر فوق ملف > تصدير > تصدير دفعة وحدد مصفوفات الاضمحلال المراد تصديرها (التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة).
    15. استخدم CellProfiler لإنشاء أقنعة سيتوبلازمية باتباع الخطوات 3.5.16-3.5.24.
      ملاحظة: للقيام بذلك ، ستكون النوى يدويا حول صور شدة القناة 1 ، حيث تكون النواة سوداء ومرئية بوضوح. ثم سينتج خط أنابيب CellProfiler manual_segmentation.cpproj27 (الملف التكميلي 1) تلقائيا خلية كاملة وقناع سيتوبلازمي ، وفقا لتوجيهات القناع النووي. يمكن بدلا من ذلك تسمية النوى باستخدام mCherry وتصويرها جنبا إلى جنب مع القناة 1 والقناة 2 التألق الذاتي لتوفير القدرة على أتمتة تحديد النوى. ومع ذلك ، فإن العديد من الأصباغ النووية التقليدية سوف تنزف طيفيا في قنوات التألق الذاتي وبالتالي فهي غير متوافقة مع هذه التقنية.
    16. في R Studio، استخدم R_ASCtoTIFF.rmd27 (الملف التكميلي 2) لتحويل ملفات X_photons.asc ، حيث X هو اسم الصورة المكتسبة من صورة القناة 1 التي تم تعيينها إلى ملفات TIF.
    17. افتح محلل ملفات تعريف الخلية وافتح manual_segmentation.cpproj.
    18. قم بالتحميل في TIF الفوتونات للقناة 1 التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.5.16 في خطوة الصور في الجزء العلوي من خط الأنابيب.
    19. في الخطوات الثلاث السفلية في خط الأنابيب بعنوان SaveImages ، قم بتعيين مسار حفظ للأقنعة التي سينشئها CellProfiler.
    20. انقر فوق بدء وضع الاختبار في الجزء السفلي الأيسر من CellProfiler.
    21. انقر فوق تشغيل في الجزء السفلي الأيسر من CellProfiler. عندما يصل CellProfiler إلى الخطوة IdentifyObjectsManually ، ستظهر نافذة تعرض صورة القناة 1 الحالية التي تتم معالجتها.
    22. انقر فوق المفتاح F على لوحة المفاتيح ثم ارسم يدويا أثرا لنوى خلية واحدة أثناء الضغط باستمرار على زر النقر بزر الماوس الأيسر. بعد تتبع النوى ، حرر زر النقر بزر الماوس الأيسر على الماوس. كرر هذه الخطوة لجميع الخلايا في الصورة.
    23. انقر فوق تم في أسفل يمين النافذة المنبثقة مع صورة الكثافة. سينتهي البرنامج الآن من خط الأنابيب وتصدير أقنعة السيتوبلازمية والنووية والخلايا الكاملة.
    24. في أسفل اليسار ، انقر فوق مجموعة الصور التالية وكرر الخطوات 3.5.21-3.5.23 لجميع صور TIF على القناة 1.
    25. استخدم البرنامج النصي R (دمج مصفوفات الاضمحلال والأقنعة السيتوبلازمية.rmd) لدمج مصفوفات الاضمحلال التي تم إنشاؤها في الخطوات 3.5.2-3.5.14 والأقنعة السيتوبلازمية التي تم إنشاؤها في الخطوات 3.5.15-3.5.24 للحصول على متوسط متغيرات التصوير المضان لسيتوبلازم كل خلية باتباع الخطوات 3.5.26-3.5.30
    26. باستخدام جدول بيانات (على سبيل المثال ، Microsoft Excel) ، قم بإنشاء مستند .csv بعنوان test_key27 [ملف تكميلي 3] على سبيل المثال) مع 3 أعمدة.
    27. قم بتسمية الأعمدة باسم المجلد و NADH و FAD. املأ الجدول لإدراج موقع المجلد في المجلد ، ثم بادئة عنوان الصورة في NADH و FAD ، على التوالي ، لربط كل صورة قناة 1 بكل صورة قناة 2 (انظر مثال البيانات - الجدول 2).
  6. في R Studio ، افتح دمج مصفوفات الاضمحلال والأقنعة السيتوبلازمية.rmd27 (الملف التكميلي 4).
    1. قم بتعيين مسارات الملفات التالية كما هو موضح في البرنامج النصي: تعيين دليل العمل ، وموقع ملف القناة 1 ، وموقع ملف FAD ، وموقع ملف القناع ، وموقع ملف الإخراج واسمه.
    2. قم بتشغيل البرنامج النصي بالكامل. عند الانتهاء بنجاح من البرنامج النصي ، سيتم إنشاء ملف إخراج ، بما في ذلك البيانات الشرحية ومتوسط متغيرات FLIM.
    3. قم بإجراء التحليل باستخدام التألق الذاتي FLIM data.rmd27 (الملف التكميلي 5) أو باستخدام أي برنامج تحليل آخر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التصوير الذاتي الفلوري متحد البؤر لفصل حالة خلية NSC (الشكل 1)
لاستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لحل حالة تنشيط NSC ، تم إنشاء qNSCs و aNSCs في المختبر باستخدام إما وسط تنشيط أو وسط هدوء ، كما هو موضح سابقا10،13،17،18. للكشف عن PAF في الخلايا العصبية العصبية ، تم تصوير qNSCs و aNSCs الحية باستخدام نفس التعرض على مجهر متحد البؤر (على سبي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول تقنية دقة خلية حية وخالية من الملصقات وغير مدمرة وأحادية الخلية تسمح بتصنيف حالة خلية NSC في المختبر من خلال تصوير إشارات الفلورسنت الذاتي في الخلايا العصبية الوطنية. يكتشف هذا النهج التحولات الأيضية التي تحدث أثناء خروج سكون NSC ، والتي تؤثر على الخصائص البصرية للعوامل المساعدة الأيضية ، مثل NAD (P) H ، ويوفر العديد من المزايا مقارنة بالتقنيات الحالية لدراسة سكون NSC. على سبيل المثال ، تتطلب العديد من التقنيات التقليدية لدراسة qNSCs و aNSCs ، مثل وضع العلامات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

نشكر قلب قياس التدفق الخلوي UW-Madison (P30 CA014520 و 1S10RR025483-01) ، وأعضاء مختبر مور ومجتمع UW-Madison على مساهماتهم. نشكر مصادر التمويل لدينا: NIH T32 T32GM008688 (إلى CSM) ، زمالة ديانا جاكوبس كالمان من AFAR (إلى CSM) ، زمالة ويسكونسن للخريجين (إلى CSM) ، جائزة DP2 NIH New Innovator (1DP2OD025783 ، إلى D.L.M.) ، جائزة Vallee Scholar (إلى D.L.M.) ، NIH 1R56NS130450 (إلى D.L.M و MCS) ، R01 CA185747 (إلى MCS) ، R01 CA205101 (إلى MCS) ، R01 CA211082 (إلى MCS) ، ورقم منحة المؤسسة الوطنية للعلوم. CBET-1642287 (إلى MCS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
40x عدسة موضوعية مائيةنيكونMRD77410موضوعية تستخدم في المجهر متعدد الفوتون في الجزء 3
8 كوفيت بئرIbidi80826-90للتصوير aNSCs / qNSCs
مقياس الطاقة التناظريThorlabsPM100Aالمستخدم في المجهر متعدد الفوتون في الجزء 3
مضاد حيوي مضاد حيوي (100X) (PSF)مضاد حيوي15240062Fisher لوسائط NSC
B-27Invitrogen17504044مكمل غذائي لوسائط
NSC BMP4Fisher Scientific5020BP010عامل لحث الهدوء
ألبومين مصل الأبقارSigmaA4919-25Gلصنع ليزر BMP4
Chameleon فائق السرعةليزر متماسكN / Aيستخدم في المجهر متعدد الفوتون في الجزء 3
المجهرمتحد البؤرنيكون C2المستخدم في الجزء 1
DMEM / F-12 (بدون GlutaMAX)Invitrogen11320033الوسائط الأساسية ل NSCs
DNAseSigmaD5025-15KUتمت إضافته إلى مثبط التربسين
مجموعة فحصEdU InvitrogenC10337مقايسة الانتشار لزراعة الخلايا
EGFPeproTechAF-100-15-500UGعامل النمو لوسائط NSC
FGFPeproTech100-18Bعامل النمو لوسائط NSC
فارز الخلايا المنشطة الفلوريةBDFACSAriaفارز الخلايا المنشطة بالفلورسنت المستخدم في الجزء 2
مادة مضافة للهيبارينسيجماH3149-50KUلوسائط NSC
L-15Invitrogen21083027لتحضير محلول مثبط التربسين
LamininSigmaL2020-1MGلطلاء الأواني الزجاجية
نيكون TiE المجهر المقلوبنيكونN / Aإطار مجهر المستخدم في الجزء 3
PLOSigmaP3655-100MGلطلاء الأواني الزجاجية
SPC-150 إلكترونيات عد الفوتون الفرديBecker و HicklN / Aالمستخدمة في المجهر متعدد الفوتون في الجزء 3
Trypsin (لتربسين الكريات من aNSCs التي كانت تنمو ككرات أو أحادية الطبقات)15090046 جيبكوللتربسين في المجالات العصبية أو aNSCs الملتصقة
التربسين (للتربسين qNSCs)Gibco25200072لتربسين qNSCs الملتصقة
مثبط التربسينSigmaT6522-100MGلتثبيط التربسين من aNSCs
بلورات اليورياSigmaU5128-5Gتستخدم لجمع IRF
VerseneThermo Fisher15040066لتحضير التربسين
عدسة Thermo مجهر

المراجع

  1. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  2. Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  3. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  4. Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
  5. Urban, N., et al. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).
  6. Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
  7. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  8. Sagar, M. A. K., et al. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).
  9. Knobloch, M., et al. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).
  10. Knobloch, M., et al. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).
  11. Knobloch, M., et al. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).
  12. Shin, J., et al. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  13. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  14. Beckervordersandforth, R. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).
  15. Morrow, C. S., et al. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).
  16. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  17. Mira, H., et al. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).
  18. Morrow, C. S., et al. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).
  19. Martynoga, B., et al. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).
  20. Bin Imtiaz, M. K., Jessberger, S. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).
  21. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).
  22. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  23. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  24. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  25. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  26. Becker & Hichl Handbooks. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).
  27. GitHub Materials. , Available from: https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).
  28. Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).
  29. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الخلايا الجذعية العصبيةتنشيط الخلايا الجذعية العصبيةتكوين الخلايا العصبية لدى البالغينسكون الخلايا الجذعية العصبيةالتصوير بالفلورة الذاتيةالمجهر البؤريقياس التدفق الخلويتصوير عمر الفلورةتصنيف حالة الخليةتحليل الخلايا الحية
تصنيف حالة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في المختبر باستخدام التألق الذاتي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.