تصنيف حالة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في المختبر باستخدام التألق الذاتي

Christopher S. Morrow; Amani A. Gillette; Melissa C. Skala; Darcie L. Moore

doi:10.3791/63110

Method Article

تصنيف حالة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في المختبر باستخدام التألق الذاتي

DOI:

10.3791/63110

⸱

April 12th, 2024

Christopher S. Morrow¹ , Amani A. Gillette²^,³ , Melissa C. Skala²^,³ , Darcie L. Moore¹

¹Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, ²Morgridge Institute for Research, ³Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استراتيجيات تحديد وإثراء حالة الخلية في مزارع الخلايا الجذعية العصبية الأولية للفئران البالغة عن طريق التصوير الذاتي باستخدام أنا) مجهر متحد البؤر ، ب) فارز الخلايا المنشط بالفلورسنت لإجراء تصوير الشدة ، أو ج) مجهر متعدد الفوتون لإجراء التصوير الفلوري مدى الحياة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقسم الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) وتنتج الخلايا العصبية حديثي الولادة في دماغ البالغين من خلال عملية تسمى تكوين الخلايا العصبية للبالغين. الخلايا العصبية العصبية البالغة هادئة في المقام الأول ، وهي حالة خلوية قابلة للانعكاس حيث خرجت من دورة الخلية (G0) ومع ذلك تظل مستجيبة للبيئة. في الخطوة الأولى من تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، تتلقى الخلايا العصبية الهادئة (qNSCs) إشارة وتنشط ، وتخرج من السكون وتعود إلى دورة الخلية. وبالتالي ، فإن فهم منظمي السكون والخروج من السكون في NSC أمر بالغ الأهمية للاستراتيجيات المستقبلية التي تستهدف تكوين الخلايا العصبية للبالغين. ومع ذلك ، فإن فهمنا لسدوء NSC محدود بسبب القيود الفنية في تحديد NSCs الهادئة (qNSCs) وNSCs المنشطة (aNSCs). يصف هذا البروتوكول نهجا جديدا لتحديد وإثراء qNSCs و aNSCs التي تم إنشاؤها في الثقافات المختبرية عن طريق تصوير التألق الذاتي NSC. أولا ، يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام المجهر متحد البؤر لتحديد علامات الفلورسنت الذاتي ل qNSCs و aNSCs لتصنيف حالة تنشيط NSC باستخدام شدة التألق الذاتي. ثانيا ، يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام فارز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS) لتصنيف حالة تنشيط NSC وإثراء العينات ل qNSCs أو aNSCs باستخدام شدة التألق الذاتي. ثالثا ، يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام مجهر متعدد الفوتون لإجراء التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) بدقة خلية واحدة ، وتصنيف حالة تنشيط NSC ، وتتبع ديناميكيات الخروج الهادئ باستخدام كل من شدة التألق الذاتي وعمر التألق. وبالتالي ، يوفر هذا البروتوكول مجموعة أدوات دقة خلية حية وخالية من الملصقات وحيدة الخلية لدراسة سكون NSC وخروج السكون.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخلق الخلايا العصبية العصبية حديثي الولادة طوال الحياة في العديد من الكائنات الحية في عملية يشار إليها باسم تكوين الخلايا العصبية للبالغين¹^،². لإنتاج الخلايا العصبية حديثي الولادة ، يجب أن يتم تنشيط qNSC أولا ، والدخول في دورة الخلية لتوسيع عدد السكان وإنتاج أسلاف عصبية³^،⁴^،⁵^،⁶. على الرغم من وجود الكثير من المعلومات حول سكون مركز الأمن القومي ، إلا أن قدرتنا على تحديد الدوافع والمنظمين لسكون NSC مقيدة بالقيود التقنية الموجودة لعزل وتحديد qNSCs وانتقالها إلى التنشيط. كان التصوير الذاتي الفلوري ناجحا سابقا في دراسة التغيرات في حالة الخلية في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا التائية ، عن طريق حل إعادة التمثيل الغذائي ، والتي تؤثر على الخصائص البصرية للعوامل المساعدة الأيضية الفلورية الذاتية مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات (NAD (P) H) والفلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FAD) ⁷^،⁸. تعيد NSCs تشكيل شبكات التمثيل الغذائي الخاصة بها بشكل كبير لأنها تخضع لمخرج الهدوء⁹^،¹⁰^،¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴. وبالتالي ، للاستفادة من هذه الاختلافات ، تم استخدام التألق الذاتي NSC مؤخرا لتحديد وإثراء حالة تنشيط NSC من خلال اكتشاف التحولات في التألق الذاتي المنسوبة إلى إعادة التمثيل الغذائي التي تحدث عند خروج NSCs من السكون¹⁵. يوفر التألق الذاتي للتصوير العديد من المزايا التقنية: أنا) لا يتطلب إضافة ملصقات خارجية ، والتي يمكن أن تؤثر على سلوك الخلية ؛ ب) يمكن أن يوفر بيانات خلية واحدة عالية الدقة حول حالة تنشيط NSC ؛ و 3) لا يتطلب تدمير الزنزانة⁷ ^، ¹⁶. يحدد هذا البروتوكول ثلاث استراتيجيات لتسخير التألق الذاتي NSC لدراسة حالات الخلايا الهادئة والمنشطة^{NSC 15}.

في الآونة الأخيرة ، تم العثور على NSCs المعزولة من ذكور الفئران البالغة من العمر 6 أسابيع من المنطقة تحت الحبيبية للحصين ، وتم استزراعها ووضعها بشكل عكسي في الهدوء في المختبر¹⁰^،¹³^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹^،²⁰^،²¹ ، تظهر مستويات متزايدة من التألق الذاتي المنقط (PAF) الذي يثير ما بين 400-600 نانومتر وتنبعث منه ما بين 500-700 نانومتر. كانت هذه الإشارة خاصة ب qNSCs مقارنة ب NSCs المنشطة^{وركوب الدراجات 15}. تعد القدرة على الفصل البصري بين هاتين المجموعتين دون استخدام علامات إضافية للأجسام المضادة أو المراسلين مفيدة للعديد من الأسئلة التجريبية حول طبيعة qNSCs ومخارج الهدوء. وبالتالي ، أولا ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات لتصوير PAF في qNSCs باستخدام مجهر متحد البؤر ، والذي يمكن استخدامه لتحديد حالة تنشيط NSC. ثانيا ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات الكشف عن PAF باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) ويصف أيضا كيفية الفرز بناء على هذه الإشارة لإثراء qNSCs أو aNSCs. توفر هذه الاستراتيجيات مقياسا واحدا يمكن استخدامه لتجميع وفصل NSCs بناء على حالة الخلية.

لتطوير طريقة عالية الدقة لفصل الخلايا النانوية الإشعاعية ليس فقط في حالات متميزة ولكن أيضا أثناء انتقالها من خلال مخرج الهدوء نحو التنشيط الكامل ، تم إجراء التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) باستخدام مجهر متعدد الفوتون لتصوير التألق الذاتي NAD (P) H (يسمى القناة 1) والتألق الذاتي الأخضر (يسمى القناة 2 ؛ والذي يكتشف كلا من التألق الذاتي FAD و PAF في qNSCs) مع شدتها. يستفيد هذا النهج من حقيقة أن الخصائص البصرية للجزيئات في الخلية تعتمد على خصائصها الفيزيائية¹⁶^،²². على سبيل المثال ، NAD (P) (NAD و NADP لا يمكن تمييزهما بصريا ، وبالتالي يتم استخدام NAD (P) للإشارة إلى كلا النوعين) ليس ذاتي الفلورسنت في الحالة المؤكسدة ولكنه ذاتي الفلورسنت في حالته المختزلة (NAD (P) H^{) 23}. علاوة على ذلك ، يمكن استقراء الخصائص الفيزيائية الإضافية لجزيئات الفلورسنت الذاتي ، مثل حالة ارتباطها بالإنزيمات ، عن طريق إجراء تصوير عمر التألق⁷^،²²^،²⁴. على سبيل المثال ، NAD (P) H له عمر مضان أقصر عندما لا يكون مرتبطا بإنزيم²². نظرا لأن جزيئات الفلورسنت الذاتي مثل NAD (P) H ، التي تشارك في مئات التفاعلات الأيضية ، يتم استخدامها بشكل مختلف بواسطة الخلايا التي تتقدم عبر حالات أو سلوكيات خلوية مختلفة ، يمكن اكتشاف هذه التحولات وقياسها كميا باستخدام مجهر متعدد الفوتون يكتشف عمر التألق الذاتي²³. جنبا إلى جنب مع وفرة أو شدة التألق الذاتي ، توفر هذه المقاييس معلومات متعددة الأبعاد لفصل NSCs إلى حالة خلية أو أخرى ومن خلال التحولات الديناميكية بين الحالات. ثالثا ، يصف هذا البروتوكول أداء وتحليل وتفسير FLIM ومقاييس الشدة لإشارات القناة 1 (NAD (P) H) والقناة 2 (PAF) باستخدام مجهر متعدد الفوتونات. باختصار ، يصف هذا البروتوكول مجموعة أدوات خلية حية خالية من الملصقات لدراسة سكون NSC التي توفر بيانات خلية واحدة عالية الدقة حول حالة NSC.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة ويسكونسن ماديسون.

1. استخدام مجهر متحد البؤر لتصوير PAF في qNSCs و aNSCs لتحديد حالة خلية NSC

إنشاء qNSCs و aNSCs في المختبر من ثقافات NSC الأولية.
1. مزرعة NSCs منقاة من أدمغة الفئران البالغة في وسط تكاثري للتوسع (الجدول 1) ¹⁸ ^، ²⁰ ^، ²¹. وبالتالي ، بشكل افتراضي ، فإن ثقافات NSC في المختبر هي aNSCs.
2. لإنشاء qNSCs ، استخدم البروتوكول التالي لوضع aNSCs على الأواني الزجاجية المطلية ثم معالجتها بوسط qNSC للحث على الهدوء على مدار 3 أيام.
3. قم بإعداد الأواني الزجاجية ذات معامل الانكسار المناسب لأهداف الغمر في الزيت للالتصاق ب NSCs عن طريق الطلاء أولا بمحلول بولي L-ornithine (PLO ؛ 10 مجم / مل في الماء للبلاستيك ، 50 مجم / مل في الماء للزجاج) يكفي لتغطية قاع الطبق (لبئر تصوير 1 سم² ، استخدم ~ 150 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في ddH₂O.
4. قم بإزالة محلول PLO واغسله 3 مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
5. قم بتغطيتها بمحلول اللامينين (5 مجم / مل) كافية لتغطية قاع الطبق (لبئر تصوير 1 سم² ، استخدم ~ 150 ميكرولتر) في PBS واحتضانه لمدة 3 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية ، أو بين عشية وضحاها.
6. قم بإزالة محلول اللامينين ، ثم أضف وسط ثقافة كاف لتغطية قاع الطبق (للحصول على كوفيت تصوير 1 سم² ، استخدم ~ 150 ميكرولتر).
7. قم بإعداد الخلايا للتربسين عن طريق الطرد المركزي aNSCs (يمكن أن تبدأ كطبقات أحادية أو مجالات عصبية) عند 120 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT ، ~ 25 درجة مئوية).
8. قم بتربسين aNSCs المحببة من الخطوة السابقة في 100 ميكرولتر من مزيج التربسين لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ثم قم بإخماد التربسين ب 200 ميكرولتر من مزيج مثبطات التربسين (الجدول 1).
9. اسمح للمراكز الوطنية للاتصالات بالجلوس لمدة دقيقتين ، ثم قم بترتيبيتها ميكانيكيا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات.
10. أضف 5 مل من وسط aNSC ، وقم بتدوير الخلايا عند 120 × جم لمدة 4 دقائق.
11. أعد تعليق الخلايا العصبية العصبية في 1 مل من وسط aNSC وقم بلوحة الخلايا عند التقاء 10٪ -20٪ في وسط aNSC. على سبيل المثال ، قم بلوحة ~ 5,000 خلية في بئر واحد من بئر تصوير 1 سم² مع وسط 150 ميكرولتر.
12. بعد السماح لمدة 24 ساعة حتى تلتصق aNSCs بسطح الطبق ، قم بإزالة وسط aNSC واستبدله بوسط qNSC يكفي لتغطية قاع الطبق (للحصول على بئر تصوير 1 سم² ، استخدم ~ 150 ميكرولتر ؛ الجدول 1- كما هو موضح^{سابقا 10}^،¹³^،¹⁷^،¹⁸) في الآبار التي سيتم فيها إحداث السكون.
13. قم بتغيير وسيط aNSC و qNSC مرة واحدة على الأقل كل يومين. بعد 3 أيام في وسط qNSC ، تكون الخلايا العصبية السرطانية هادئة ويمكن استخدامها لتجارب التصوير.
استخدم مجهر متحد البؤر لتصوير qNSCs و aNSCs الحية في المختبر.
ملاحظة: كل مجهر له برنامج احتكاري. وبالتالي ، اتبع هذه الخطوات عن طريق تنفيذ إجراءات مماثلة لتكوين مجهر معين. سيوفر هذا البروتوكول تعليمات للعمل في NIS-Elements.
1. قم بتكوين المجهر متحد البؤر للتصوير الذاتي الفلوري.
  1. انقر فوق 405 Laser (ليزر) ، واكتب نافذة الإرسال داخل قائمة 405 Laser . انقر فوق TD لتجميع صورة ضوئية مرسلة وتعيين قيمة HV لتصور العينة.
  2. اضبط طاقة الليزر على 3.5٪ والكسب على 75. اضبط التكبير/التصغير على 2. قم بإعداد معلمات المسح متحد البؤر، واضبط Pixel Dstay على 0.5، واضبط الدقة على 2048 × 2048 بكسل.
2. اجعل الخلايا في التركيز تحت عدسة موضوعية بالغمر بالزيت ~ 60x باستخدام المجال الساطع للتركيز.
3. قم بالتبديل إلى وضع المسح متحد البؤر بالنقر فوق منفذ العين ، مما يضمن أن مسار الضوء ينتقل الآن إلى رأس المسح وعدم وجود مكعب مرشح في مسار الضوء.
4. يتم إثراء PAF في qNSCs وهو قابل للإثارة والانبعاث على نطاق واسع (انظر الشكل 1). اختر أفضل تكوين بصري بناء على قدرات النظام باستخدام الشكل 1 كدليل. للحصول على أقوى وأنظف إشارة ، قم بالإثارة باستخدام ليزر بين ~ 400-500 نانومتر ، واجمع ~ 580-620 نانومتر ، واستخدم عدسة موضوعية غمر الزيت ~ 60x.
  ملاحظة: يتطلب التصوير الذاتي التألق قوى ليزر أعلى للإثارة مما تتطلبه تجارب التصوير النموذجية. في حالة تصوير جزيئات الفلورسنت الذاتي الأخرى أو الملصقات الأخرى مع PAF ، قم بتصميم التكوين البصري بعناية لتجنب النزيف في قنوات التألق الذاتي.
5. الحصول على صور للتألق الذاتي في qNSCs و aNSCs. انقر فوق مسح ضوئي، ثم ركز على الصورة، ثم انقر فوق التقاط. للحصول على أفضل الصور ، اجمع صورا أحادية المستوى مع سيتوبلازم الخلايا (بناء على التألق الذاتي الباهت المنتشر في جميع أنحاء الخلية) في التركيز للحصول على مقطع عرضي تمثيلي لكل خلية.
6. استخدم تكوينا بصريا متطابقا (على سبيل المثال ، نفس طاقة الليزر) وعينات صور في نفس اليوم إذا كنت تهدف إلى مقارنة الصور المختلفة مباشرة.
7. تعتمد القوى الدقيقة لليزر والكاشف على كل نظام محدد. ابدأ باستخدام قوى ليزر منخفضة ثم قم بزيادة القوى ببطء حتى يمكن اكتشاف الإشارة دون تشبعها.
تحليل PAF في qNSCs و aNSCs الحية في المختبر.
1. بعد الحصول على صور التألق الذاتي في qNSCs أو aNSCs ، حدد الصور عن طريق فتح ملف في ImageJ²⁵.
2. استخدم الخيار Process > Filters > Gaussian Blur (Sigma: 2) على صورة التألق الذاتي qNSC / aNSC لتنعيم وحدات البكسل غير المستوية.
3. استخدم Image > Adjust > Threshold لتحديد وحدات البكسل التي تمثل PAF (إزالة وحدات بكسل الخلفية) وانقر فوق تطبيق. استخدم نفس معلمات العتبة لجميع الصور التي ستتم مقارنتها مباشرة.
4. استخدم عملية > مستجمعات المياه الثنائية > لفصل PAFs على مقربة مكانية قريبة.
5. باستخدام فأرة الكمبيوتر ، ارسم منطقة اهتمام (ROI) حول الخلية ، كما هو محدد إما من خلال النظر إلى صورة المجال الساطع أو من خلال النظر إلى التألق الذاتي المنتشر الموجود بالتساوي في جميع أنحاء السيتوبلازم للخلية.
  ملاحظة: من الجيد عموما استبعاد العمليات الطرفية الرقيقة وتضمين النواة لأن التألق الذاتي غير موجود عادة في هذه المواقع وبالتالي لن يعطل التحليل.
6. استخدم تحليل > تحليل الجسيمات (الحجم: 0.1 ميكرومتر لا نهاية ؛ التعميم : 0-1) مع تلخيص فحص.
  ملاحظة: ستنتج ImageJ بعد ذلك نافذة إخراج تحتوي على بيانات عن الجسيمات في المنطقة محل الاهتمام ، مما يسمح بجدولة عدد PAF في كل خلية. يمكن إقران جزيئات الفلورسنت الأخرى بتصوير PAF. ومع ذلك ، نظرا لأن PAF هي إشارة خافتة نسبيا ، فمن المهم التحقق من أن الفلوروفورات الأخرى لا تنزف في قناة PAF. عادة ، يمكن إقران الفلوروفورات التي تمتص 600+ نانومتر وتنبعث منها 650+ نانومتر مع التصوير PAF ، مثل LipidSpot 610.

2. استخدام FACS لإثراء حالة تنشيط NSC في NSCs المستنبتة على أساس التألق الذاتي

إنشاء qNSCs و aNSCs كما هو موضح في القسم 1.
قم بفرز مزيج من qNSCs و aNSCs الحية بناء على التألق الذاتي.
ملاحظة: على سبيل المثال، سيناقش هذا البروتوكول كيفية إثراء aNSCs أو qNSCs في عينة تم إنشاؤها عن طريق خلط qNSCs و aNSCs بنسبة 1: 1.
1. قبل التربسين وفرز الخلايا ، قم بتسمية الخلايا التي تتقدم خلال المرحلة S عن طريق إضافة 10 ميكرومتر 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU ؛ نظير ثيميدين يدمج في الخلايا التي تصنع الحمض النووي ، كما هو الحال في المرحلة S من دورة الخلية) إلى وسط زراعة الخلية لمدة 1 ساعة.
2. قم بتربسين qNSCs و aNSCs كما تمت مناقشته في الخطوات 1.1.8 ، وأعد تعليقه في 0.5 مل من المخزن المؤقت FACS (الجدول 1) ثم ضعه على الجليد.
  ملاحظة: تلتصق qNSCs بقوة بالطبق. عند التقاء أعلى نسبيا ، يمكن فصل qNSCs ميكانيكيا عن الطبق. ومع ذلك ، إذا كانت qNSCs عند التقاء أقل نسبيا أو يصعب إزالتها من الطبق ميكانيكيا عن طريق سحب العينات ، فاستخدم التربسين لإزالتها من الطبق.
  1. قم بإزالة وسط الاستزراع من qNSCs وأضف 0.25٪ تربسين يكفي لتغطية قاع الطبق (لكوفيت تصوير 1 سم² ، استخدم ~ 150 ميكرولتر) ، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  2. بعد الحضانة ، قم بإخماد تفاعل التربسين عن طريق إضافة وسيط يتوافق مع كل نوع خلية يساوي حجم التربسين المضاف. فصل الخلايا ميكانيكيا عن الطبق قبل التجميع والطرد المركزي.
3. باستخدام فوهة ~ 130 ميكرومتر ، قم بتحليل qNSCs و aNSCs باستخدام مقياس التدفق الخلوي أو FACS مع الظروف البصرية بناء على قدرات الجهاز واكتشاف PAF كما هو موضح في الشكل 1. على سبيل المثال ، استخدم ليزر 405 نانومتر لإثارة العينة واستخدم مرشح 580-620 نانومتر للكشف.
4. اجمع ما لا يقل عن 10,000 qNSCs و aNSCs مفردة في ملف بيانات ثم استخدمها لتصميم بوابات لجمع إثراء qNSCs أو aNSCs. على سبيل المثال، قم بتعيين البوابات لتجميع أعلى 25٪ أو 25٪ السفلية من NSCs بناء على شدة التألق الذاتي في العينة المختلطة aNSC:qNSC (1:1).
5. بعد ضبط البوابات لفرز المفردات ذات التألق الذاتي الأكثر إشراقا أو باهتة كما هو موضح أعلاه ، قم بفرز الخلايا إلى آبار مطلية بطبقة من اللامينين مملوءة بوسط aNSC (10,000 خلية / سم² ، انظر الخطوة 1.1.3).
6. بعد FACS ، اسمح لمراكز الأمن القومي بالجلوس لمدة 3 ساعات في الحاضنة. قم بإصلاح الخلايا عن طريق معالجتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد تكفي لتغطية قاع الطبق (لكوفيت تصوير 1 سم² ، استخدم ~ 150 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة في RT.
  ملاحظة: لتصور EdU في الخلايا ، من الأسهل الحصول على مجموعة تجارية للكشف عن EdU واتباع البروتوكول الموصى به من الشركة المصنعة.
7. أولا ، قم باختراق الخلايا عن طريق العلاج باستخدام 0.25٪ تريتون في PBS لمدة 15 دقيقة في RT.
8. بعد ذلك ، عالج الخلايا بمحلول تلطيخ EdU في RT لمدة 30 دقيقة.
  ملاحظة: سيختلف التركيب الدقيق لمحلول تلطيخ EdU اعتمادا على مصدر الكواشف ولكنه يتكون تقريبا من مخزن مؤقت للتفاعل ، ومضافات عازلة للتفاعل ، وكبريتات النحاس ، وجزيء ألكين أو أزيد معدل. انظر جدول المواد للحصول على مجموعة موصى بها.
9. بعد التلوين لتصور EdU ، اغسل العينات 3 مرات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS.

3. استخدام مجهر متعدد الفوتون للكشف عن التألق الذاتي للقناة 1 والقناة 2 وإجراء FLIM على NSCs في المختبر لتحديد مجموعات حالة خلية NSC والتحولات

ملاحظة: كل مجهر له برنامج احتكاري. وبالتالي ، اتبع هذه الخطوات عن طريق تنفيذ إجراءات مماثلة لتكوين مجهر معين. سيوفر هذا البروتوكول تعليمات للعمل في Prairie View.

إنشاء qNSCs و aNSCs كما هو موضح في القسم 1.
قم بإعداد المجهر متعدد الفوتون للتصوير مدى الحياة الفلورية.
1. استخدم عدسة شيئية بتكبير 40x أو أكبر (~1.15 NA).
2. استخدم مجهرا متعدد الفوتون مع المكونات التالية أو ما يعادلها: ليزر فائق السرعة قابل للضبط ، وثنائي اللون بطول 720 نانومتر ، وأنبوب مضاعف ضوئي لفوسفيد زرنيخيد الغاليوم (GaAsP) (PMT) ، وإلكترونيات عد الفوتون أحادي المرتبط بالوقت ، ومقياس طاقة تناظري.
3. بالنسبة لتصوير القناة 1 ، اضبط الليزر القابل للضبط على 750 نانومتر واستخدم مكعب مرشح انبعاث 440/80 نانومتر. بالنسبة للتصوير في القناة 2 ، اضبط الليزر على 890 نانومتر واستخدم مكعب مرشح انبعاث 550/100 نانومتر.
  ملاحظة: قم بإطفاء أضواء الغرفة قبل تشغيل PMT.
وظيفة استجابة الأداة
1. التقط وظيفة استجابة الأداة (IRF) عن طريق تصوير بلورة اليوريا المسحوقة لحساب الاستجابة الزمنية للأداة في الاضمحلال المقاس.
  ملاحظة: يتم تضمين IRF مع الاضمحلال لحساب منحنى ملاءمة الاضمحلال بدقة. للاقتناء ، يتم ضبط الليزر على 890 نانومتر ، ويتم استخدام مكعب مرشح الانبعاث 440/80 نانومتر. يتم تعيين GaAsP PMT عند كسب 800 ، ويتم ضبط pockels (طاقة الليزر) منخفضة جدا في البداية ، وعادة ما تكون 1.
2. حدد مجال رؤية باليوريا البلورية وقم بزيادة الكرات قليلا (بحد أقصى 15).
3. بعد ذلك ، احصل على صورة باستخدام نفس المعلمات المستخدمة لتصوير الخلية: تمييز الكسر الثابت (CFD) 1 × 10⁴- 1 × 10⁵ ، دقة 256 × 256 ، وقت السكون المحدد عند 4.8 ميكرو ثانية ، ضبط التكبير البصري على 1.5x ، ووقت تكامل 60 ثانية.
إجراء التصوير الفلوري مدى الحياة والتصوير الشديد للقناة 1 والقناة 2 التألق الذاتي على qNSCs و aNSCs الحية في المختبر
1. ابحث عن مجال رؤية للصورة: استخدم العينين للعثور على مجال رؤية مناسب وتغيير مسار الضوء إلى العينة على المجهر لتمكين التصوير.
  ملاحظة: سيتم الحصول على صورة القناة 1 أولا، تليها صورة القناة 2 لمجال الرؤية نفسه.
2. الإعداد لجمع صورة القناة 1: انقر فوق علامة التبويب Power / Gain واضبط الكسب على PMT على 800 ، وانقر فوق علامة التبويب 2-P Laser وحدد 750 نانومتر لليزر ، وتأكد من استخدام مكعب المرشح المناسب (440/80 نانومتر).
3. جمع صورة القناة 1.
  1. ابدأ وضع المعاينة بالانتقال إلى علامة التبويب Power / Gain وتعيين Pockels على 30 ، ثم الانتقال إلى قسم المسح الضوئي في تلك الشاشة والنقر فوق Live Scan.
  2. قم بزيادة Pockels للعثور على مجال رؤية جيد بطاقة ليزر منخفضة (أقل من 3.6 ميجاوات). بمجرد العثور على مجال الرؤية ، اضبط Pockels بحيث يقرأ عداد الطاقة ~ 3.6 ميجاوات على الطاقة بعد خلية البوكل ، ويقيس محدد الكسر الثابت (CFD) في علامة التبويب معدلات العد 1 × 10⁴- 1 × 10⁵.
4. انتقل إلى قسم المسح الضوئي وانقر فوق مسح واحد بمجرد استيفاء هذه المعلمات. سيؤدي ذلك إلى الحصول على صورة القناة 1 على مدى 60 ثانية.
5. لجمع صورة القناة 2 ، انقر فوق علامة التبويب 2-P Laser وحدد 890 نانومتر لليزر ، وقم بتبديل مكعب المرشح إلى مكعب انبعاث القناة 2 (550/100 نانومتر).
6. ابدأ وضع المعاينة كما هو موضح في 3.4.3 ، وقم بزيادة Pockels حتى يقرأ عداد الطاقة ~ 7 ميجاوات ، وتكون أعداد العقود مقابل الفروقات مرة أخرى 1 × 10⁴-1 × 10⁵.
7. انتقل إلى قسم المسح وانقر فوق مسح واحد بمجرد استيفاء هذه المعلمات. سيؤدي هذا إلى الحصول على صورة للقناة 2 على مدى 60 ثانية.
8. الحصول على المزيد من الصور - بعد الحصول على صورة القناة 1 والقناة 2، ابحث عن مجال رؤية جديد وكرر الخطوات 3.4.2 - 3.4.4. عادة ما يكون جمع 4-6 حقول رؤية للصورة ~ 50-100 خلية كافيا لشرط واحد في التجربة.
  ملاحظة: يمكن استخدام mCherry كملصق فلوري إضافي دون النزيف في قناتي القناة 1 والقناة 2.
تحليل صور العمر الفلوري.
1. قم بإنشاء مصفوفات اضمحلال لصور العمر المضان في SPCImage باتباع الخطوات 3.5.2-3.1.14.
  ملاحظة: للحصول على معلومات إضافية ، راجع الكتيبات المحدثة المتاحة مجانا عبر الإنترنت²⁶.
2. افتح SPCImage وافتح صورة IRF FLIM التي تم جمعها في القسم 3.3.
3. اضبط الأشرطة السوداء الرأسية في الرسم البياني لتقتصر على منحنى اضمحلال IRF. من شريط القائمة العلوي ، انقر فوق IRF > نسخ إلى الحافظة.
4. افتح ملف صورة FLIM ضمن مجموعة البيانات المراد تحليلها ، والتي تم الحصول عليها في القسم 3.4.
5. من شريط القائمة العلوي ، انقر فوق IRF > لصق من الحافظة.
6. في الجزء السفلي الأيمن من البرنامج ، اضبط المكونات على 2.
7. في شريط القائمة العلوي للبرنامج ، انقر فوق خيارات > نموذج. ثم حدد MLE للطريقة الملائمة، والتجميع المكاني إلى المربع، والعتبة إلى الذروة، وضمن الإعدادات، حدد اضمحلال الأسي المتعدد.
8. في الجزء السفلي الأيسر من البرنامج ، قم بزيادة الحاوية حتى يصل عدد الفوتونات إلى 100 على الأقل في وحدات البكسل السيتوبلازمية التمثيلية في ذروة عدد الفوتونات مباشرة بعد الإثارة.
9. في الجزء السفلي الأيسر من البرنامج ، قم بتعيين العتبة. بالنسبة للقناة 1 ، استخدم عتبة "50". بالنسبة إلى القناة 2، استخدم حدا "0".
10. في شريط القائمة العلوي للبرنامج (يصف هذا البروتوكول كيفية تشغيل الإصدار 8.3) ، انقر فوق حساب > Decay Matrix.
  ملاحظة: تأكد من أن قيم Chi² هي ~ 0.8-1.2 في جميع أنحاء الصورة. هذا يؤكد أن البيانات ستكون قوية من خلال التحقق من صحة نمذجة الاضمحلال ثنائي الأس.
11. في شريط القائمة العلوي ، انقر فوق حفظ > الملف.
12. في شريط القائمة العلوي للبرنامج ، انقر فوق File > Export ، وقم بتصدير ما يلي:
  القيمة المرمزة بالألوان، T1، T2، تشي²، كثافة البكسل، A1[٪]، A2[٪] والصورة المرمزة بالألوان (مع وسيلة الإيضاح)
  ملاحظة: تم الآن إعداد SPCImage للقيام بعملية دفعية ، وتحليل جميع صور قناة معينة (تحليل صور FLIM للقناة 1 معا ثم كرر بدءا من الخطوة 3.5.2 لصور FLIM في القناة 2).
13. لإجراء عملية دفعية ، انقر فوق حساب > معالجة الدفعات وحدد صور FLIM المراد معالجتها.
14. في شريط القائمة العلوي ، انقر فوق ملف > تصدير > تصدير دفعة وحدد مصفوفات الاضمحلال المراد تصديرها (التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة).
15. استخدم CellProfiler لإنشاء أقنعة سيتوبلازمية باتباع الخطوات 3.5.16-3.5.24.
  ملاحظة: للقيام بذلك ، ستكون النوى يدويا حول صور شدة القناة 1 ، حيث تكون النواة سوداء ومرئية بوضوح. ثم سينتج خط أنابيب CellProfiler manual_segmentation.cpproj²⁷ (الملف التكميلي 1) تلقائيا خلية كاملة وقناع سيتوبلازمي ، وفقا لتوجيهات القناع النووي. يمكن بدلا من ذلك تسمية النوى باستخدام mCherry وتصويرها جنبا إلى جنب مع القناة 1 والقناة 2 التألق الذاتي لتوفير القدرة على أتمتة تحديد النوى. ومع ذلك ، فإن العديد من الأصباغ النووية التقليدية سوف تنزف طيفيا في قنوات التألق الذاتي وبالتالي فهي غير متوافقة مع هذه التقنية.
16. في R Studio، استخدم R_ASCtoTIFF.rmd²⁷ (الملف التكميلي 2) لتحويل ملفات X_photons.asc ، حيث X هو اسم الصورة المكتسبة من صورة القناة 1 التي تم تعيينها إلى ملفات TIF.
17. افتح محلل ملفات تعريف الخلية وافتح manual_segmentation.cpproj.
18. قم بالتحميل في TIF الفوتونات للقناة 1 التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.5.16 في خطوة الصور في الجزء العلوي من خط الأنابيب.
19. في الخطوات الثلاث السفلية في خط الأنابيب بعنوان SaveImages ، قم بتعيين مسار حفظ للأقنعة التي سينشئها CellProfiler.
20. انقر فوق بدء وضع الاختبار في الجزء السفلي الأيسر من CellProfiler.
21. انقر فوق تشغيل في الجزء السفلي الأيسر من CellProfiler. عندما يصل CellProfiler إلى الخطوة IdentifyObjectsManually ، ستظهر نافذة تعرض صورة القناة 1 الحالية التي تتم معالجتها.
22. انقر فوق المفتاح F على لوحة المفاتيح ثم ارسم يدويا أثرا لنوى خلية واحدة أثناء الضغط باستمرار على زر النقر بزر الماوس الأيسر. بعد تتبع النوى ، حرر زر النقر بزر الماوس الأيسر على الماوس. كرر هذه الخطوة لجميع الخلايا في الصورة.
23. انقر فوق تم في أسفل يمين النافذة المنبثقة مع صورة الكثافة. سينتهي البرنامج الآن من خط الأنابيب وتصدير أقنعة السيتوبلازمية والنووية والخلايا الكاملة.
24. في أسفل اليسار ، انقر فوق مجموعة الصور التالية وكرر الخطوات 3.5.21-3.5.23 لجميع صور TIF على القناة 1.
25. استخدم البرنامج النصي R (دمج مصفوفات الاضمحلال والأقنعة السيتوبلازمية.rmd) لدمج مصفوفات الاضمحلال التي تم إنشاؤها في الخطوات 3.5.2-3.5.14 والأقنعة السيتوبلازمية التي تم إنشاؤها في الخطوات 3.5.15-3.5.24 للحصول على متوسط متغيرات التصوير المضان لسيتوبلازم كل خلية باتباع الخطوات 3.5.26-3.5.30
26. باستخدام جدول بيانات (على سبيل المثال ، Microsoft Excel) ، قم بإنشاء مستند .csv بعنوان test_key²⁷ [ملف تكميلي 3] على سبيل المثال) مع 3 أعمدة.
27. قم بتسمية الأعمدة باسم المجلد و NADH و FAD. املأ الجدول لإدراج موقع المجلد في المجلد ، ثم بادئة عنوان الصورة في NADH و FAD ، على التوالي ، لربط كل صورة قناة 1 بكل صورة قناة 2 (انظر مثال البيانات - الجدول 2).
في R Studio ، افتح دمج مصفوفات الاضمحلال والأقنعة السيتوبلازمية.rmd²⁷ (الملف التكميلي 4).
1. قم بتعيين مسارات الملفات التالية كما هو موضح في البرنامج النصي: تعيين دليل العمل ، وموقع ملف القناة 1 ، وموقع ملف FAD ، وموقع ملف القناع ، وموقع ملف الإخراج واسمه.
2. قم بتشغيل البرنامج النصي بالكامل. عند الانتهاء بنجاح من البرنامج النصي ، سيتم إنشاء ملف إخراج ، بما في ذلك البيانات الشرحية ومتوسط متغيرات FLIM.
3. قم بإجراء التحليل باستخدام التألق الذاتي FLIM data.rmd²⁷ (الملف التكميلي 5) أو باستخدام أي برنامج تحليل آخر.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير الذاتي الفلوري متحد البؤر لفصل حالة خلية NSC (الشكل 1)
لاستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لحل حالة تنشيط NSC ، تم إنشاء qNSCs و aNSCs في المختبر باستخدام إما وسط تنشيط أو وسط هدوء ، كما هو موضح سابقا¹⁰^،¹³^،¹⁷^،¹⁸. للكشف عن PAF في الخلايا العصبية العصبية ، تم تصوير qNSCs و aNSCs الحية باستخدام نفس التعرض على مجهر متحد البؤر (على سبيل المثال: 405 نانومتر ، Em: 580-620 نانومتر). أظهرت qNSCs عددا أكبر من PAF مقارنة ب aNSCs (الشكل 1 أ ، ب). توضح هذه النتيجة كيف يمكن استخدام خصائص التألق الذاتي كعلامات لتحديد حالة الخلية ل qNSCs و aNSCs.

إثراء FACS لحالة خلية NSC باستخدام التألق الذاتي (الشكل 2)
لإثراء حالة دورة الخلية باستخدام FACS ، تم إنشاء qNSCs و aNSCs في المختبر¹⁰^،¹³^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹ كما هو موضح في هذا البروتوكول وتم تصنيفها مسبقا باستخدام EdU لمدة 1 ساعة قبل التربسين والتحليل في مقياس التدفق الخلوي لتسمية الخلايا التي تتقدم خلال المرحلة S. ثم تم تحليل qNSCs و aNSCs عن طريق قياس التدفق الخلوي إما بشكل منفصل أو مختلط بنسبة 1 qNSC: 1 aNSC (الشكل 2). تم رسم البوابات لإثراء aNSCs أو qNSCs من السكان المختلطين ، ثم تم فرز الخلايا بناء على هذه البوابات. بعد FACS ، تم طلاء الخلايا الموجودة في كل عينة على أواني زجاجية مطلية بطبقة من مادة PLO والسمكة لها بالالتصاق بالطبق لمدة 3 ساعات قبل تثبيتها وتلطيخها وتحليلها بحثا عن خلايا EdU٪ +. من المتوقع أن تكون الخلايا التي تم فرزها من بوابة التألق الذاتي العالية أقل EdU + من عينة Mix ، وكانت العينات التي تم فرزها من خلال بوابة التألق الذاتي المنخفضة أكثر تكاثرا من عينة Mix (الشكل 2C). تؤكد هذه النتيجة القدرة على إثراء حالة تنشيط NSC من خليط غير متجانس من qNSCs و aNSCs باستخدام FACS.

التصوير الفلوري متعدد الفوتون مدى الحياة لتصنيف حالة خلية NSC (الشكل 3)
تم إنشاء qNSCs و aNSCs في المختبر ثم تم تصويرها باستخدام مجهر متعدد الفوتون لأداء FLIM على القناة 1 التألق الذاتي (على سبيل المثال: 750 نانومتر (2P) ، Em: 360-520 نانومتر) والقناة 2 (على سبيل المثال: 890 نانومتر (2P) ، Em: 450-650 نانومتر) (الشكل 3 أ ، الجدول 2). أظهرت qNSCs و aNSCs ملامح ذاتية الفلورسنت كانت مختلفة إلى حد كبير. على سبيل المثال ، كان لدى qNSCs متوسط عمر مضان أعلى للقناة 1 τ_m ، ولكن أقل α₁ مقارنة ب aNSCs. لتقييم قدرة بيانات التألق الذاتي NSC FLIM على التنبؤ بحالة تنشيط NSC ، تم إنشاء نموذج انحدار لوجستي بكثافة القناة 1 ، α₁ ، τ₁ ، τ₂ وشدة القناة 2 ، α₁ ، τ₁ ، τ_2.يوضح منحنى مشغل المستقبل أن هذه البيانات كافية لإنشاء نموذج شبه مثالي (المساحة تحت المنحنى = 0.963) ، والتنبؤ بدقة بحالة تنشيط NSC. توضح هذه البيانات معا قدرة FLIM والتألق الذاتي لاستخدامها لتصنيف حالة خلية NSC.

figure-results-1
الشكل 1: يحل التصوير متحد البؤر المؤشرات الحيوية ذاتية الفلورسنت لحالة تنشيط NSC. (A-B) qNSCs (أرجواني) و aNSCs (أسود) تم تصويرها باستخدام نفس التعرض على مجهر متحد البؤر (أحمر ؛ مثال 405 نانومتر ، Em 580-620 نانومتر) وتحليلها لعدد PAF (N = 3 ، اختبار مان ويتني ، متوسط ± SD). تشير الخطوط البيضاء المتقطعة إلى حافة الخلية ، وتشير الخطوط الزرقاء المتقطعة إلى النوى. (ج) تم تصوير التألق الذاتي في نفس qNSC باستخدام ظروف مختلفة للإثارة والانبعاث ، كما هو موضح في الشكل ، مع قوة ليزر متطابقة وكسب. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر. **** ص < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: يمكن أن تثري FACS لحالة تنشيط NSC. (AC) qNSCs أو aNSCs أو qNSCs: تم التعامل مع مزيج aNSCs (1: 1) باستخدام EdU لمدة ساعة واحدة ، بالتربسين ، ثم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال: 405 نانومتر ، Em: 580-620 نانومتر). ثم تم فرز الخلايا المختلطة (1: 1) بواسطة FACS للخلايا التي تحتوي على تألق ذاتي منخفض أو مرتفع ، وتم طلاؤها ، وتحليلها للتكاثر عن طريق قياس النسبة المئوية للخلايا التي كانت EdU +. يتم اختصار الوحدات التعسفية باسم "A.U". (N = 4 ، ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق ، يعني ± SD). ص < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: يكشف التصوير الفلوري متعدد الفوتون عن المؤشرات الحيوية لحالة تنشيط NSC. (أ) تخطيطي يصور تحليل تركيب المنحنى لبيانات FLIM المكتسبة. (ب) قياسات القناة 1 والقناة 2 FLIM ، بما في ذلك الكثافة ومتوسط العمر (T_m) والمساهمة الكسرية (α₁) لبيانات qNSC (الأرجواني) و aNSC (الأسود) (ن = 501 خلية ، انحدار لوجستي ثنائي الوجهين ، نموذج خطي معمم). (ج) منحنى مشغل المستقبل الذي يبين نموذج التحوف اللوجستي المتولد باستخدام شدة القناة 1_{α 1} وτ₁ وτ₂ وشدة القناة 2 α₁ وτ₁ وτ₂ لتصنيف الخلايا الصافية الإحصائية على أنها مركبات سحب ملزمية أو qNSCs. ص < 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وسائل الإعلام والحلول. وصفات لجميع الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: أمثلة على البيانات. بيانات qNSC و aNSC FLIM التمثيلية للقناة 1 والقناة 2 الفلورية الذاتية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: manual_segmentation.cpproj الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: R_ASCtoTIFF.rmd الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: test_key الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: دمج مصفوفات الاضمحلال والأقنعة السيتوبلازمية.rmd الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: التألق الذاتي FLIM data.rmd الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تقنية دقة خلية حية وخالية من الملصقات وغير مدمرة وأحادية الخلية تسمح بتصنيف حالة خلية NSC في المختبر من خلال تصوير إشارات الفلورسنت الذاتي في الخلايا العصبية الوطنية. يكتشف هذا النهج التحولات الأيضية التي تحدث أثناء خروج سكون NSC ، والتي تؤثر على الخصائص البصرية للعوامل المساعدة الأيضية ، مثل NAD (P) H ، ويوفر العديد من المزايا مقارنة بالتقنيات الحالية لدراسة سكون NSC. على سبيل المثال ، تتطلب العديد من التقنيات التقليدية لدراسة qNSCs و aNSCs ، مثل وضع العلامات باستخدام علامات دورة الخلية مثل EdU ، تثبيت العينات. الطرق الموجودة حاليا القادرة على دراسة الخلايا العصبية الوطنية الحية محدودة بشكل أكبر من خلال طلب إدخال ملصقات خارجية ، عادة عن طريق توليد جينات معدلة وراثيا مشفرة للبروتين الفلوري. هذه الأدوات محدودة في كل من الموارد المطلوبة لتوليدها والعديد من المحاذير الفنية. على سبيل المثال ، تستخدم بروتينات الخيوط الوسيطة nestin والبروتين الحمضي الدبقي الدبقي (GFAP) بشكل شائع كعلامات ل qNSCs و aNSCs¹²^،¹³^،¹⁸^،²⁸^،²⁹. ومع ذلك ، من المعروف أن nestin و GFAP يتم التعبير عنهما بشكل تفاضلي بين qNSCs و aNSCs¹²^،¹³^،¹⁸^،²⁸^،²⁹. علاوة على ذلك ، يوفر التصوير الفلوري الذاتي بيانات خلية واحدة عالية الدقة ، والتي يمكن أن تكشف عن عدم تجانس الخلية المفردة المفقودة أو المعقدة لتفسيرها في التجارب التي تبلغ ذروتها في تحليل مجمع لمجموعة من الخلايا.

ومع ذلك ، فإن التصوير الذاتي الفلوري له أيضا العديد من القيود. تضيع العديد من إشارات الفلورسنت الذاتي عند تثبيت الخلية. وبالتالي ، فإن التصوير الذاتي الفلوري يقتصر إلى حد كبير على دراسة الخلايا الحية. يعتمد التصوير الفلوري الذاتي أيضا على نقص الفلوروفورات التي يتم إدخالها خارجيا ، والتي يمكن أن تنزف في قنوات الفلورسنت الذاتي. على الرغم من أن العديد من الفلوروفورات يمكن أن تكون متوافقة مع التصوير الذاتي الفلوري في مواقف محددة ، إلا أن إقران التصوير الذاتي بالتألق مع العديد من الأدوات الموجودة ليس ممكنا دائما. يمكن أن يؤدي تصوير الخلايا الحية أيضا إلى السمية الضوئية. لا يؤدي تكرار واحد للتصوير باستخدام هذا البروتوكول إلى السمية الضوئية الكافية لتقليل قابلية NSC للبقاءة. ومع ذلك ، فإن التصوير المتكرر للخلايا في مسار زمني على فترات أكثر تواترا عدة مرات في اليوم قد يولد سمية ضوئية كبيرة ، وبالتالي ، فهي ليست استراتيجية قابلة للتطبيق لدراسة سكون NSC. أخيرا ، على الرغم من أنه يمكن استخدام التصوير الذاتي الفلوري لدراسة الخلايا العصبية الوطنية من الفئران الذكور البالغة من العمر 6 أسابيع من الحصين أو البطينين الجانبيين ، فمن غير الواضح مدى اتساع استخدام هذه التقنية لدراسة الخلايا الجذعية من مصادر أخرى أو أعمار أو أنواع أخرى من الخلايا الجذعية.

يفترض البروتوكول الموصوف هنا أيضا الإنتاج الدقيق ل qNSCs و aNSCs في المختبر باستخدام البروتوكولات المعمول بها^{مسبقا 10}^،¹³^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹. إذا كانت إعادة إنتاج نتائج هذا البروتوكول أمرا صعبا، فتأكد من أن qNSCs و aNSCs يتم إنشاؤها بشكل صحيح من خلال البحث عن وجود أو عدم وجود علامات مختلفة ل qNSCs و aNSCs ، كما هو موضح سابقا¹⁰ ^، ¹³ ^، ¹⁷ ^، ¹⁸ ^، ¹⁹. مجتمعة ، يوفر التصوير الذاتي الفلوري نهجا تقنيا جديدا لتحديد qNSCs و aNSCs ودراسة مخارج السكون NSC.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر قلب قياس التدفق الخلوي UW-Madison (P30 CA014520 و 1S10RR025483-01) ، وأعضاء مختبر مور ومجتمع UW-Madison على مساهماتهم. نشكر مصادر التمويل لدينا: NIH T32 T32GM008688 (إلى CSM) ، زمالة ديانا جاكوبس كالمان من AFAR (إلى CSM) ، زمالة ويسكونسن للخريجين (إلى CSM) ، جائزة DP2 NIH New Innovator (1DP2OD025783 ، إلى D.L.M.) ، جائزة Vallee Scholar (إلى D.L.M.) ، NIH 1R56NS130450 (إلى D.L.M و MCS) ، R01 CA185747 (إلى MCS) ، R01 CA205101 (إلى MCS) ، R01 CA211082 (إلى MCS) ، ورقم منحة المؤسسة الوطنية للعلوم. CBET-1642287 (إلى MCS).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
40x عدسة موضوعية مائية	نيكون	MRD77410	موضوعية تستخدم في المجهر متعدد الفوتون في الجزء 3
8 كوفيت بئر	Ibidi	80826-90	للتصوير aNSCs / qNSCs
مقياس الطاقة التناظري	Thorlabs	PM100A	المستخدم في المجهر متعدد الفوتون في الجزء 3
مضاد حيوي مضاد حيوي (100X) (PSF)	مضاد حيوي	15240062	Fisher لوسائط NSC
B-27	Invitrogen	17504044	مكمل غذائي لوسائط
NSC BMP4	Fisher Scientific	5020BP010	عامل لحث الهدوء
ألبومين مصل الأبقار	Sigma	A4919-25G	لصنع ليزر BMP4
Chameleon فائق السرعة	ليزر متماسك	N / A	يستخدم في المجهر متعدد الفوتون في الجزء 3
المجهر	متحد البؤر	نيكون C2	المستخدم في الجزء 1
DMEM / F-12 (بدون GlutaMAX)	Invitrogen	11320033	الوسائط الأساسية ل NSCs
DNAse	Sigma	D5025-15KU	تمت إضافته إلى مثبط التربسين
مجموعة فحص	EdU Invitrogen	C10337	مقايسة الانتشار لزراعة الخلايا
EGF	PeproTech	AF-100-15-500UG	عامل النمو لوسائط NSC
FGF	PeproTech	100-18B	عامل النمو لوسائط NSC
فارز الخلايا المنشطة الفلورية	BD	FACSAria	فارز الخلايا المنشطة بالفلورسنت المستخدم في الجزء 2
مادة مضافة للهيبارين	سيجما	H3149-50KU	لوسائط NSC
L-15	Invitrogen	21083027	لتحضير محلول مثبط التربسين
Laminin	Sigma	L2020-1MG	لطلاء الأواني الزجاجية
نيكون TiE المجهر المقلوب	نيكون	N / A	إطار مجهر المستخدم في الجزء 3
PLO	Sigma	P3655-100MG	لطلاء الأواني الزجاجية
SPC-150 إلكترونيات عد الفوتون الفردي	Becker و Hickl	N / A	المستخدمة في المجهر متعدد الفوتون في الجزء 3
Trypsin (لتربسين الكريات من aNSCs التي كانت تنمو ككرات أو أحادية الطبقات)	15090046 جيبكو		للتربسين في المجالات العصبية أو aNSCs الملتصقة
التربسين (للتربسين qNSCs)	Gibco	25200072	لتربسين qNSCs الملتصقة
مثبط التربسين	Sigma	T6522-100MG	لتثبيط التربسين من aNSCs
بلورات اليوريا	Sigma	U5128-5G	تستخدم لجمع IRF
Versene	Thermo Fisher	15040066	لتحضير التربسين

عدسة Thermo مجهر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).">Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).">Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).
Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).">Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).">Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).">Urban, N., et al. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).
Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).">Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).">Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).">Sagar, M. A. K., et al. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).
Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).">Knobloch, M., et al. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).
A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).">Knobloch, M., et al. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).
SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).">Knobloch, M., et al. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).
Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).">Shin, J., et al. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).">Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).">Beckervordersandforth, R. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).
Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).">Morrow, C. S., et al. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).
Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).">Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).">Mira, H., et al. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).
Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).">Morrow, C. S., et al. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).
Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).">Martynoga, B., et al. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).
Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).">Bin Imtiaz, M. K., Jessberger, S. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).
Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).">Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).
Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).">Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).
Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).">Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).">Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).">ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).">Becker & Hichl Handbooks. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).
https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).">GitHub Materials. , Available from: https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).
Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).">Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).
Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).">Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

تصنيف حالة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في المختبر باستخدام التألق الذاتي

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles