Method Article

التقييم الفسيولوجي المرضي للشبكية في نموذج الفئران

DOI:

10.3791/63111

⸱

May 6th, 2022

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتلال الشبكية السكري هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى. تعد الأنسجة وفحص انهيار الحاجز الدموي والشبكية وتصوير الأوعية الفلورية تقنيات قيمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية للشبكية ، والتي يمكن أن تعزز الفحص الفعال للأدوية ضد اعتلال الشبكية السكري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يغير مرض العين في الجزء الخلفي مثل اعتلال الشبكية السكري فسيولوجيا الشبكية. يتميز اعتلال الشبكية السكري بانفصال الشبكية ، وانهيار حاجز الشبكية الدموي (BRB) ، وتكوين الأوعية الدموية في الشبكية. نموذج الفئران في الجسم الحي هو أداة تجريبية قيمة لدراسة التغيرات في بنية ووظيفة شبكية العين. نقترح ثلاث تقنيات تجريبية مختلفة في نموذج الفئران لتحديد التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية ، والأوعية الدموية الشبكية ، و BRB المعرضة للخطر. يستخدم علم أنسجة الشبكية لدراسة مورفولوجيا خلايا الشبكية المختلفة. أيضا ، يتم إجراء القياس الكمي عن طريق عدد خلايا الشبكية وقياس سمك طبقات الشبكية المختلفة. يستخدم اختبار انهيار BRB لتحديد تسرب البروتينات خارج العين من البلازما إلى الأنسجة الزجاجية بسبب انهيار BRB. يستخدم تصوير الأوعية الدموية الفلوري لدراسة تولد الأوعية الدموية وتسرب الأوعية الدموية عن طريق تصور الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام صبغة FITC-dextran.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتلال الشبكية السكري (DR) هو واحد من أكثر المضاعفات الثانوية تعقيدا لمرض السكري. كما أنه السبب الرئيسي للعمى الذي يمكن الوقاية منه بين السكان في سن العمل في جميع أنحاء العالم. في تحليل تلوي حديث ل 32.4 مليون شخص كفيف ، كان 830،000 شخص (2.6٪) مكفوفين بسبب DR1. احتلت نسبة فقدان البصر المنسوبة إلى مرض السكري المرتبة السابعة في عام 2015 بنسبة 1.06٪ (0.15-2.38) على مستوى العالم2,3.

يتم تشخيص اعتلال الشبكية السكري عن طريق تشوهات الأوعية الدموية في أنسجة العين الخلفية. سريريا ، ينقسم إلى مرحلتين - DR غير التكاثري (NPDR) و DR التكاثري (PDR) ، بناء على الأوعية الدموية في شبكية العين. يعتبر ارتفاع السكر في الدم المنظم القوي ل DR لأنه ينطوي على العديد من المسارات المشاركة في التنكس العصبي4,5 والالتهاب 6,7 والأوعية الدموية الدقيقة8 في شبكية العين. تشمل المضاعفات الأيضية المتعددة الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم تراكم المنتجات النهائية المتقدمة للغليكاتيون (AGEs) ، ومسار البوليول ، ومسار الهيكسوسامين ، ومسار بروتين كيناز-سي. هذه المسارات مسؤولة عن تكاثر الخلايا (الخلايا البطانية) ، والهجرة (pericytes) ، وموت الخلايا المبرمج (خلايا الشبكية العصبية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا البطانية) بناء على مراحل مختلفة من اعتلال الشبكية السكري. يمكن أن تؤدي هذه التغيرات الأيضية إلى تغيرات فسيولوجية مثل انفصال الشبكية ، وفقدان خلايا الشبكية ، وانهيار حاجز الدم والشبكية (BRB) ، وتمدد الأوعية الدموية ، وتكوين الأوعية الدموية9.

مرض السكري من النوع 1 الناجم عن الستربتوزوتوسين (STZ) هو ممارسة راسخة ومقبولة جيدا في الفئران لتقييم التسبب في مرض السكري ومضاعفاته. ترجع الآثار السكرية ل STZ إلى التدمير الانتقائي لخلايا جزيرة البنكرياس β 10. ونتيجة لذلك ، ستخضع الحيوانات لنقص الأنسولين ، وارتفاع السكر في الدم ، و polydipsia ، و polyuria ، وكلها خصائص لمرض السكري من النوع 1 البشري11. بالنسبة لتحريض مرض السكري الحاد ، يتم إعطاء STZ عند 40-65 مجم / كجم من وزن الجسم عن طريق الوريد أو داخل الصفاق خلال مرحلة البلوغ. بعد حوالي 72 ساعة ، تقدم هذه الحيوانات مستويات الجلوكوز في الدم أكبر من 250 ملغ / ديسيلتر 10,12.

لفهم التغيرات الفسيولوجية في شبكية العين بسبب التنكس العصبي والالتهابات وتكوين الأوعية الدموية ، يجب تحسين التقنيات المختلفة في النماذج الحيوانية التجريبية. يمكن دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في خلايا الشبكية وأوعية الشبكية من خلال تقنيات مختلفة مثل علم الأنسجة وفحص انهيار BRB وتصوير الأوعية الفلورية.

يتضمن علم الأنسجة دراسة تشريح الخلايا والأنسجة والأعضاء على المستوى المجهري. وهو ينشئ علاقة بين بنية ووظيفة الخلايا / الأنسجة. يتم تنفيذ عدة خطوات لتصور وتحديد التغيرات المجهرية في بنية الأنسجة ، وبالتالي مقارنة النظراء الأصحاء والمريضين 13. وبالتالي ، من الضروري توحيد كل خطوة من خطوات علم الأنسجة بدقة. الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها علم أنسجة الشبكية هي تثبيت العينة ، وتقليم العينة ، والجفاف ، وإزالة ، والتشريب بالبارافين ، وتضمين البارافين ، والتقسيم ، والتلطيخ (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين) 13،14.

في شبكية العين السليمة ، يتم التحكم في نقل الجزيئات عبر شبكية العين بواسطة BRB ، الذي يتكون من الخلايا البطانية والخلايا المحيطة على الجانب الداخلي ، والخلايا الظهارية الصباغية الشبكية على الجانب الخارجي. ومع ذلك ، تبدأ الخلايا البطانية BRB الداخلية والخلايا المحيطة في التدهور أثناء الحالة المريضة ، كما أن BRB معرض للخطر أيضا15. بسبب هذا الانهيار BRB ، تتسرب العديد من جزيئات الوزن الجزيئي المنخفض إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية 16. مع تقدم المرض ، تتسرب العديد من جزيئات البروتين الأخرى (الوزن الجزيئي المنخفض والمرتفع) أيضا إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية بسبب اضطراب التوازن 17. يؤدي إلى مضاعفات أخرى مختلفة وفي نهاية المطاف وذمة بقعية وعمى. وبالتالي ، فإن تحديد مستويات البروتين في الجسم الزجاجي ومقارنة الحالات الصحية والسكري يضر بمقاييس BRB.

تصوير الأوعية الفلورية هو تقنية تستخدم لدراسة الدورة الدموية للشبكية والمشيمية باستخدام صبغة الفلورسنت. يتم استخدامه لتصور الأوعية الدموية في شبكية العين والمشيمية عن طريق حقن صبغة الفلوريسين عبر الوريد أو حقن القلب18. بمجرد حقن الصبغة ، تصل أولا إلى شرايين الشبكية ، تليها أوردة الشبكية. عادة ما يتم الانتهاء من هذا الدوران للصبغة في غضون 5 إلى 10 دقائق من حقن الصبغة19. إنها تقنية مهمة لتشخيص مختلف أمراض العين في الجزء الخلفي، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري والأوعية الدموية الجديدة المشيمية20. يساعد على اكتشاف التغيرات الرئيسية والثانوية في الأوعية الدموية في الحالات الطبيعية والمريضة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع هذا البروتوكول جميع إرشادات رعاية الحيوان التي تقدمها لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية ، BITS-Pilani ، حرم حيدر أباد.

1. أنسجة الشبكية

  1. استئصال العين وتثبيتها
    1. القتل الرحيم لفأر ويستار الذكر المصاب بالسكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع التحكم المطابق للعمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام جرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغ / كجم) عن طريق الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق.
    2. استئصال العين عن طريق إجراء شقوق باستخدام شفرة مشرط على المناطق الأنفية والصدغية من العين. ثم قطع على طول حوافها باستخدام ملقط ومقص صغير لإزالة العين من المقبس المداري.
      ملاحظة: قبل التضحية بالفئران ، حافظ على الحلول المثبتة جاهزة.
      تحذير: الفورمالديهايد يهيج الجلد والعين والأنف والجهاز التنفسي. يمكن أن يسبب أيضا السرطان لأنه محسس قوي للجلد. ارتد القفازات وتعامل معها تحت غطاء المحرك21.
    3. اغسل العين جيدا ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في طبق بتري لإزالة الدم. إزالة الدهون الزائدة المحيطة بالعين لسهولة اختراق المحلول المثبت.
    4. ضع العين على الفور في 5 مل من محلول التثبيت بمساعدة الملقط ، وتأكد من أنها ليست عالقة على جدران القوارير الزجاجية. حرك بلطف لبضع ثوان واستبدل الغطاء بوضع العلامات المناسبة. احتضان العين في محلول مثبت لمدة 24 إلى 48 ساعة في الظروف المظلمة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تقليم الأنسجة
    1. بعد التثبيت ، قم بإزالة العين من المحلول المثبت ، واغسلها ب 10 مل من PBS ، وضعها في طبق بتري يحتوي على 10 مل من PBS المبرد عند 4 درجات مئوية.
    2. باستخدام ملقط صغير ، امسك العين بالعصب البصري واصنع في pars plana بمساعدة مقص صغير. قطع من خلال كامل هامش القرنية لفصل الكوب الأمامي من العين. باستخدام الملقط ، اختر العدسة بلطف ، وتخلص منها ، واقطع العصب البصري.
    3. باستخدام مقص صغير منحني ، قم بعمل قسم طولي من كأس العين الخلفي ، يمر عبر القرص البصري ويقسمه إلى نصفين. ضعه في قاعدة الكاسيت وأغلق الغطاء بشكل صحيح دون أي إزعاج للأنسجة. قم بتسمية الكاسيت باسم عينة الأنسجة وتاريخها.
  3. الجفاف وإزالة وتشريب البارافين للأنسجة
    1. تجفيف الأنسجة المشذبة عن طريق النقل التدريجي في 80 مل من 50 ٪ ، 70 ٪ ، 90 ٪ ، و 100 ٪ من الإيثانول. أثناء نقل الكاسيت من تركيز إلى آخر ، تأكد من ربتها على ورق نظيف لتقليل التلوث.
      ملاحظة: اسمح للمنديل بالوقوف في كل عملية نقل لمدة 30 دقيقة (مرتين). إجمالي الوقت المستغرق لهذه الخطوة هو حوالي 4 ساعات.
    2. عند الجفاف ، انقل الكاسيت إلى 80 مل من الزيلين لمدة 30 دقيقة (مرتين) لاستبدال الإيثانول بالزيلين.
      ملاحظة: بعد الحضانة مع الزيلين ، يصبح النسيج شفافا.
      تحذير: الزيلين هو مركب عطري مع حلقة البنزين. يهيج العين والأغشية المخاطية وقد يسبب أيضا الاكتئاب.
    3. أخيرا ، قم بتشريب الأنسجة بالبارافين المسخن مسبقا عند 60 درجة مئوية ليحل محل الزيلين في الأنسجة. ضعي الكاسيت عدة مرات على المناديل الورقية لتقليل محتوى الزيلين وضعيه في 200 مل من البارافين (السائل عند 60 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة (1 ساعة × 2).
      تحذير: تجنب استنشاق البارافين المذاب ، لأنه ينتج قطرات دهنية صغيرة قد تسبب عدم الراحة في الجهاز التنفسي.
  4. تضمين البارافين
    1. قم بتشغيل آلة تضمين البارافين قبل 1 ساعة على الأقل من الاستخدام لإذابة البارافين ولكي تصل المحطات إلى درجات الحرارة المطلوبة. املأ قالبا فولاذيا بشمع البارافين المذاب عن طريق وضعه على سطح ساخن ، ثم قم بإزالة كاسيت واحد في كل مرة من حاوية البارافين.
    2. انقل القالب الفولاذي من سطح ساخن إلى سطح بارد (4 درجات مئوية). عند هذه النقطة ، سيبدأ الشمع الموجود في القالب في التصلب. قبل أن يتصلب تماما ، ضع الأنسجة في الشمع بمساعدة الملقط وقم بتوجيه الأنسجة بحيث يواجه جزء القرص البصري من الكوب الخلفي قاعدة القالب.
      ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة لا تتحرك والحفاظ على اتجاهها المطلوب. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فضع القالب مرة أخرى على سطح العمل الدافئ حتى تسييل البارافين بالكامل ، ثم ابدأ مرة أخرى بالخطوة 1.4.2.
    3. عندما يبدأ الشمع في القالب في التصلب ، ضع قاعدة الكاسيت على الفور فوق القالب. املأ القالب بعناية بالبارافين فوق الحافة العلوية للكاسيت وانقله ببطء إلى سطح بارد (بالقرب من -20 درجة مئوية) للتصلب السريع. حتى يتم تصلبه ، كرر العملية مع أشرطة الكاسيت الأخرى من الخطوة 1.4.2.
    4. بمجرد تصلب جميع القوالب ، افصل القالب الفولاذي عن الكاسيت. إذا كان الأمر صعبا ، فانتظر لفترة أطول قليلا وحاول مرة أخرى (لا تقم بإزالته بقوة). يصبح الفصل أسهل عند التصلب الكامل. الآن يصبح الكاسيت قاعدة كتلة البارافين التي سيتم الاحتفاظ بها أثناء التقسيم بواسطة microtome.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذه الكتلة في درجة حرارة الغرفة لمزيد من الاستخدام. في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف العملية واستمرارها لاحقا (إذا لزم الأمر).
  5. التقسيم
    1. قم بتثبيت شفرة ميكروتوم يمكن التخلص منها في حامل الشفرة. قم بإزالة شمع البارافين الزائد حول أشرطة الكاسيت بحيث تظل الأجزاء العلوية والسفلية من الكتل موازية للسكين. قم بتركيب الكتلة على حامل الكاسيت.
    2. افتح العجلة اليدوية لدفعها حتى يتلامس سطح الكتلة مع حافة السكين. قم بتقليم شمع البارافين الزائد على الكتلة حتى يتم تصور الأنسجة على سطح الكتلة. اضبط سمك القسم على 5 ميكرومتر وقم بقص شريط من خمسة إلى ستة أقسام.
    3. باستخدام الملقط ، انقل الشريط برفق إلى سطح الحمام المائي الدافئ مسبقا (حوالي 50 درجة مئوية) لكشف الشريط. اجمع المقاطع على شريحة زجاجية مغلفة بألبومين ماير عن طريق الضغط باستمرار على الشريحة أسفل القسم. ارفع الأقسام برفق واترك الشرائح تجف أفقيا طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة في صناديق جافة لعدة أشهر. في هذه الخطوة ، يمكن إيقاف العملية ومتابعتها لاحقا.
  6. تلطيخ
    1. سخني الشرائح ليتم تلطيخها في فرن الهواء الساخن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل استخدامها حتى يذوب البارافين ، واتبع الخطوات كما هو مذكور في الجدول 1.
      تحذير: تكون بقع الهيماتوكسيلين والإيوسين سامة عند استنشاقها أو تناولها. وقد أفيد بأنها مسرطنة.
الكاشفوقت الوقوفالتكرار (عدد المرات)
زيلين5 دقائق2
100٪ إيثانول5 دقائق2
90٪ إيثانول5 دقائق2
70٪ إيثانول5 دقائق2
50٪ إيثانول5 دقائق2
الماء5 دقائق2
هيماتوكسيلين4 دقائق1
غسل المياه
1٪ الكحول الحمضي في 70٪ الإيثانول30 ثانية1
غسل المياه
ماء سكوت1 دقيقة1
غسل المياه
50٪ إيثانول1 دقيقة1
95٪ إيثانول1 دقيقة1
0.25٪ أوزين5 ثانية1
غسل المياه
الماء2 دقيقة1
95٪ إيثانول1 دقيقة1
100٪ إيثانول1 دقيقة1
زيلين5 دقائق2
حامل وغطاء

الجدول 1. إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين

2. فحص انهيار الحاجز الدموي الدماغي

  1. تجمع الدم والجسم الزجاجي
    1. تخدير فأر ويستار الذكر المصاب بالسكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع التحكم المطابق للعمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام الكيتامين (80 ملغ / كغ) و xylazine (8 ملغ / كغ). تأكد من حالة التخدير عن طريق سحب الدواسة المنعكس (قرصة إصبع القدم). جمع على الفور 1 مل من الدم عن طريق ثقب القلب في أنبوب مغلفة حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) لفصل البلازما عن الدم الكامل.
    2. القتل الرحيم للفئران باستخدام جرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغم / كغ) ، عن طريق الحقن من خلال الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق. قم باستئصال العين ووضعها على الفور على الثلج الجاف.
    3. ضع العين في طبق بتري نظيف فوق الثلج الجاف (مستحسن) وابدأ في تشريح العين كما هو مذكور في الخطوة 1.2.2.
    4. قم بإزالة العدسة، واسحب الجسم الزجاجي بعناية من الكوب الخلفي باستخدام ملقط صغير وضعه في أنبوب تجانس يحتوي على ثلاث إلى أربع حبات زجاجية (2-4 مم).
      ملاحظة: يوصى بالتشريح على الثلج الجاف لأن إزالة العدسة والجسم الزجاجي أسهل في ظل ظروف التجميد.
  2. إعداد العينات
    1. تجانس الفكاهة الزجاجية في مجانس الخرز بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوان.
    2. نقل عينات الدم (1 مل) والجسم الزجاجي (10-20 ميكرولتر) إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي على حد سواء العينات عند 5200 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: في حالة التجانس الناجح ، يكون للزجاج اتساق موحد بعد الطرد المركزي. ومع ذلك ، في حالة الاتساق غير المنتظم للزجاج ، كرر من الخطوة 2.2.1 مع زيادة وقت التجانس.
    3. جمع supernatant من كلتا العينتين ، وتخفيف الفكاهة الزجاجية وعينات البلازما بنسبة 1: 10 و 1: 20 ، على التوالي ، مع PBS.
  3. القياس الكمي للبروتين ونسبة بروتين البلازما الزجاجية
    1. لقياس تركيز البروتين في عينات الفكاهة والبلازما الزجاجية ، أضف 5 ميكرولتر من العينات المخففة إلى 250 ميكرولتر من كاشف برادفورد ، واخلطها جيدا ، واقرأ الامتصاص عند 590 نانومتر في غضون 40 دقيقة.
      ملاحظة: إذا كانت قيمة امتصاص العينات أعلى من 1.0، فقم بتخفيف العينات بشكل أكبر وكرر الإجراء من الخطوة 2.2.3.
    2. تطبيع مستوى البروتين الزجاجي إلى مستوى بروتين البلازما من نفس الفئران وقياس الفرق بين الفئران الصحية مقابل الفئران السكرية.

3. تصوير الأوعية الدموية الفلورية

  1. FITC-dextran70000 حقن صبغة
    1. تخدير الفئران الذكور ويستار السكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع السيطرة المتطابقة مع العمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام 3 ٪ من الايزوفلوران وتأكيد رد فعل انسحاب دواسة (قرصة إصبع القدم). اغمس الذيل في كوب يحتوي على ماء دافئ (37-40 درجة مئوية). نظف الذيل بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل حقن الصبغة. حدد موقع الوريد الجانبي للذيل وحدد موضع الحقن في الجزء السفلي من الذيل.
      ملاحظة: في حالة فشل إدخال الإبرة، حاول الإدراج في موقع آخر أعلى الموضع الحالي (طرف إلى قاعدة الذيل). ومع ذلك ، ينصح بالحقن مرة واحدة لأن الوخز المتكرر قد يؤدي إلى تطور الإجهاد في الفئران ، مما قد يسبب تضيق الأوعية.
    2. حقن 1 مل من محلول صبغة FITC-dextran70000 50 ملغم/مل من خلال الوريد الذيل واسمح للصبغة بالدوران لمدة 5 دقائق. القتل الرحيم للفئران بجرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغ / كغ) ، عن طريق الحقن من خلال الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق. استئصال العين كما هو مذكور في الخطوة 1.1.1.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تثبيت العين في محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ ، لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
  2. إعداد جبل مسطح
    1. لإعداد حوامل مسطحة ، حافظ على أدوات التشريح جاهزة مع الشرائح والأغطية. ضع العين في طبق بتري مملوء ب PBS المبرد وابدأ في تشريح العين كما هو مذكور في الخطوة 1.2.2.
    2. الآن ضع طرف ملقط مدبب بين الصلبة والشبكية. حركها برفق على طول حافة الكوب ، مع التأكد من عدم ربط شبكية العين بالصلبة في أي وقت. إذا كان هناك أي عائق ، فقم بقطع هذا الجزء ببطء على طول الحافة باستخدام مقص صغير منحني.
    3. بمجرد التأكد من أن شبكية العين غير متصلة بالصلبة من أي جانب ، يتم قطعها بالقرب من القرص البصري ، مما يجعل ثقبا صغيرا بحيث تنفصل الشبكية تماما عن الصلبة. ادفع شبكية العين ببطء إلى محلول PBS وضعها على شريحة مسطحة نظيفة بمساعدة ملعقة أو ملقط.
    4. باستخدام مقص دقيق أو شفرات مشرط ، قم بإجراء جروح طفيفة في أنسجة الشبكية ، وتقسيمها إلى أربعة أرباع. تأكد من أن الجروح على بعد 2 مم على الأقل من الثقب الذي تركه القرص البصري في المركز ، كما هو موضح في الشكل 1.
    5. قم بإزالة PBS الزائد من جوانب الأنسجة باستخدام أطراف 0.2 مل دون إزعاج الحامل المسطح.
    6. ضع قطرة من وسط التركيب المضاد للتلاشي (50 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر) على حامل مسطح ، وقم بتغطيته بغطاء ، وتصور على الفور تحت المجهر البؤري.
      ملاحظة: حافظ على الحد الأدنى من الضوء أثناء الإجراء بأكمله.
  3. تصور جبل مسطح
    1. تصور الحامل المسطح تحت هدف 10x للمجهر البؤري. قم بإجراء مسح ضوئي للتجانب لالتقاط الحامل المسطح بالكامل كصورة واحدة. يعتمد عدد البلاط على حجم الحامل المسطح للشبكية. أيضا ، قم بإجراء تكديس Z لتصور الأوردة والشرايين في بؤر مختلفة (الحجم المفضل ل Z-stack هو 5 ميكرومتر ، اعتمادا على أي منها ، يختلف عدد خطوات Z-stack).
    2. استخدم كاشف PMT و HyD بنسبة ربح 700-900 و 100-150 ، على التوالي. اختر نطاق الانبعاثات بين 510-530 نانومتر لصبغة FITC-dextran.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنسجة الشبكية
في شبكية العين السكرية ، تخضع خلايا الشبكية للتنكس. بالإضافة إلى ذلك ، يزداد سمك طبقات الشبكية بسبب الوذمة 22. يمكن استخدام الصور التي تم الحصول عليها بعد تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين لعدد الخلايا وقياس سمك الطبقات المختلفة ، كما هو موضح في الشكل 2 باستخدام ImageJ.

فحص انهيار الحاجز الدموي الشبكي
نظرا لأن BRB يتعرض للخطر في الفئران المصابة بالسكري ، يصبح التسرب بارزا ، مما يؤدي إلى ترا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علم الأنسجة
يتم إجراء علم الأنسجة الشبكية لتصور التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية وطبقاتها. يجب تحسين العديد من الخطوات ، بما في ذلك اختيار الحل المثبت ، ومدة التثبيت ، والجفاف ، وتشريب البارافين. يجب ألا يتجاوز حجم الأنسجة 3 مم ، حيث يصبح الاختراق المثبت بطيئا. يؤدي البارفورمالديهايد الشائع الاستخدام بنسبة 4٪ إلى انفصال الشبكية حتى في العين السليمة بسبب الأسمولية العالية نسبيا للمحلول مقارنة بالفكاهة المائية والفكاهة الزجاجية ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة23. الأسمولية ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن ينوه بالمجلس الهندي للبحوث الطبية (ICMR; ITR-2020-2882) لتمويل الدعم المقدم إلى الدكتور نيرمال ج. نود أيضا أن نشكر منحة الجامعة للجنة على توفير زمالة بحثية مبتدئة لمانيشا مالاني ومرفق المختبرات التحليلية المركزي ، BITS-Pilani ، حرم حيدر أباد لتوفير مرافق البنية التحتية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > الأنسجة < / قوي >
< قوي > الكواشف < / قوي >
إيزوفلورانأبوتعامل تخدير
الكيتامين هيدروكلوريدترويكا المستحضرات الصيدلانيةالتخدير
زيلازينالهندي المناعي المحدودعامل التخدير
خماسي باربيتال الصوديومZora Pharmaعامل القتل الرحيم
محلول مثبت (1٪ فورمالديهايد ، 1.25٪ جلوتارالديهايدهايميديا ، AvraMB059 ، ASG2529محضر داخليا
الإيثانولهايمانF204325الجفاف
زيلينهايميدياMB-180تطهير الإيثانول أو شمع
البارافينهاي ميدياGRM10702تستخدم لتضمين الأنسجة
GlycerolHiMediaTC503لإعداد شرائح المغلفة بالألبومين. يتم خلط الجلسرين وألبومين البيض بنسبة 1: 1 للطلاء على الشرائح
حمض الهيدروكلوريكمختبرات أبحاث سيسكو Pvt. المحدودة.65955لتحضير 1٪ كحول حمضي
حمض الخليكHiMediaAS119لتحضير
ماء يوزين سكوتسلايكا3802900كاشف أزرق
محلول بابانيكولاو 1b محلول هيماتوكسيلينسيجما1.09254.0500تلطيخ النوى
EosinHiMediaGRM115تلطيخ السيتوبلازم ، تم تحضير محلول 0.25٪ في المنزل
DPX Mountant mediaSigma6522تصور وحماية أقسام الشبكية
< قوية > المعدات < / قوية >
الأواني الزجاجيةملقط القرنية بوروسيل
ستيفنز إنسترومنتسS5-1200تشريح
كوليبري ملقطستيفنز إنسترومنتسS5-1135تشريح
مقص صغير منحنيستيفنز إنسترومنتسS7-1311تشريح
فاناس مقصستيفنز إنسترومنتسS7-1387تشريح
قزحية مقصستيفنز إنسترومنتسS7-1015كاسيت التشريح
هايميدياPW1292لعقد الأنسجة أثناء معالجة الأنسجة
حمام مائيGT سونيكGT Sonic-D9محطة تضمين البارافين لصيانة درجة الحرارة
MyrEC 350تحضير كتل البارافين
MicrotomeZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co.، Ltd.YD-335Aشفرات التقسيم
لايكالايكا 818التقسيم
HiMediaBG005عقد أقسام أنسجة البارافين
أغطيةHiMediaBG014Cلتغطية الأنسجة بعد إضافة وسائط
التثبيت <قوية> انهيار حاجز الشبكية الدم< قوي>
<قوي>الكواشف
إيزوفلورانأبوتB506التخدير
الثلج الجافغير قابل للتطبيقغير قابل للتطبيقتشريح
كاشف برادفوردسيجماB6916القياس الكمي للبروتين
<قوي> المعدات< / قوي>
ملقط القرنيةستيفنز إنسترومنتسS5-1200تشريح
Colibri ملقطStephens InstrumentsS5-1135تشريح
مقص صغير منحنيStephens InstrumentsS7-1311تشريح
مقص VannasStephens InstrumentsS7-1387تشريح
مقص القزحيةStephens InstrumentsS7-1015تشريح
الأواني الزجاجيةBorosilغير قابل للتطبيق
أنابيب مطلية ب EDTAتشخيص JKغير قابل للتطبيقفصل البلازما عن الدم الكامل
أنابيب التجانسMP Biomedicalsرمز المنتج: 115076200-CFتجانس أغطية التجانس الزجاجية
MP Biomedicalsرمز المنتج: 115063002-CFتجانس الخرز
الزجاجيMP Biomedicalsرمز المنتج: 116914801تجانس الجسم الزجاجي
أدوات HomogeniserBertinP000673-MLYS0-Aتجانس الصفيحة الزجاجية
96 بئر -GrenierGN655101الشفاف الكمي للبروتين
قارئ الألواحالأجهزة الجزيئيةSpectrMax M4قياس الامتصاص
الطرد المركزيREMICPR240 Plusالطرد المركزي
< قوي > تصوير الأوعية الفلورية< / قوي >
< قوي > كواشف < / قوي >
إيزوفلورانأبوتB506التخدير
FITC-dextern 70 كيلو دالتون (FITC ، ديكستران ، ديبوتيلين ديلورات ، DMSOFITC ، ديكستران وديبوتيلين ديلورات من سيجما ؛ DMSO من HiMediaFITC-F3651 ، Dextran-31390 ، Dibutylin dilaurate -29123 ، DMSO-TC185محضر داخليا
FluoroshiedSigmaF6182مضاد للبهتان متوسط
التركيب < قوي > المعدات < / قوي >
ملقط القرنيةستيفنز إنسترومنتسS5-1200تشريح
كوليبري ملقطستيفنز إنسترومنتسS5-1135تشريح
مقص صغير منحنيستيفنز إنسترومنتسS7-1311تشريح
فاناس مقصستيفنز إنسترومنتسS7-1387تشريح
قزحية مقصستيفنز إنسترومنتسS7-1015تشريح
الأواني الزجاجيةبوروسيلغير قابل للتطبيق
شرائحهاي ميدياBG005إعداد Flatmount
CoverslipsHiMediaBG014Cلتغطية الأنسجة بعد إضافة وسائط التركيب
المجهر متحد البؤرLeicaDMi8تصور التثبيت المسطح
عامل شرائح جهاز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
  2. Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
  3. Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
  4. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
  5. El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
  6. Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81(1991).
  7. Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
  8. Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
  9. Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816(2018).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
  11. Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
  12. Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
  13. Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
  14. Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
  15. Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
  16. do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
  17. Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
  18. D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  19. Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
  20. Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
  21. Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
  22. Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
  23. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
  24. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  25. Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
  26. Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795(2011).
  27. D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  28. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Diabetic RetinopathyRetinal PathophysiologyRat ModelBlood Retinal BarrierRetinal HistologyFluorescence AngiographyRetinal Cell CountRetinal Flat MountProtein Leakage AssayRetinal Angiogenesis

Related Articles