تم استخدام ذباب ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر البالغة على نطاق واسع ككائنات حية نموذجية للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاستجابات المناعية الفطرية المضادة للميكروبات المضيفة واستراتيجيات العدوى الميكروبية. لتعزيز مرحلة يرقة D. melanogaster كنظام نموذج إضافي أو بديل ، يتم وصف تقنية حقن اليرقات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر بروتوكول حقن اليرقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر استخدام النماذج غير التقليدية لدراسة المناعة الفطرية وضراوة مسببات الأمراض بديلا قيما لنماذج الثدييات ، والتي يمكن أن تكون مكلفة وتثير قضايا أخلاقية. النماذج غير التقليدية رخيصة الثمن ، وسهلة التعامل معها وثقافتها ، ولا تأخذ مساحة كبيرة. فهي قابلة للتعديل وراثيا وتمتلك تسلسلات جينوم كاملة ، ولا يمثل استخدامها أي اعتبارات أخلاقية. على سبيل المثال ، قدمت ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر رؤى رائعة في مجموعة متنوعة من أبحاث السلوك والتنمية والتمثيل الغذائي والمناعة. وبشكل أكثر تحديدا ، تمتلك الذباب واليرقات البالغة D. melanogaster العديد من ردود الفعل الدفاعية الفطرية التي يتم مشاركتها مع الحيوانات الفقارية. تم الكشف عن الآليات التي تنظم الاستجابات المناعية في الغالب من خلال الدراسات الجينية والجزيئية في نموذج D. melanogaster. هنا يتم توفير تقنية جديدة لحقن اليرقات ، والتي ستعزز التحقيقات في العمليات المناعية الفطرية في يرقات D. melanogaster واستكشاف التسبب في مجموعة واسعة من الالتهابات الميكروبية.
المقدمة
تم استخدام ذبابة الفاكهة بشكل كبير في البحوث البيولوجية والطبية الحيوية لعدة عقود ، حيث تطورت المجموعة المتطورة من الأدوات الوراثية والجزيئية بشكل مطرد لتحليل مجموعة واسعة من الدراسات 1،2،3،4. جعلت جوانب التنمية والتوازن والمناعة الفطرية المحفوظة تطوريا في D. melanogaster من كائن حي نموذجي قيم لدراسة مختلف الأمراض البشرية والحشرية5,6. ومن الجدير بالذكر أن الدور الأساسي لنموذج D. melanogaster لدراسة المناعة قد تجسد إلى حد كبير في دراسات الذباب البالغ. ومع ذل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تربية الذباب
ملاحظة: تنقسم دورة حياة D. melanogaster إلى أربع مراحل: الجنين واليرقة والخادرة والبالغين. وقت التوليد مع ظروف التربية المثلى في المختبر (~ 25 درجة مئوية ، رطوبة 60٪ ، وطعام كاف) هو حوالي 10 أيام من البويضة المخصبة إلى البالغين المغلقين. تضع الإناث حوالي 100 جنين يوميا ، ويستمر تكوين الأجنة حوالي 24 h22. تخضع اليرقات لثلاث مراحل تنموية (instars; L1-L3) في ~ 4 أيام (L1 و L2: 24 ساعة ، و L3: 48 ساعة). تبدأ يرقات instar الأولى في التغذية على الفور على سطح الوسط. تحفر يرقات instar الثانية في الوسط ، في حين أن يرقات instar الثالثة تترك الوسط وتتجول في جدران القارورة ، وتبحث عن مكان ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عندما يتم تنفيذها بشكل صحيح ، تظهر حقن يرقات D. melanogaster تأثيرا خاصا بالبكتيريا. تم جمع بيانات البقاء على قيد الحياة في عدة نقاط زمنية بعد الإصابة ب P. asymbiotica (سلالة ATCC43943) ، E. coli (سلالة K12) ، و PBS (الشكل 4). في حين أن يرقات D. melanogaster عرضة ل P. asymbiotica ، مما يعرض البقاء على قيد الحياة للخطر بسرعة ، فإن اليرقات المحقونة بعناصر تحكم E. coli أو PBS تظهر بقاء طويل الأمد24،2.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعد ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر من بين النماذج الأكثر قيمة والتي تم التلاعب بها تجريبيا والمستخدمة في التحقيقات في المناعة الفطرية والتسبب في العدوى الميكروبية المختلفة. ويرجع ذلك إلى دورة حياتها البسيطة والسريعة ، والصيانة البسيطة في المختبر ، وعلم الوراثة التطوري الراسخ ، وصندوق الأدوات الوراثية المتنوعة. تتطلب الطرق السابقة لحقن يرقات D. melanogaster ، مثل استخدام جهاز microfluidic هجين أو Narishige micromanipulator ، معدات عالية التخصص ويمكن أن تكون مكلفة21,27.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء قسم العلوم البيولوجية في جامعة جورج واشنطن (GWU) على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم GT من خلال زمالة Harlan الصيفية من GWU. تم إجراء جميع الأشكال الرسومية باستخدام BioRender.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فلاي فود ب (وصفة بلومنجتون) | LabExpress | 7001-NV | Food B ، في قوارير ضيقة ، 100 قارورة / صينية |
| 100 × 15 ، أطباق بتري أحادية قابلة للتكديس بالكامل | VWR | 25384-342 | قطر 100 × 15 مم |
| 60 × 15 ، أطباق أحادية بتري قابلة للتكديس | بالكامل VWR | 25384-092 | قطر 60 × 15 مم |
| شعيرات دموية زجاجية | VWR | 53440-186 | |
| الصف 1 ورق ترشيح نوعي الصف القياسي ، دائرة | VWR | 28450-150 | قطر 150 مم |
| ثقافة المختبر من الدرجة الثانية نوع A2 خزانة سلامة السلامة الحيوية | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB مسحوق ميلر أجار 500 جرام |
| مرق | فيشر العلمي | BP1426-500 | رطل مسحوق ميلر مرق 500 جرام |
| زيت | معدنيAlfa Aesar ، Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000 / 2000c مقياس الطيف الضوئي | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III حاقن نانولتر قابل للبرمجة | Drummond | 3-000-207 | |
| قوارير ذبابة الفاكهة الضيقة ، إبر البوليسترين | جينيسي العلمية | 32-109 | |
| ، تحت الجلد | VWR | 89219-316 | 22 جم ، 25 مم |
| الجيل التالي من مجتذب الماصات | الدقيقة العالمية أدوات الدقة | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | أقراص العازلة PBS التكنولوجيا الحيوية الصف 200tab |
| Prism | GraphPad | الإصدار 8 | |
| المحاقن - البلاستيك ، يمكن التخلص | منه VWR | 76124-652 | 20 مل |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
المراجع
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ame....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
