تسمح المنصة المحسنة لزراعة الأجنة بأكملها بالتطور المستمر والقوي خارج الرحم لأجنة الفئران بعد الزرع لمدة تصل إلى ستة أيام ، من مراحل ما قبل المعدة حتى التكوين العضوي المتقدم. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل الإجراء القياسي لزراعة الأجنة الناجحة باستخدام لوحات ثابتة وأنظمة زجاجات دوارة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خارج الرحم زراعة أجنة الفئران من ما قبل المعدة إلى التكوين العضوي المتقدم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كانت طرق زراعة أجنة الثدييات بعد الزرع غير فعالة بشكل عام وتقتصر على فترات قصيرة بعد تشريح الرحم. تم تطوير منصات مؤخرا لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم القوية والمطولة للغاية من مراحل أسطوانة البيض حتى التكوين العضوي المتقدم. تتيح هذه المنصات التطور المناسب والأمين للأجنة قبل المعدة (E5.5) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (E11). تزرع الأجنة المتأخرة في المعدة (E7.5) في زجاجات دوارة في هذه الإعدادات ، في حين أن الثقافة الموسعة من مراحل ما قبل المعدة (E5.5 أو E6.5) تتطلب مزيجا من مزارع الزجاجات الثابتة والدوارة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التنظيم الحساس لتركيز O2 و CO2 ، وضغط الغاز ، ومستويات الجلوكوز ، واستخدام وسط معين خارج الرحم أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين السليم. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم الموسعة. تمثل القدرة على نمو أجنة الفئران الطبيعية خارج الرحم من المعدة إلى التكوين العضوي أداة قيمة لتوصيف تأثير الاضطرابات التجريبية المختلفة أثناء التطور الجنيني.
المقدمة
وقد حد التطور داخل الرحم لجنين الثدييات من دراسة المراحل المبكرة من تطور ما بعد الزرع1,2. إن عدم إمكانية الوصول إلى الجنين النامي يعيق فهم العمليات التنموية الرئيسية التي تحدث بعد زرع الجنين في الرحم ، مثل إنشاء خطة جسم الحيوان ، أو مواصفات الطبقات الجرثومية ، أو تكوين الأنسجة والأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن الحجم الصغير جدا للجنين المبكر بعد الزرع يجعل من الصعب ملاحظته عن طريق التصوير داخل الجسم في الرحم قبل E103. إن عدم القدرة على مراقبة الأجنة الحية ومعالجتها في هذه المراحل قد حد من دراسة التكوين المبكر للأجنة بعد الزرع إلى لقطات أثناء النمو.
بروتوكولات الاستزراع المختبري لأجنة الثدييات قبل الزرع راسخة وموثوقة وتستخدم بانتظام4. ومع ذلك، فإن محاولات إنشاء أنظمة استزراع خارج الرحم قادرة على دعم نمو جنين الثدييات السليم بعد الزرع حققت نجاحا محدودا5. تم اقتراح مجموعة متنوعة من تقنيات الاستزراع لأكثر من قرن من الزمان ، وذلك أساسا عن طريق زراعة الأجنة في لوحات ثابتة تقليدية 6،7،8 أو زجاجات دوارة (مزارع الأسطوانة) 5،9،10. أثبتت هذه المنصات فائدتها في توسيع المعرفة حول تطور الثدييات بعد الزرع11،12 ، على الرغم من كونها غير فعالة للغاية لبقاء الجنين الطبيعي وتقتصر على فترات قصيرة. بدأت الأجنة في إظهار التخلف التنموي والشذوذ المورفولوجي في وقت مبكر من 24-48 ساعة بعد بدء الثقافة.
تقدم هذه الدراسة وصفا مفصلا لإعداد نظام زراعة الأجنة خارج الرحم الذي يسمح بالتطور المستمر من مرحلة ما قبل المعدة إلى مراحل التكوين العضوي المتقدمة على مدى ما يصل إلى ستة أيام من تطور ما بعد الزرع13. تصف هذه الورقة بروتوكول زراعة الأسطوانة المحسن الذي يدعم نمو أجنة E7.5 (الصفيحة العصبية ومرحلة طي الرأس) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (~ E11) والثقافة الموسعة من E5.5 / E6.5 من خلال الجمع بين الثقافة على لوحات ثابتة ومنصات زراعة الأسطوانة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لإرشادات حماية الحيوان الصادرة عن معهد وايزمان للعلوم والمعتمدة من قبل معهد وايزمان ذي الصلة IACUC (# 01390120-1 ، 01330120-2 ، 33520117-2). طلب من النساء الحوامل الأصحاء إعطاء موافقتهن المستنيرة على جمع الدم من الحبل السري، على النحو الذي وافقت عليه لجنة هلسنكي في مركز رامبام الطبي (#RMB-0452-15). طلب من البالغين الأصحاء موافقتهم المستنيرة على جمع الدم وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة هلسنكي التابعة لمعهد وايزمان للعلوم (#1566-3).
1. الإعداد الإعلامي
- تحضير وسط التشريح باستخدام 500 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) بدون الفينول الأحمر والجلوتامين L ، مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنيني ، 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين ، وتصفية التعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: حافظ على وسط التشريح عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. - تحضير وسط زراعة الأجنة خارج الرحم (EUCM) طازجا كل يوم زراعة داخل غطاء بيولوجي باستخدام 25٪ من الوسط الجنيني بالإضافة إلى 50٪ من مصل الفئران و 25٪ من مصل دم الحبل السري البشري (HCS) أو مصل دم البالغين البشري (HBS).
- لتحضير الوسط الجنيني ، أضف 5 مل من الجلوتامين ، و 5 مل من HEPES ، و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين في 500 مل من DMEM بدون الفينول الأحمر و L-glutamine. تحضير 10-15 مل aliquots وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
ملاحظة: ضاعف تركيز المضادات الحيوية إذا تعرضت لأي تلوث. - قم بتعطيل مصل الفئران بالحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة وقم بالتصفية من خلال مرشح ثنائي فلوريد البولي فينيليدين 0.22 ميكرومتر. استخدم المصل للثقافة في نفس يوم التعطيل. قم بإذابة HCS أو HBS واستخدمه على الفور للتجارب.
ملاحظة: يوفر مصل الفئران التجاري نتائج متسقة (تم اختبار ما لا يقل عن 4 لوت دون اختلاف واضح). بدلا من ذلك ، يمكن الحصول على مصل الفئران عالي الجودة في المنزل كما هو موضح سابقا8,14. إذا لم يكن HCS متوفرا ، فاستبدله ب HBS الذي تم جمعه داخليا. يمكن إعادة تجميد مصل الفئران و HCS و HBS مرة واحدة والاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها في يوم مختلف. قم بإذابة المصل المعاد تجميده ودمجه مع كمية أكبر من المصل المذاب حديثا ولا تقم بإعادة تجميده.
2. جمع مصل دم الحبل السري البشري ومصل دم البالغين البشري
- لعزل HCS ، قم بجمع دم الحبل السري من النساء الحوامل الأصحاء في يوم الولادة القيصرية المقررة.
- قم بتثبيت الحبل السري مرتين على بعد 5-7 سم من السرة وانقلها بين المشابك مباشرة بعد ولادة الرضيع.
- اسحب الدم يدويا باستخدام إبرة كبيرة التجويف 14 جم ومحقنة سعة 50 مل مباشرة من الوريد السري بينما تبقى المشيمة في الموقع لتجنب أي آثار لانحلال الدم.
ملاحظة: جمع الدم بعد إزالة الرضيع من مجال الجراحة، وتم سحب الدم السري للاختبارات السريرية.
- قم بتوزيع الدم الذي تم جمعه على أنابيب اختبار معقمة متخثر سعة 5 مل ونقلها على الفور إلى 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بالتخثر الكامل. قم بالطرد المركزي لأنابيب الاختبار المتخثرة عند 2500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من الأنابيب التي تظهر عليها علامات انحلال الدم (المصل الوردي-الأحمر). جمع المصل (اللون الأصفر) باستخدام ماصة 5 مل وتصفيتها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتسخين المصل على الفور في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- تحضير 1-1.5 مل من الأليكوتات من المصل المعطل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. إذا لزم الأمر، اشحن على حرارة -70 درجة مئوية باستخدام الثلج الجاف.
- لجمع مصل الدم البشري للبالغين، اسحب الدم من البالغين الأصحاء واعزل المصل على الفور باتباع نفس البروتوكول الموصوف لمصل دم الحبل السري. قم بتخزين HBS كأليكوتات معطلة بالحرارة ومصفاة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
ملاحظة: أعطى مصل الحبل السري البشري والمصل البشري البالغ الذي تم إعداده طازجا في المنزل نتائج متفوقة على المصل المتاح تجاريا. جمع HCS من النساء الأصحاء ، فوق سن 18 وأقل من 40 عاما المقرر للولادة القيصرية. استبعاد النساء اللواتي ولدن مهبليا والنساء المصابات بأي مرض مزمن أو حالات طبية نشطة، بما في ذلك سكري الحمل أو ارتفاع ضغط الدم.
3. زراعة الأسطوانة خارج الرحم للأجنة من E7.5 إلى E11
- إعداد حاضنة زراعة الأسطوانة ومنظم الغاز
- زراعة E7.5 أو أجنة أكثر تقدما باستخدام نظام حاضنة زراعة الأسطوانة. قم بتشغيل الدوار ووحدة التسخين عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل تشريح الجنين. أضف الماء المعقم إلى زجاجة مدخل الغاز وأنبوب اختبار المخرج.
ملاحظة: ضع ميزان حرارة بجوار الأسطوانة الدوارة وتحقق بشكل متكرر من استقرار درجة الحرارة داخل الحاضنة. افتح الحاضنة في أسرع وقت ممكن لأن وقت الفتح المطول سيزيد من درجة الحرارة ويؤثر على نمو الجنين. عند الضرورة ، أضف المزيد من المياه المعقمة إلى زجاجة مدخل الغاز وأنبوب اختبار المخرج للحفاظ عليها إلى الحد الأدنى من نصف السعة أثناء الزرع. حماية الأجنة داخل الحاضنة من الضوء عن طريق تغطية الحاضنة بقطعة قماش. - قم بتشغيل وحدة منظم الغاز عن طريق الضغط على المفتاح الرئيسي ثم تشغيل وحدات التحكم في الأكسجين / النيتروجين و CO2 (الشكل 1A). اضبط قيم الأكسجين و CO2 على 5٪ باستخدام وحدات التحكم المعنية. افتح منظم الغاز واضبط ضغط الغاز على ~ 6.5-7 رطل لكل بوصة مربعة (رطل لكل بوصة مربعة) عن طريق تحريك مفتاح الجهد في جهاز إرسال الضغط (الشكل 1B). تأكد من قيمة ضغط الغاز باستخدام مقياس ضغط رقمي.
- راقب تدفق الغاز عن طريق التحقق من معدل الفقاعات التي تم إنشاؤها داخل أنبوب الاختبار المملوء بالماء المخصص داخل الحاضنة الدقيقة. اضبط معدل الفقاعة المناسب عن طريق إغلاق / فتح صمام تدفق الغاز على غطاء زجاجة المياه. تأكد من أن تدفق الغاز يسمح بتكوين فقاعات بمعدل 2-4 فقاعات في الثانية أو اضبط تدفق الفقاعة عند النقطة الأولى حيث تخرج الفقاعات إلى أنبوب المخرج المملوء بالماء.
- املأ زجاجات الاستزراع ب 2 مل من وسط الاستزراع وقم بتوصيلها بالأسطوانة الدوارة المجوفة للتوازن المسبق لمدة 1 ساعة. استخدم بنج السيليكون المجوف لإغلاق الزجاجات على الأسطوانة. حافظ على إغلاق المساحات الفارغة في الأسطوانة الدوارة باستخدام الكتل الصلبة.
ملاحظة: قد يؤثر عدم وجود فقاعات في أنبوب المخرج (لا يوجد غاز قادم عبر النظام) أو تدفق غاز مرتفع بشكل استثنائي على نمو الجنين. في حالة عدم وجود تدفق فقاعة إلى أنبوب اختبار المخرج ، تحقق من وضع جميع بنجات السيليكون بشكل صحيح في الأسطوانة الدوارة وختم النظام ، وتحقق من إغلاق زجاجة المياه بشكل صحيح وتوصيل جميع الأنابيب بشكل صحيح. قد يشير عدم وجود فقاعات قادمة إلى زجاجة المياه إلى وجود خلل في منظم الغاز.
- زراعة E7.5 أو أجنة أكثر تقدما باستخدام نظام حاضنة زراعة الأسطوانة. قم بتشغيل الدوار ووحدة التسخين عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل تشريح الجنين. أضف الماء المعقم إلى زجاجة مدخل الغاز وأنبوب اختبار المخرج.
- تشريح أجنة الفئران من الفئران الحامل
- قم بموازنة وسط التشريح داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة لا تقل عن 1 ساعة. اترك الغطاء مفتوحا قليلا للسماح بتبادل الغازات.
- التضحية بالأنثى الحامل عن طريق خلع عنق الرحم ، وتنظيف بطن الأنثى بنسبة 70 ٪ من الإيثانول ، وقطع الجلد وجدار البطن بالمقص. حدد أحد طرفي الرحم وقطعه عند التقاطع بين المبيض والرحم. بعد ذلك ، قم بقطع الرحم حتى الطرف الآخر وانقله إلى طبق بتري 100 مم مملوء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) في درجة حرارة الغرفة من Dulbecco.
ملاحظة: يوصى باستخدام الإناث غير المحضرة للهرمونات والمتزوجة بشكل طبيعي. - اغسل المفاهيم بسرعة في DPBS وقطعها إلى أزواج لتسهيل التعامل مع الأجنة. انقل جميع أزواج المفاهيم إلى وسط تشريح متوازن مسبقا في طبق بتري 60 مم وقطعه إلى مفاهيم فرديةالاستخدامات.
- إزالة جدار الرحم من المفهوميستخدم عن طريق تمزيق أنسجة الرحم باستخدام زوج من الملقط الإجمالي. استخدم ملقط الجراحة المجهرية الدقيقة لقطع طرف الديسيدوا على شكل كمثرى. أدخل الملقط بجوار الجنين الموازي لمحوره الطويل ، وافتح الملقط لتقسيم الديسيدوا إلى نصفين.
- وأخيرا، اترك المخروط المشيمي الخارجي السليم متصلا بأسطوانة البيض عن طريق الإمساك بالجنين من الديسيدوا وتقشير كيس الصفار الجداري من الجنين باستخدام ملقط ناعم.
ملاحظة: لتجنب التأثير على الجنين ، قم بإجراء تشريح على مجهر مجهز بلوحة تسخين عند 37 درجة مئوية في غضون 30-40 دقيقة كحد أقصى. تشريح فضلات واحدة من الأجنة في وقت واحد. - مباشرة بعد التشريح ، انقل الأجنة إلى صفيحة جديدة مليئة بوسط تشريح متوازن باستخدام ماصة باستور الزجاجية لمنع الأجنة من الالتصاق بحطام الأنسجة.
- حدد تلك الأجنة في الصفيحة العصبية / مرحلة طي الرأس المبكرة التي لا تظهر أي ضرر في الأرومة ونقل 5-6 أجنة لكل زجاجة إلى زجاجات الثقافة الزجاجية المتوازنة مسبقا.
ملاحظة: لإعداد ماصة باستور الزجاجية ، قم بقطع فتحة الماصة إلى حجم مناسب لتناسب الأجنة باستخدام قاطع زجاجي ، واحتفظ بها في الإيثانول لتجنب التلوث. اغسل الماصة الزجاجية باستخدام PBS قبل نقل الأجنة. عند نقل الأجنة إلى زجاجة الزرع، تأكد من نقل أقل حجم ممكن من وسط التشريح لتجنب تخفيف EUCM. - ضع الزجاجات في نظام الاستزراع الدوار عند 37 درجة مئوية ، في جو من 5٪ O2 و 5٪ CO2.
- كل يوم من الثقافة، قم بإزالة الزجاجات واحدة تلو الأخرى من الحاضنة لتقييم تطور الجنين تحت المجهر المجسم. تأكد من إغلاق الفتحة الفارغة في الأسطوانة بضربة صلبة عند إزالة زجاجة. قطع طرف ماصة باستور البلاستيكية المعقمة لتناسب حجم الجنين ونقل الأجنة إلى طبق بتري لتسهيل الملاحظة. تأكد من أن الأجنة مغطاة دائما بمتوسط.
ملاحظة: قلل من الوقت الذي تكون فيه الأجنة خارج الحاضنة لتجنب الآثار الضارة في الأجنة بسبب انخفاض درجة حرارة الجسم. تعامل مع الأجنة بعناية لتجنب تمزق الأوعية الدموية في كيس الصفار ، مما يؤثر على بقاء الجنين. - في يوم الاستزراع الأول (أي ما يعادل E8.5) ، قم بنقل مجموعات من 3 أجنة إلى زجاجة جديدة تحتوي على 2 مل من EUCM الطازج والمتوازن مسبقا والذي يحتوي على 3 ملغ / مل إضافية من الجلوكوز D وخليط غاز من 13٪ O2 ، 5٪ CO2.
- بعد 48 ساعة (أي ما يعادل E9.5) ، قم بنقل مجموعات من جنينين إلى زجاجة جديدة مع EUCM طازج مسخن مسبقا بالإضافة إلى 3.5 ملغ / مل من الجلوكوز في جو غازي من 18٪ O2 و 5٪ CO2.
- في 72 ساعة من الزرع (أي ما يعادل E10.5) ، انقل كل جنين إلى زجاجة فردية تحتوي على 1.5-2 مل من الوسط الطازج المكمل ب 4 ملغ / مل من الجلوكوز وإمدادات غاز بنسبة 21٪ O2 و 5٪ CO2.
ملاحظة: تصل الأجنة إلى أقصى نمو لها حوالي منتصف ليل يوم الثقافة 4. - استخدم ملقط ناعم لإزالة كيس الصفار والسلى، وافصل الحبل السري للمراقبة الصحيحة لمورفولوجيا الجنين. قم بإيقاف تشغيل وحدة تنظيم الغاز والحاضنة الدقيقة.
ملاحظة: قم بموازنة وسط المزرعة مسبقا لمدة 1 ساعة عن طريق الحضانة داخل زجاجة زجاجية في مزرعة الأسطوانة مع جو غاز مناسب وفقا لمرحلة الجنين. نظف زجاجات الاستزراع وجميع الأواني الزجاجية الحاضنة بعد كل استخدام عن طريق إجراء ثلاث غسلات بالماء المقطر الجاري يليها غسل ليلي مغمور بالإيثانول بنسبة 70٪. أعد الغسيل ثلاث مرات بالماء المقطر الجاري ، واترك الزجاجات تجف بين عشية وضحاها ، وقم بالتعقيم بواسطة الأوتوكلاف. وبالمثل ، قم بتعقيم مقابس السيليكون بانتظام. نظف جميع أدوات التشريح جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول وقم بتعقيمها جافا.
4. زراعة الأجنة الموسعة من E5.5 / E6.5 إلى E11
- زراعة الأجنة قبل المعدة (E5.5) والمعدة المبكرة (E6.5) حتى مرحلة السوميت المبكرة (E8.5) في لوحات ثابتة.
- قم بالتوازن المسبق لوسط التشريح لمدة 1 ساعة في حاضنة مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: للسماح بتبادل الغازات، لا تغلق غطاء الأنبوب تماما. - قم بإعداد أطباق الثقافة عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من EUCM الطازج إلى كل بئر. ضع الألواح داخل حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية للتوازن المسبق.
ملاحظة: على الرغم من أن لوحات 8 آبار مناسبة تماما لنمو الجنين ، إلا أنه يمكن إجراء الزراعة في أي صفيحة أخرى عن طريق ضبط حجم الوسط وفقا لحجم اللوحة. - تشريح أجنة أسطوانة البيض خارج الرحم باتباع التقنية الموصوفة ل E7.5. قم بإزالة كيس الصفار الجداري للجنين واترك المخروط المشيمي الخارجي السليم المتصل بأسطوانة البيض.
- انقل الأجنة الفردية إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 8 آبار باستخدام ماصة دقيقة وضع اللوحة داخل الحاضنة مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
- صور الأجنة تحت المجهر المجسم واختر للزراعة فقط تلك التي لديها تجويف أمنيوسي جيد التكوين ، دون أي ضرر واضح وبدون غشاء رايشرت.
ملاحظة: استخدم أطراف ماصة 20 ميكرولتر لنقل أجنة E5.5 ونصائح 200 ميكرولتر لنقل أجنة E6.5. في حالة الثقافات التي تبدأ من E6.5 ، يمكن استبدال HCS ب HBS التي تم جمعها حديثا. - قم بإزالة نصف الوسط وإضافة 250 ميكرولتر من EUCM الطازج قبل التسخن بعد 24 ساعة من الزرع ، مما يضمن غمر الأجنة دائما في وسط الزرع. في حالة الثقافات التي تبدأ من E5.5 ، بعد يومين من الثقافة (أي ما يعادل E7.5) ، قم بإزالة 200 ميكرولتر وإضافة 250 ميكرولتر من EUCM الجديد.
ملاحظة: أثناء الزراعة الثابتة، قد تلتصق الأجنة بالصفيحة (بشكل رئيسي عند استخدام الألواح البلاستيكية)، مما سيضر بشدة بنمو الجنين. يكون ربط الجنين باللوحة أكثر تواترا في اليوم الأول من زراعة أجنة E5.5. لمنع التعلق، ادفع الأجنة بعناية بعيدا عن سطح الصفيحة باستخدام ملقط ناعم ومعقم. تحقق من أن المخروط المشيمي الخارجي فقط يبقى متصلا بسطح اللوحة. - نقل الأجنة إلى مزرعة الأسطوانة في مرحلة السوميت المبكرة (4-7 سوميت ؛ بعد ثلاثة أيام من الثقافة للأجنة المزروعة في E5.5 ويومين للمزارع بدأت في E6.5) ، بعد نفس المؤشرات الموصوفة سابقا لأجنة المرحلة E8.5.
ملاحظة: يؤدي نقل الأجنة إلى مزرعة الأسطوانة في مراحل سوميت مختلفة عما هو موضح أعلاه إلى فشل المزيد من التطور. على النقيض من مزارع E7.5 خارج الرحم ، من الممكن الحفاظ على الأجنة في جو ثابت من 21٪ من الأكسجين و 5٪ CO2 ، مما يوفر كفاءة أعلى قليلا لتطوير الجنين من الأجواء ذات تركيز الأكسجين الديناميكي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تدعم ظروف زراعة الأسطوانة الموصوفة للأجنة E7.5 (مرحلة أواخر المعدة) نمو الجنين المستمر والطبيعي بمتوسط كفاءة يقترب من 75٪ بعد 4 أيام من الزراعة (الشكل 2 والجدول 1). قد تختلف كفاءة نمو الجنين عبر الخلفيات الوراثية المتنوعة للفئران ولكنها قوية باستمرار (الشكل 2C). المكملات الغذائية مع HBS بدلا من HCS تعطي كفاءة ~ 68 ٪ بعد 4 أيام من ثقافة خارج الرحم ، وهذا يتوقف على الخلفية الوراثية للفئران (الشكل 2D و...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن لبروتوكول الاستزراع المقدم هنا الحفاظ على التطور السليم والمستمر لجنين الفئران خارج الرحم لمدة تصل إلى ستة أيام ، من E5.5 إلى E11. في السابق، كانت الأجنة في مراحل النمو هذه تتطور بشكل طبيعي في الثقافة فقط لفترات قصيرة (تصل إلى 48 ساعة)15. يعد اقتران وحدة تنظيم الغاز بحاضنة زراعة الأسطوانة للتحكم الدقيق في تركيز الأكسجين وضغط الغاز عالي الضغط أمرا بالغ الأهمية لزراعة أجنة الفئران المناسبة الموضحة هنا. إن زيادة ضغط الغاز إلى 7 رطل لكل بوصة مربعة يعزز انتشار الأكسجين ، مما يسمح بتطور ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
J.H.H هو مستشار لشركة Biological Industries Ltd وقدم طلب براءة اختراع يغطي ظروف الثقافة الدوارة والثابتة الموضحة هنا (قدمها J.H.H. ومعهد وايزمان للعلوم). مؤلفون آخرون يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل باسكال وإيلانا مانتو. مجلس البحوث الأوروبي (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety) ؛ مجلس البحوث الطبية لمضيفات الطيران (FAMRI) ؛ أستاذية الصندوق الإسرائيلي لأبحاث السرطان (ICRF) ، BSF ، معهد هيلين ومارتن كيميل لأبحاث الخلايا الجذعية ، جائزة هيلين ومارتن كيميل للتحقيق المبتكر ؛ مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF)، مينيرفا، معهد شيرمان للكيمياء الطبية، مركز نيلا وليون بينوزيو للأمراض العصبية، مركز عائلة ديفيد وفيلا شيبيل لأبحاث الاضطرابات الوراثية، معهد كيكست العائلي لعلم الوراثة الطبية، صندوق أبحاث الخلايا الجذعية للدكتور بيث روم-رايمر، مؤسسات إدموند دي روتشيلد، مؤسسة زانتكر الخيرية، مزرعة زفيا زيروني.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.22 وميكرو ؛ مرشح حجم المسام (250 مل) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 & micro ؛ م حقنة بحجم المسام مرشح PVDF | Millipore | SLGV033RS | |
| 8 آبار وألواح صغيرة قاع زجاجي / ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| زجاجة مع غطاء محول لمدخل الغاز | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. هندسة ، كولوم ستار الهندسة الدقيقة | BTC 06 | تستخدم لإغلاق الزجاجات بالأسطوانة |
| Bungs (صلبة) | B.T.C. الهندسة ، كولوم ستار الهندسة الدقيقة | BTC 07 | تستخدم لإغلاق زجاجات الثقافة الدوارة الأسطوانة |
| B.T.C. الهندسة ، كولوم ستار الهندسة الدقيقة | BTC 03 / BTC 04 | إما زجاجات زجاجية (صغيرة) BTC 03 أو زجاجات زجاجية (كبيرة) BTC 04 | |
| D (+) - جلوكوز مونوهيدرات | جي تي بيكر | ||
| سكين ماسي | أدوات العلوم | الدقيقة 10100-30 / 45 | |
| مقياس الضغط الرقمي | شنغهاي Benxu Electronics Technology Co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological Industries | 02-020-1A | |
| مصل الأبقار الجنيني | الصناعات البيولوجية | 04-013-1A | |
| وحدة تنظيم الغاز | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| جلوتاماكس | جيبكو | 35050061 | الجلوتامين |
| Graefe | أدوات العلوم الدقيقة | 11052-10 | |
| ملقط HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| الجراحة المجهرية (دومون # 5 ، # 55) | أدوات العلوم الدقيقة | 11255-20 | |
| ماصات باستور (زجاج) ماصات | هيلجنبرغ | 3150102 | |
| باستور (بلاستيك) | Alexred | SO P12201 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | الصناعات البيولوجية | 03-031-1B | |
| أطباق بتري (60 مم و 100 مم) | Falcon | 351007 / 351029 | |
| نظام حاضنة دقيق | B.T.C. هندسة ، نموذج Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 مع مجموعة فقاعات الغاز |
| اختبار معقمة Pro-coagulant (5 مل) | Greiner Bio-One | # 456005 | |
| مصل زراعة الجنين الكامل للجرذ | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| مجهر مجهر مجسمة مزود بلوحة تسخين | محاقن نيكون | SMZ18 | |
| معقمة (5 ، 10 مل) لترشيح المصل | مقص جراحي لحل | ||
| أدوات العلوم | الدقيقة 14094-11 |
المراجع
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969(2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
