مقالة منهجية

التعرف على مصدر البروتينات المفرزة في الكلى عن طريق حقن بريفيلدين أ

DOI:

10.3791/63178

⸱

نوفمبر 10, 2021

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تحديد نوع الخلية المسؤولة عن إفراز السيتوكينات أمرا ضروريا لفهم البيولوجيا المرضية لأمراض الكلى. هنا ، نصف طريقة لتلطيخ أنسجة الكلى كميا للسيتوكينات التي تنتجها الخلايا الظهارية أو الخلالية الكلوية باستخدام بريفيلدين أ ، مثبط إفراز ، وعلامات خاصة بنوع الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد مرض الكلى المزمن (CKD) أحد الأسباب العشرة الرئيسية للوفاة في الولايات المتحدة الأمريكية. إصابة الكلى الحادة (AKI) ، على الرغم من أنها غالبا ما تكون قابلة للشفاء ، إلا أنها تهيئ المرضى للإصابة بمرض الكلى المزمن في وقت لاحق من الحياة. تم تحديد الخلايا الظهارية للكلى على أنها عقد إشارات رئيسية في كل من AKI و CKD ، حيث يمكن للخلايا تحديد مسار المرض من خلال إفراز السيتوكينات والبروتينات الأخرى. في مرض الكلى المزمن على وجه الخصوص ، أظهرت عدة خطوط من الأدلة أن الخلايا الأنبوبية التي تم إصلاحها بشكل غير قادر على التكيف تدفع تطور المرض من خلال إفراز عامل النمو المحول بيتا (TGF-β) ، وعامل نمو النسيج الضام (CTGF) ، والسيتوكينات الليفية الأخرى. ومع ذلك ، فإن تحديد المصدر والعدد النسبي للبروتينات المفرزة من أنواع مختلفة من الخلايا في الجسم الحي لا يزال يمثل تحديا.

تصف هذه الورقة تقنية باستخدام بريفيلدين أ (BFA) لمنع إفراز السيتوكينات ، مما يتيح تلطيخ السيتوكينات في أنسجة الكلى باستخدام تقنيات الفلورسنت المناعي القياسية. يمنع BFA نقل الشبكة الإندوبلازمية (ER) إلى جهاز جولجي ، وهو أمر ضروري لإفراز السيتوكينات والبروتينات الأخرى. يؤدي حقن BFA قبل 6 ساعات من التضحية إلى تراكم TGF-β و PDGF و CTGF داخل خلايا النبيبات القريبة (PTCs) في نموذج سيسبلاتين الفأر من AKI و TGF-β في نموذج حمض أريستولوتشيك الفأر (AA) من CKD. كشف التحليل أن BFA + cisplatin أو BFA + AA زادت من إشارة TGF-β الإيجابية بشكل ملحوظ مقارنة ب BFA + محلول ملحي أو سيسبلاتين أو AA وحده. تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام BFA لتحديد نوع الخلية التي تنتج سيتوكينات معينة وتحديد الكميات النسبية و / أو الأنواع المختلفة من السيتوكينات المنتجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير التقديرات إلى أن >10٪ من سكان العالم يعانون من شكل من أشكال أمراضالكلى 1. يتم تحديده من خلال ظهوره السريع ، AKI قابل للشفاء إلى حد كبير. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي نوبة AKI إلى تهيئة المرضى للإصابة بمرض الكلى المزمن في وقت لاحق من الحياة2،3. على عكس AKI ، يتميز مرض الكلى المزمن بالتليف التدريجي وتدهور وظائف الكلى ، مما يؤدي إلى مرض كلوي في المرحلة النهائية يتطلب علاجا باستبدال الكلى. تستهدف معظم إصابات الكلى الخلايا الظهارية المتخصصة ، مثل الخلايا البودية أو خلايا النبيبات القريبة ، التي تشكل النيفرون4،5. بعد الإصابة ، تساعد الخلايا الظهارية الباقية على تنسيق استجابة الإصلاح من خلال إفراز السيتوكينات والبروتينات الأخرى. بهذه الطريقة ، يمكن للخلايا الباقية تعديل الاستجابة المناعية ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية المباشرة ، والمساعدة في تعافي الأعضاء.

السيتوكينات هي بروتينات صغيرة مفرزة ضرورية لتعديل نضوج الكائنات متعددة الخلايا ونموها واستجابتها6،7. تعمل كرسل إشارة بين أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الخلايا المناعيةوالظهارية 8. على الرغم من أنه يعتقد أن السيتوكينات تفرز بشكل أساسي بواسطة الخلايا المناعية ، فقد أظهرت الأبحاث طويلة الأمد أن الخلايا الظهارية والخلالية في الكلى تفرز أيضا السيتوكينات كإشارات لخلايا الكلى المقيمة الأخرى ، مثل الخلايا الأنبوبية والخلايا الخلالية والخلايا المناعية9،10. تلعب PTCs ، على وجه الخصوص ، دورا مهما في مرحلة البدء والتعافي بعد AKI11. ومع ذلك ، من المعروف أن PTCs التي تم إصلاحها بشكل غير قادر على التكيف تفرز السيتوكينات الليفية مثل تحويل عامل النمو β (TGF-β) ، وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - D (PDGF-D) ، وعامل نمو النسيج الضام (CTGF) ، مما يساهم في تطور مرض الكلىالمزمن 12. وبالتالي ، تستخدم الخلايا الظهارية في الكلى السيتوكينات المفرزة لتعديل إصابة الكلى.

في حين أنه من المعروف أن الخلايا الظهارية في الكلى تفرز السيتوكينات ، إلا أنه كان من الصعب تحديد المصدر الدقيق والمساهمة النسبية لكل نوع من الخلايا بسبب التحديات التقنية لدراسة البروتينات المفرزة13. يعد قياس التدفق الخلوي ، وهو نهج شائع يستخدم لقياس السيتوكينات ، أمرا صعبا في إجراؤه على الكلى المصابة ، خاصة في الكلى شديدة التليف. مع Cre recombinase مدفوعا بمحفز السيتوكين ، غالبا ما تستخدم الفئران المراسلة السيتوكين لتحديد نوع الخلية التي تعبر عن سيتوكين معين. ومع ذلك ، فإن استخدام الفئران المراسلة محدود بسبب الحاجة إلى عبور الفئران المراسلة إلى خلفيات خروج المغلوب المختلفة ، وعدم وجود مراسلين مناسبين ، وحقيقة أنه يمكن تحليل سيتوكين واحد فقط في كل مرة. وبالتالي ، من الضروري تطوير تقنية بسيطة ومتعددة الاستخدامات وبأسعار معقولة للكشف عن خلايا الكلى التي تطلق السيتوكينات.

افترضنا أن حقن BFA ، وهو مثبط إفراز يمنع نقل الشبكة الإندوبلازمية - جولجي في الجسم الحي سيسمح بتلوين البروتينات المفرزة في أنسجة الكلى (الشكل 1 أ ، ب) ، كما هو موضح في المقايسات القائمة على قياس التدفقالخلوي 14،15. جنبا إلى جنب مع الصانعين الخاصين بنوع الخلية ، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد المصدر والمساهمة النسبية للخلايا المنتجة للسيتوكينات في الكلى المصابة. على عكس عينات قياس التدفق الخلوي ، يمكن الاحتفاظ بالأنسجة الثابتة على المدى الطويل مع الحفاظ على البروتينات والهياكل الخلوية ، مما يسمح بإجراء فحص أكثر شمولا للخلايا الإفرازية. لاختبار هذه الفرضية ، أصيبت كلى الفئران بنموذج AKI (سيسبلاتين) ونموذج من CKD (اعتلال الكلية بالحمض الأريستولوتشيك (AAN)) ، تم حقنها ب BFA ، وتلطيخها باستخدام تقنيات الفلورسنت المناعي القياسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب على وفقا لبروتوكول استخدام المعتمد من قبل لجنة رعاية المؤسسية والمستخدم في المركز الطبي بجامعة فاندربيلت.

1.

  1. استخدم ذكور BALB / c البالغة من العمر 8-12 أسبوعا (وزن الجسم: حوالي 25 جم) لاعتلال الكلية الناجم عن حمض السيسبلاتين أو الحمض الأريستولوتشيك.
  2. تأكد من أن الفئران تتمتع بصحة جيدة وليس لديها علامات واضحة على الضيق أو الجروح الناتجة عن القتال.
    ملاحظة: يمكن أن تتداخل الجروح ، خاصة في الذيل ، مع البروتوكول الموضح هنا. تم اختيار الفئران BALB / c لأنه من الأسهل تصور وريد الذيل للحقن في هذه الفئران. يعمل البروتوكول الموصوف هنا مع سلالات الفئران الأخرى. ومع ذلك ، قد تختلف جرعة سيسبلاتين أو حمض الأريستولوتشيك من سلالة إلى أخرى.

2. حقن سيسبلاتين

  1. قم بإذابة السيسبلاتين في محلول ملحي معقم إلى تركيز نهائي يبلغ 1 مجم / مل.
    ملاحظة: لن يذوب سيسبلاتين تماما في درجة حرارة الغرفة. يجب التعامل معها في غطاء الدخان.
  2. قم بتسخين محلول السيسبلاتين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ودوامة بشكل متكرر حتى يذوب السيسبلاتين تماما.
  3. قم بوزن الفئران وحساب حجم محلول سيسبلاتين اللازم لحقن 20 مجم / كجم من وزن الجسم (وزن الجسم).
  4. تطهير جلد البطن باستخدام مسحات بوفيدون اليود (7.5٪) والكحول (70٪) بالتناوب 3 مرات لكل منهما.
  5. باستخدام حقنة الأنسولين بإبرة 25 جم ، قم بحقن محلول السيسبلاتين داخل الصفاق.
  6. انتقل إلى القسم 4 في اليوم 3 بعد الحقن.

3. حقن حمض الأريستولوتشيك (AA)

  1. قم بإذابة حمض الأريستولوتشيك-I في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بتركيز نهائي يبلغ 0.5 مجم / مل.
    ملاحظة: يجب التعامل مع AA في غطاء الدخان. يجب استخدام AA-I لأنه الشكل السائد الذي يسبب إصابة الكلى.
  2. قم بتسخين محلول AA في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ودوامة بشكل متكرر حتى يذوب تماما.
  3. قم بوزن الفئران واحسب حجم محلول AA لحقن 5 مجم / كجم من وزن الجسم.
  4. تطهير جلد البطن باستخدام بوفيدون اليود (7.5٪) والكحول (70٪) مسحة 3x.
  5. باستخدام حقنة الأنسولين بإبرة 25 جم ، قم بحقن محلول AA داخل الصفاق
  6. حقن AA كل يومين لما مجموعه 3 حقن.
  7. انتقل إلى القسم 4 في اليوم 42 بعد الحقن الأخير.

4. تحضير محلول BFA

  1. قم بإذابة BFA في ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 10 مجم / مل لعمل محلول مخزون.
  2. قم بتخزين محلول المخزون عند -20 درجة مئوية.
  3. تمييع محلول مخزون BFA باستخدام PBS معقم عند تركيز العمل النهائي البالغ 1.25 مجم / مل
    ملاحظة: قم بإعداد محلول عمل جديد في كل مرة مباشرة قبل الحقن.

5. حقن الوريد الذيل من BFA

  1. قبل الحقن ، ضع نصف القفص ، ونصفه من وسادة التدفئة لمدة 10 دقائق للتأكد من دفء الفئران لمنع انخفاض درجة حرارة الجسم ، مما قد يتسبب في تضيق الأوعية الدموية في الذيل والتداخل مع الحقن.
    ملاحظة: ضع القفص على وسادات التدفئة بحيث يكون نصف القفص على الوسادة بينما لا يكون النصف كذلك. بهذه الطريقة ، عندما تشعر الفئران بالدفء ، يمكنها الانتقال إلى الجانب الآخر من القفص والعكس صحيح.
  2. كبح جماح الفئران باستخدام أجهزة التقييد المتاحة تجاريا بالحجم المناسب.
  3. تطهير الذيل باستخدام بوفيدون اليود ومسحة الكحول ثلاث مرات كما هو موضح أعلاه.
  4. أمسك الذيل أفقيا وتصور عروق الذيل الجانبية (الشكل 1 ج). استخدم مصدر ضوء أسفل الذيل للمساعدة في تصور الأوردة.
  5. أدخل إبرة 28 جم ، مع الحفاظ على الإبرة والحقنة موازية للوريد باتجاه الرأس.
  6. حقن 200 ميكرولتر من محلول BFA 1.25 ملغم/مل (0.25 مجم BFA). انتظر حتى يصبح الوريد واضحا حيث يتم استبدال الدم بمحلول الحقن ، مما يشير إلى نجاح الحقن.
  7. قم بإزالة الإبرة واضغط على الذيل برفق حتى يتوقف النزيف.
  8. أعد الفئران إلى القفص وراقبها بحثا عن نزيف إضافي أو علامات الضيق.

6. التضحية وحصاد الكلى

  1. قتل الفئران بجرعة زائدة من الأيزوفلوران متبوعا بخلع عنق الرحم بعد 6 ساعات من حقن BFA.
    ملاحظة: تم اختيار النقطة الزمنية التي تبلغ 6 ساعات بناء على الأدبيات التي توضح أن 6 ساعات من علاج BFA في الأعضاء الأخرى تسمح بتراكم كاف من السيتوكينات داخل الخلايا لتصورها عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي16.
  2. مباشرة بعد التضحية ، قم بتعريض بطن وقلب الفأر عن طريق شق خط الوسط البطني.
  3. اجمع 100-500 ميكرولتر من الدم لفحص نيتروجين اليوريا في الدم (BUN) عن طريق ثقب القلب. استخدم إبر 25 جم مع محاقن الأنسولين سعة 1 مل لجمع الدم. لمنع التخثر ، أضف 5 ميكرولتر من محلول الهيبارين (100 مجم / 15 مل من dH2O) إلى كل عينة.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 20 ميكرولتر من الدم لاختبار BUN. ومع ذلك ، يمكن جمع ما يقرب من 500 ميكرولتر عن طريق ثقب القلب بعد القتل الرحيم ، والذي يمكن أن يكون مفيدا للمقايسات الأخرى. اجمع أكبر قدر ممكن من الدم.
  4. قم بتخزين عينات الدم على الثلج حتى يتم جمع الكلى في القسم 7 أدناه.
    1. الطرد المركزي لعينات الدم عند 1,300 × جم لمدة 10 دقائق.
    2. اعزل البلازما برفق وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لإجراء اختبار BUN في القسم 17 أدناه. بدلا من ذلك ، قم بتخزين عينات البلازما لمقايسات الكرياتينين.

7. نضح وإزالة الكلى

  1. قم ببث الماوس ب 10-20 مل من PBS من خلال البطين الأيسر باستخدام حقنة سعة 20 مل بمعدل تدفق 2-4 مل / دقيقة حتى يصبح الإنفوز واضحا.
  2. قم بإزالة الكلى عن طريق إمساك الشريان الكلوي والوريد بالملقط بالقرب من الحليمة وقطع الأوعية على الجانب بعيدا عن الكلى.
  3. قم بإزالة كبسولة الكلى برفق عن طريق تقشيرها يدويا أو باستخدام ملقط ناعم ومعقم.
  4. اعتمادا على الجسم المضاد ، انتقل إلى القسم 8 لتحضير الأنسجة الثابتة المضمنة في البارافين أو القسم 10 لتحضير الأنسجة المجمدة الثابتة.
    ملاحظة: ستحتاج معالجة الأنسجة إلى الأمثل لكل جسم مضاد لاستخدامه في التلوين.

8. الأنسجة المدمجة في البارافين لتلوين TGF-β و PDGF-D

  1. قم بتقسيم الكلية عن طريق وضعها على شريحة زجاجية نظيفة وقطعها أفقيا بشفرة حلاقة جديدة. ضع نصفا في 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS لمدة 24 ساعة على دوار طرف على طرف بسرعة 10 دورات في الدقيقة (دورة في الدقيقة).
    ملاحظة: الكلية بأكملها ليست ضرورية للتقسيم. يمكن تخزين نصف الكلى أو استخدامها في فحوصات أخرى.
  2. استبدل PFA بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  3. أرسل نصف الكلى للمعالجة وتضمين البارافين في هذه المرحلة ثم قم بتقسيم أنسجة الكلى المضمنة في البارافين عند 4-6 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم وقم بتثبيتها على شرائح مشحونة ونظيفةمسبقا 17،18.
    ملاحظة: تمت معالجة الكلى ودمجها في البارافين بواسطة المورد المشترك لعلم الأمراض الانتقالي التابع للمركز الطبي بجامعة فاندربيلت وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.

9. إزالة البارافين والإماهة

  1. ضع الشرائح في رف تلطيخ منزلق واغمسها في بئر تلطيخ يحتوي على D-limonene لمدة 5 دقائق ، مع التأكد من غمر الأنسجة بالكامل. كرر في بئر يحتوي على D-Limonene الطازج.
  2. أعد ترطيب الأنسجة عن طريق غمس الشرائح في تخفيفات متسلسلة من الإيثانول 100٪ (2x) و 95٪ و 90٪ و 70٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  3. اغسل الشرائح في dH2O المتدفق لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق احتضان الأقسام في عازلة السترات (درجة الحموضة 6.0) في قدر الضغط عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 45 دقيقة.
  5. اغسل الشرائح في درجة حرارةمتدفقة 2درجة حرارة لمدة 20 دقيقة.
  6. انتقل إلى القسم 12.

10. تحضير الأنسجة المجمدة لتلوين CTGF

  1. قم بتقسيم الكلية على طول المحور الأفقي باستخدام شفرة حلاقة جديدة.
    ملاحظة: الكلية بأكملها ليست ضرورية للتقسيم. يمكن تخزين نصف الكلى أو استخدامها في فحوصات أخرى.
  2. ضع نصف الكلى في 10 مل من 0.5٪ PFA في أنبوب 15 مل على دوار لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية بسرعة 10 دورة في الدقيقة.
  3. صب PFA في وعاء للتخلص منه بشكل صحيح وأضف 10 مل من 0.1 M glycine في PBS لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية بسرعة 10 دورة في الدقيقة.
  4. صب الجلايسين ، وأضف 10 مل من السكروز المذاب بنسبة 15٪ في PBS ، وضع الأنبوب على دوار طوال الليل عند 4 درجات مئوية و 10 دورات في الدقيقة.
  5. صب السكروز بنسبة 15٪ واستبدلها ب 10 مل من السكروز المذاب بنسبة 30٪ في PBS لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية و 10 دورات في الدقيقة.
  6. املأ قالب التضمين بمركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) وقم بتضمين نصف الكلية من الخطوة 10.5 بحيث يكون السطح المقطوع للكلية متجها لأسفل.
  7. ضع القالب الذي يحتوي على نصف الكلية و OCT بعناية في بركة من النيتروجين السائل لتجميده.
    ملاحظة: لا تدع النيتروجين السائل يتصل مباشرة ب OCT لأن هذا قد يؤدي إلى تكوين فقاعة. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند استخدام النيتروجين السائل ، مثل النظارات الواقية / واقي الوجه والقفازات المبردة ومعطف المختبر. من الأفضل استخدام ملقط طويل ~ 25 سم لوضع القوالب في النيتروجين السائل.
  8. بمجرد تجميده صلبا ، قم بتخزين القالب عند -80 درجة مئوية.

11. التقسيم المجمد

  1. تأكد من أن ناظم البرد عند -20 درجة مئوية.
  2. قم بتخزين القوالب التي تحتوي على عينات في OCT في ناظم البرد عند -20 درجة مئوية لمدة ساعتين لموازنة درجة الحرارة.
  3. قم بإزالة القالب عن طريق الضغط على الألسنة والضغط من الأسفل.
  4. ضع OCT الطازج على حامل العينة وضع كتلة العينة المجمدة في الأعلى ، بحيث يكون جانب الأنسجة متجها بعيدا عن حامل العينة.
  5. ضع حامل العينة والعينة على رف التجميد.
  6. ضع مستخرج حراري مرجح أعلى الكتلة لتسطيح السطح. احتفظ بغطاء ناظم البرد مغلقا عند عدم استخدامه لمنع تقلبات درجات الحرارة.
  7. بمجرد تجميد OCT الطازج بين كتلة العينة وحامل العينة ، تحقق للتأكد من أن الاتصال آمن.
  8. قم بتثبيت حامل العينة على رأس ناظم الكريوستات.
  9. ابدأ في التقسيم حتى يصبح النسيج مرئيا في كتلة العينة.
  10. قم بتقسيم أنسجة الكلى عند 4-6 ميكرومتر والتقط الأقسام على شريحة مشحونة بدرجة حرارةالغرفة 19.
  11. بمجرد التقاط المنديل ، قم بتخزين الشريحة عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتلطيخ. لا تدعه يذوب حتى يصبح جاهزا لبدء تلطيخه.
  12. قبل التلوين ، قم بإزالة الشريحة (الشريحة) من التخزين واتركها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة. لا تدع الأقسام تجف.
  13. بمجرد وصولك إلى درجة حرارة الغرفة ، اغسل الأقسام على الفور باستخدام PBS لمدة 5 دقائق مرتين في درجة حرارة الغرفة للتخلص من مركب OCT.
  14. انتقل إلى القسم 12.

12. تلطيخ التألق المناعي

  1. حدد أقسام الأنسجة بقلم تحديد حاجز مسعور. حافظ على مسافة لا تقل عن 5 مم من الأنسجة إلى مخطط الحاجز الكارهة للماء.
  2. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على مصل الحمير 3٪ و 0.1٪ تريتون في 1٪ من الألبومين البقري / محلول ملحي مخزن (TBS) أعلى القسم واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
  3. تمييع الأجسام المضادة الأولية باستخدام PBS بالتركيز المناسب. للكشف عن السيتوكينات ، استخدم 50 ميكرولتر من محاليل الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد TGF-β1 (1: 200) و PDGF-D (1: 400) و CTGF (1: 200). لوضع العلامات على الخلايا الليفية العضلية ، استخدم 50 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي الموجه ضد أكتين العضلات الملساء ألفا (α-SMA) المقترن ب Cy3 عند 1: 200.
  4. قم بإزالة محلول الانسداد وإضافة الأجسام المضادة الأولية إلى القسم ، مع التأكد من عدم تسربه من المخطط الدائري الكارهة للماء واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة. أعد تطبيق الحاجز الكارهة للماء في حالة حدوث تسرب.
  5. اغسل 3 مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
  6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة عند 1: 200 باستخدام PBS.
  7. احتضان العينات ب 50 ميكرولتر من محاليل الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
  8. يغسل مع PBS لمدة 5 دقائق.
  9. مخفف اللوتس رباعي اللوتس (LTL) مترافق مع الفلورسين في PBS مع Ca2+ و Mg2+ بتركيز 10 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: Ca2+ و Mg2+ ضروريان لربط LTL.
  10. احتضان الأنسجة ب 50 ميكرولتر من محلول LTL لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
  11. يغسل باستخدام PBS مع Ca2+ و Mg2+ لمدة 5 دقائق.
  12. احتضن مع 50 ميكرولتر من 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، 5 ميكروغرام / مل في الماء) لتلطيخ الحمض النووي / النوى لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. قم بتركيب الغطاء عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من كاشف التثبيت المضاد للبهتان على المنديل ووضع الغطاء ببطء. انتظر لمدة 24 ساعة حتى يتجمد الكاشف المضاد للبهتان قبل التصوير.
    ملاحظة: يمكن أن يتحلل ربط الليكتين بمرور الوقت ، مما يؤدي إلى فقدان الإشارة. من الأفضل تصوير عينات ملطخة بالليكتين بعد فترة وجيزة من إعداد كاشف التثبيت. إذا لوحظ فقدان الإشارة ، يمكن إضافة Ca2+ و Mg2+ إلى كاشف التثبيت للحفاظ على التلوين.

13. الحصول على الصور

  1. قم بتشغيل المجهر المقلوب (انظر جدول المواد) باستخدام مرحلة XY الآلية.
  2. حدد هدف 20x.
  3. افتح برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد).
  4. انقر فوق Live لفتح نافذة العرض المباشر.
  5. ابحث عن قسم المناديل وتأكد من تركيزه.
  6. انقر فوق قائمة Acquisition وحدد Scan Large Image.
  7. في نافذة Scan Large Image (مسح الصورة الكبيرة )، قم بإعداد المنطقة المراد مسحها ضوئيا عن طريق تحريك المسرح باستخدام عصا التحكم إلى الجزء الموجود في أقصى اليسار من قسم الأنسجة والنقر فوق السهم الأيسر. كرر ذلك لأجزاء الأنسجة العلوية واليمينية والسفلية.
  8. انقر فوق قائمة الاستحواذ .
  9. تأكد من تحديد خانة الاختيار الخاصة بالصورة الكبيرة.
    1. إذا كنت تلتقط صورا متعددة القنوات ، فانقر فوق علامة التبويب Lambda .
    2. انقر فوق كل قناة واضبط وقت التعرض على مستوى يكون فيه التلوين واضحا دون تشبع أي جزء من الصورة.
      ملاحظة: يجب أن تكون هذه الإعدادات متسقة داخل مجموعة تجريبية واحدة. سيؤدي تغيير إعدادات الاكتساب بين العينات إلى نتائج غير دقيقة.
    3. كرر الخطوة 9.2 لكل قناة سيتم جمعها.
  10. انقر فوق مسح.

14. تحليل الصور

  1. افتح برنامج الحصول على الصور.
  2. انقر فوق ملف | افتح الصورة وحددها.
  3. انقر بزر الماوس الأيمن فوق نافذة الصورة واختر منطقة الاهتمام متعددة الأضلاع (ROI).
  4. حدد الخطوط العريضة لعائد الاستثمار باستخدام الأداة اليدوية . حدد الخطوط العريضة لخلايا النبيبات الإيجابية LTL أو الخلايا الخلالية الإيجابية α SMA.
  5. انقر فوق علامة التبويب القياس | عتبة.
  6. قم بإعداد الحدود العليا والدنيا للحد عن طريق ضبط أشرطة التمرير على جانبي منطقة الإشارة الموجبة.
  7. انقر فوق علامة التبويب عائد الاستثمار .
  8. انقر فوق أيقونة التصدير لحفظ القيم. استخدم برنامج جداول البيانات لحساب النسبة المئوية لمنطقة الإشارة الإيجابية / منطقة عائد الاستثمار.

15. البديل: تحليل الصور باستخدام البرمجيات الحرة (ImageJ)

  1. افتح ImageJ.
  2. انقر فوق ملف | افتح لعرض صورة.
  3. انقر فوق التحديدات اليدوية.
  4. حدد عائد الاستثمار من خلال الخطوط العريضة باستخدام الأداة اليدوية . حدد الخطوط العريضة لخلايا النبيبات الإيجابية LTL أو الخلايا الخلالية الإيجابية α SMA.
  5. انقر على تعديل القائمة وحدد مسح في الخارج.
  6. انقر فوق تحليل وحدد قياس لتحديد منطقة عائد الاستثمار.
  7. الانتقال إلى الصورة | اللون | تقسيم القنوات.
  8. اضبط الحدود العليا والسفلية للعتبة لاكتشاف منطقة الإشارة الموجبة.
  9. انقر فوق تحليل وحدد قياس.
  10. احفظ البيانات.
  11. افتح البيانات باستخدام برنامج جداول البيانات واحسب نسبة منطقة الإشارة الإيجابية / منطقة عائد الاستثمار.

16. اختياري: التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر

ملاحظة: للحصول على صور عالية الدقة للنشر ، يوفر الفحص المجهري متحد البؤر المسح صورا أكثر وضوحا وخلفية أقل في أنسجة الكلى.

  1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر (انظر جدول المواد).
  2. حدد هدف 40x (راجع جدول المواد).
  3. انقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع وابحث عن الأنسجة عن طريق ضبط التركيز.
  4. انتقل إلى علامة التبويب "اكتساب "، وانقر فوق القنوات، واختر 1 وحدة فلكية في إعداد الثقب.
  5. اضبط شدة كسب الليزر في كل قناة بحيث تكون الإشارة الموجبة مرئية ولكنها غير مشبعة. تأكد من أن الإعدادات داخل مجموعة من العينات التجريبية تظل ثابتة.
  6. انقر فوق Snap واحفظ الصورة بالتنسيق المطلوب.

17. مستوى BUN البلازما

  1. قم بإزالة العينات من -20 درجة مئوية وإذابة الثلج على الجليد.
  2. خفف البلازما ب dH2O بنسبة 1:10.
  3. لكل عينة ، قم بإعداد ثلاثة تفاعلات منفصلة في نسختين في صفيحة مكونة من 96 بئرا.
    1. للعينة بالإضافة إلى المعيار ، أضف 5 ميكرولتر من 200 مجم / ديسيلتر من اليوريا و 20 ميكرولتر من البلازما المخففة.
    2. للعينة وحدها ، أضف 5 ميكرولتر من dH2O و 20 ميكرولتر من البلازما المخففة.
    3. للعينة الفارغة ، أضف 5 ميكرولتر من dH2O و 20 ميكرولتر من البلازما المخففة.
  4. امزج 85 ميكرولتر من الكاشف + 1 ميكرولتر من اليورياز لكل عينة لتحضير محلول العمل.
  5. أضف 80 ميكرولتر من محلول العمل إلى آبار "العينة بالإضافة إلى المعيار" و "العينة وحدها".
  6. أضف 80 ميكرولتر من الكاشف (بدون يورياز) إلى بئر "العينة الفارغة" من الخطوة 17.3 أعلاه.
  7. اضغط على الطبق برفق لخلطه واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. اقرأ OD560 باستخدام قارئ لوحة.
  9. احسب تركيز اليوريا Eq (1) وقم بتحويله إلى BUN باستخدام المعادلة (2).
    اليوريا (ملغم/ديسيلتر) = (العينة وحدها - العينة فارغة)/(العينة القياسية وحدها) × (قياسي/4) × (عامل التخفيف) (1)
    BUN (ملغم/ديسيلتر) = تركيز اليوريا/2.14 (2)
    ملاحظة: يقيس هذا الاختبار محتوى اليوريا (الوزن الجزيئي: 60) في المصل. ومع ذلك ، يشير BUN فقط إلى محتوى النيتروجين في اليوريا (الوزن الجزيئي: 28). وبالتالي ، هناك حاجة إلى تصحيح 2.14 (60/28) لتحويل تركيز اليوريا إلى BUN.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لفحص دور الخلايا الظهارية الأنبوبية في إنتاج السيتوكين بعد AKI الناجم عن السيسبلاتين ، تم حقن السيسبلاتين بتركيز 20 مجم / كجم متبوعا بحقن وريدي 0.25 مجم من BFA في اليوم 3 بعد حقن السيسبلاتين. تم حصاد الكلى بعد 6 ساعات. تم تقطيع الكلى المضمنة في البارافين وتلطيخها ب TGF-β و PDGF-D و CTGF ، وهي السيتوكينات التمثيلية المسؤولة عن إصلاح الأنسجة في AKI. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، لوحظت حويصلات TGF-β + في PTCs المسمى ب LTL في الكلى المعالجة بالسيسبلاتين في وجود BFA. وفي الوقت نفسه ، لم ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المعروف أن PTCs الكلى تنظم AKI و CKD من خلال إفراز TGF-β و TNF-α و CTGF و PDGF وعامل نمو البطانية الوعائية ، بالإضافة إلى العديد من البروتينات الأخرى20،21،22،23. وبالمثل ، تفرز الكبيبات والأنابيب البعيدة والخلايا الظهارية الأخرى للكلى ، وكذلك الخلايا الخلالية ، هذه و / أو البروتينات الأخرى أثناء الإصابة24،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جمعية القلب الأمريكية (AHA): كينسي تاجوتشي ، 20POST35200221 ؛ HHS | المعاهد الوطنية للصحة | المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK): كريج بروكس ، DK114809-01 DK121101-01.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل محاقن الأنسولينBD329654
10 مل حقنةBD302995
2 مل أنبوبفيشر ماركة05-408-138
20 مل حقنةBD302830
25 جم إبرBD305125
28 جم إبرBD329424
96 لوحة بئركورنينج9017
حمض الأريستولوتشيك-Iسيجما-ألدريتشA9461
& ألفا -SMA الأجسام المضادة المترافقة مع Cy3Sigma-AldrichC6198RRID: AB_476856
Blade ل cryostatCL Sturkey. IncDT315R50
ألبومين مصل الأبقار (BSA)  سيجما ألدريتشA7906
بريفيلدينسيجما ألدريتشB6542
سيسبلاتينسيجما ألدريتشP4394
حامض الستريكسيجما ألدريتش791725
مجهر متحد البؤرZEISS& nbsp ؛ أهداف الفحص المجهري متحد البؤر LSM710
ZEISS40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
برنامج متحد البؤرZEISSZEN
كوبلين جرةفيشر Scientific19-4
غطاء زجاجيماركةفيشر 12545F
CryostatLeicaCM1850
CTGF الجسم المضادGenetexGTX124232RRID: AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) Jacksonimmunoresearch711-165-152RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H + L) Jacksonimmunoresearch705-175-147RRID: AB_2340415
DAPISigma-AldrichD9542
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418
قوالب قاعدة يمكن التخلص منهاماركة فيشر22-363-553
مصل حمارجاكسون للأبحاث المناعية017-000-121
EthanolDecon Labs، Inc.2701
ملقطVETUSESD-13
GlycineFisher العلامة التجارية12007-0050
وسادات تسخينكينت العلميةDCT-20
ملح الصوديوم الهيبارينACROS organics41121-0010100 ملغ / 15 مل من dH2O
الغرفة المرطبةInvitrogen44040410يمكن استخدام صندوق بلاستيكي مغطى بورق الألمنيوم كملف غرفة رطبة بديلة.
محاقن الأنسولينBD329461
المجهر المقلوبNIKONEclipse Ti-E2التألق المناعي
KIM-1 الجسم المضادR & DAF1817RRID: AB_2116446
Lemozole (Histo-clear)التشخيص الوطنيHS-200
اللوتس رباعي اللوتس ليكتينناقلاتFL-13212
مجهر الشريحةفيشر العلمية12-550-343
ميكروتومReichertJung 820 II
أحادي اللون CMOS كاميراNIKON& nbsp; DS-Qi-2
طقم جراحي للفأركينت علميINSMOUSEKIT
NIS عناصرنيكون
أهدافNIKONPlan Apo 20x / 0.75مرتبط ب Eclipse Ti-E2 (مجهر مقلوب)
مركب OCTScigen4586
قلم عنقالقلم VectorH-4000
PBS مع الكالسيوم والمغنيسيومCorning21-030-CV
PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم  ؛ Corning21-031-CV
PDGF-D الجسم المضادThermo-Fisher العلمي40-2100
PFAعلم المجهر الإلكتروني15710RRID: AB_2533455
قارئ لوحةPromegaGloMax & reg ؛ اكتشف Microplate Reader4٪ PFA مخفف من 16٪ في PBS.
بوفيدون اليود (بيتادين)أفريو هيلث إل بيNDC 67618-151-17
قدر الضغط  طباخ الطاقة Tristar 8Qt. Plus
كاشف ProLong Gold المضاد للتلاشيInvitrogenP36930
Quantichrom Urea (BUN) Kit IIأنظمة الفحص الحيويDUR2-100
شفرة حلاقة أحادية الحافة لتشريح الكلى (.009 بوصة ، 0.23 مم)أدوات IDL521013
Slide warmerLab Scientific Inc. ،XH-2001
البرمجياتعناصر نيكونNIS
السكروزRPIS24060
TGF-b1 anitbodySigma-AldrichSAB4502954
Tris EDTA bufferCorning46-009-CMRRID: AB_10747473
سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشSLBR6660V
سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشSLBR6660V
TritonSigma-Aldrich9002-93-1
Tween 20Sigma-AldrichP1379
مجهر مشحونة بالزجاج الأبيض ، مقاس 25 × 75 مم ، حواف أرضية ، أزرق بلوري بلوريعلمي1358D
برنامج الحصول على الصور شريحة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 395 (10225), 709-733 (2020).
  2. Canaud, G., Bonventre, J. V. Cell cycle arrest and the evolution of chronic kidney disease from acute kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 30 (4), 575-583 (2015).
  3. Chawla, L. S., Eggers, P. W., Star, R. A., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes. New England Journal of Medicine. 371 (1), 58-66 (2014).
  4. Berger, K., Moeller, M. J. Mechanisms of epithelial repair and regeneration after acute kidney injury. Seminars in Nephrology. 34 (4), 394-403 (2014).
  5. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. The Journal of clinical investigation. 121 (11), 4210-4221 (2011).
  6. Kurts, C., Panzer, U., Anders, H. J., Rees, A. J. The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications. Nature Reviews. Immunology. 13 (10), 738-753 (2013).
  7. Panzer, U., Steinmetz, O. M., Stahl, R. A., Wolf, G. Kidney diseases and chemokines. Current Drug Targets. 7 (1), 65-80 (2006).
  8. Commins, S. P., Borish, L., Steinke, J. W. Immunologic messenger molecules: cytokines, interferons, and chemokines. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 53-72 (2010).
  9. Jaber, B. L., et al. Cytokine gene promoter polymorphisms and mortality in acute renal failure. Cytokine. 25 (5), 212-219 (2004).
  10. Black, L. M., Lever, J. M., Agarwal, A. Renal inflammation and fibrosis: A double-edged sword. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (9), 663-681 (2019).
  11. van Kooten, C., Woltman, A. M., Daha, M. R. Immunological function of tubular epithelial cells: the functional implications of CD40 expression. Experimental Nephrology. 8 (4-5), 203-207 (2000).
  12. Canaud, G., et al. Cyclin G1 and TASCC regulate kidney epithelial cell G2-M arrest and fibrotic maladaptive repair. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
  13. Burton, C. J., Combe, C., Walls, J., Harris, K. P. Secretion of chemokines and cytokines by human tubular epithelial cells in response to proteins. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 14 (11), 2628-2633 (1999).
  14. Ripley, C. R., Fant, J., Bienkowski, R. S. Brefeldin A inhibits degradation as well as production and secretion of collagen in human lung fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3677-3682 (1993).
  15. Kovacs, S. B., Oh, C., Aachoui, Y., Miao, E. A. Evaluating cytokine production by flow cytometry using brefeldin A in mice. STAR Protocols. 2 (1), 100244(2021).
  16. Fujiwara, T., Oda, K., Yokota, S., Takatsuki, A., Ikehara, Y. Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 263 (34), 18545-18552 (1988).
  17. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  18. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58288(2018).
  19. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53179(2015).
  20. Chung, S., et al. TGF-β promotes fibrosis after severe acute kidney injury by enhancing renal macrophage infiltration. JCI Insight. 3 (21), 123563(2018).
  21. Meng, X. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. TGF-β: the master regulator of fibrosis. Nature Reviews. Nephrology. 12 (6), 325-338 (2016).
  22. Kok, H. M., Falke, L. L., Goldschmeding, R., Nguyen, T. Q. Targeting CTGF, EGF and PDGF pathways to prevent progression of kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 10 (12), 700-711 (2014).
  23. Engel, J. E., Williams, E., Williams, M. L., Bidwell, G. L., Chade, A. R. Targeted VEGF (vascular endothelial growth factor) therapy induces long-term renal recovery in chronic kidney disease via macrophage polarization. Hypertension. 74 (5), 1113-1123 (2019).
  24. Liu, B. C., Tang, T. T., Lv, L. L., Lan, H. Y. Renal tubule injury: a driving force toward chronic kidney disease. Kidney International. 93 (3), 568-579 (2018).
  25. de Haij, S., Woltman, A. M., Bakker, A. C., Daha, M. R., van Kooten, C. Production of inflammatory mediators by renal epithelial cells is insensitive to glucocorticoids. British Journal of Pharmacology. 137 (2), 197-204 (2002).
  26. Hong, S., Healy, H., Kassianos, A. J. The emerging role of renal tubular epithelial cells in the immunological pathophysiology of lupus nephritis. Frontiers in Immunology. 11, 578952(2020).
  27. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  28. See, P., Lum, J., Chen, J., Ginhoux, F. A single-cell sequencing guide for immunologists. Frontiers in Immunology. 9, 2425(2018).
  29. Gewin, L., et al. Deleting the TGF-β receptor attenuates acute proximal tubule injury. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (12), 2001-2011 (2012).
  30. Nlandu-Khodo, S., et al. Blocking TGF-β and β-catenin epithelial crosstalk exacerbates CKD. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3490-3503 (2017).
  31. Brooks, C. R., et al. KIM-1-/TIM-1-mediated phagocytosis links ATG5-/ULK1-dependent clearance of apoptotic cells to antigen presentation. EMBO Journal. 34 (19), 2441-2464 (2015).
  32. Kishi, S., et al. Proximal tubule ATR regulates DNA repair to prevent maladaptive renal injury responses. The Journal of Clinical Investigation. 129 (11), 4797-4816 (2019).
  33. Yu, S. M., Bonventre, J. V. Acute kidney injury and maladaptive tubular repair leading to renal fibrosis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (3), 310-318 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة