تحدد الطرق الموضحة هنا إجراء يستخدم لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين بصريا في دائرة ذات صلة سلوكيا في الفئران. يؤدي التحفيز البصري المستمر منخفض التردد لمشابك المهاد اللوزة إلى الاكتئاب على المدى الطويل (LTD). في الجسم الحي ، أدى LTD المستحث بصريا في الفئران ذات الخبرة في الكوكايين إلى التوهين اللاحق للبحث عن المخدرات بدافع جديلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام علم البصريات الوراثي لعكس المرونة العصبية وتثبيط البحث عن الكوكايين في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوضح هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لاستخدام أدوات علم البصريات الوراثي لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين في دوائر المهاد اللوزة لتقليل سلوكيات البحث عن الكوكايين اللاحقة في الفئران. في بحثنا ، وجدنا أنه عندما تقوم الفئران بإعطاء الكوكايين عن طريق الوريد مقترنا بإشارة سمعية بصرية ، فإن نقاط الاشتباك العصبي التي تشكلت عند مدخلات من النواة الوراثية الإنسية للمهاد (MGN) على الخلايا العصبية الرئيسية في اللوزة الجانبية (LA) تصبح أقوى مع تعلم ارتباط الكوكايين. افترضنا أن عكس اللدونة التي يسببها الكوكايين في هذه المشابك من شأنه أن يقلل من سلوك البحث عن الكوكايين بدافع الإشارة. من أجل تحقيق هذا النوع من التعديل العصبي في الجسم الحي ، أردنا إحداث اكتئاب طويل الأجل متشابك (LTD) ، مما يقلل من قوة نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا علم البصريات الوراثي ، والذي يسمح بالتعديل العصبي لدوائر الدماغ باستخدام الضوء. تم التعبير عن opsin oChiEF المثير على محطات MGN قبل المشبكية في لوس أنجلوس عن طريق غرس AAV يحتوي على oChiEF في MGN. ثم تم زرع الألياف الضوئية في لوس أنجلوس وتم نبض ضوء الليزر 473 نانومتر بتردد 1 هرتز لمدة 15 دقيقة للحث على اللدونة التي يسببها الكوكايين LTD وعكسها. ينتج عن هذا التلاعب انخفاض طويل الأمد في قدرة الإشارات المرتبطة بالكوكايين على حث إجراءات البحث عن المخدرات.
المقدمة
يعد تعاطي المخدرات مشكلة صحية عامة خطيرة للغاية في الولايات المتحدة وفي جميع أنحاء العالم. على الرغم من عقود من البحث المكثف ، هناك عدد قليل جدا من الخيارات العلاجية الفعالة 1,2. نكسة كبيرة للعلاج هي حقيقة أن تعاطي المخدرات المزمن يولد ذكريات ترابطية طويلة الأجل بين الإشارات البيئية والدواء نفسه. تؤدي إعادة التعرض للإشارات المتعلقة بالمخدرات إلى استجابات فسيولوجية وسلوكية تحفز استمرار تعاطي المخدرات والانتكاس3. تتمثل الإستراتيجية العلاجية الجديدة في سن علاجات قائمة على الذاكرة تهدف إلى التلاعب بالدوائر المشاركة في تنظيم ارتباطات إشارات الأدوية. في الآونة الأخيرة ، لوحظ أن نقاط الاشتباك ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
كانت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول متسقة مع الإرشادات التي وضعها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. تم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام فئران Sprague-Dawley البالغة والساذجة التي تزن 275-325 جم عند الوصول.
1. بناء غرسات الألياف البصرية وكابلات التصحيح
- تحضير غرسات الألياف البصرية باتباع البروتوكولات المنشورة مسبقا9. استخدمت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول 200 ميكرومتر من الألياف الأساسية (0.5 NA) و Ø1.25 مم متعدد الأوضاع LC / PC الطويق الخزفي ، حجم ثقب Ø230 μm.
- استخدم أداة D....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 1 جدولا زمنيا يوضح ترتيب التجارب. خلال التجارب السلوكية ، يعمل عدد دفعات الكوكايين بالإضافة إلى عدد الاستجابات التي يتم إجراؤها على الرافعة النشطة كمقياس لشدة سلوك البحث عن الكوكايين. وخلال الأيام الأولى من تعاطي الكوكايين ذاتيا، ينبغي أن يزداد عدد الاستجابات النشطة تدريجيا خلال كل يوم اقتناء، قبل أن يستقر خلال الأسبوع الثاني. على العكس من ذلك ، يجب أن تظل استجابات الرافعة غير النشطة منخفضة طوال التجربة بأكملها (الشكل 2 أ). في اليوم الأول من الانقراض .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كما هو موضح أعلاه ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة المهمة لتحقيق النتائج التجريبية المناسبة. من المحتمل أن يكون البروتوكول فعالا فقط في الحيوانات التي تحصل على الإدارة الذاتية للكوكايين بشكل صحيح ، وحتى الآن ، تم اختباره فقط باستخدام المعلمات الموضحة أعلاه. من الممكن تعديل جرعة الكوكايين وجدول التعزيز ومعلمات الإشارات مع تأثير ضئيل على النتائج السلوكية ، باستثناء أن جدول التعزيز من الدرجة الثانية قد يؤدي إلى البحث عن الكوكايين المستقل عن اللوزة الدماغية والذي يمكن أن يقلل من فعالية الإجراء ، على الرغم من أن هذا لم يتم اخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا شيء للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من منح USPHS K01DA031745 (MMT) و R01DA042029 (MMT) و DA035805 (YHH) و F31DA039646 (MTR) و T32031111 (MTR) ووزارة الصحة في ولاية بنسلفانيا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.9٪ سالين | فيشر | NC0291799 | |
| A.M.P.I. عازل التحفيز | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (عبر Roger Tsien) | # 268 | انظر Lin et al. ، 2009 ؛ Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core | Control انظر Lin et al., 2009; نبفي وآخرون ، 2014 | |
| دموع اصطناعية (مرهم بصري) | Covetrus | 70349 | |
| ATP ملح المغنيسيوم | فيشر Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| كلوريد الكالسيوم | فيشر Scientific | C1016 | |
| كلوريد السيزيوم | فيشر 289329 | ||
| السيزيوم هيدروكسيد | فيشر | 516988 | |
| السيزيوم ميثان سولفونات | فيشر Scientific | C1426 | |
| الكوكايين HCl | مركز توريد الأدوية NIDA | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| جهاز التحكم في درجة الحرارة ثنائي القناة | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| أغطية غبار الطويق Thor | Labs | CAPL | أغطية غبار بلاستيكية بيضاء ل 1.25 مم الحلقات |
| الأكمام التزاوج | عدسات دوريك | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25 ، برونزي ، 1.25 مم معرف |
| الحلقات | منتجات الألياف الدقيقة | MM-FER2007C-2300 | & Oslash ؛ 1.25 مم متعدد الأوضاع LC / PC الطويق السيراميك ، & Oslash ؛ 230 & مو م حجم ثقب |
| الألياف البصرية | Thor Labs | FP200URT | 200 & mu ؛ الألياف متعددة الأوضاع m الأساسية (0.5 NA) |
| الألياف البصرية الدوارة المشتركة | Prizmatix | (مطلوبة من أمازون) | قطر 18 مم ، موصل FC-FC |
| لأداة تجريد الألياف Thor | Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield مع DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP ملح الصوديوم | فيشر العلمي | G8877 | |
| حقنة هاميلتون | هاميلتون | 80085 | 10 & حجم L ، مقياس 26 ، 2 بوصة ، نمط نقطة 3 |
| مسدس حراري | للإلكترونيات المتحالفة | 972-6966 | 250 فولت ، 750-800 درجة ؛ F |
| ألياف | الايبوكسي الدقيقة القابلة للشفاء | بالحرارة PFP-353ND-8OZ | |
| الهيبارين | هنري شاين | 55737 | |
| هيبس | سيجما ألدريتش | H3375 | |
| حمض الهيدروكلوريك | فيشر | 219405490 | |
| إيزوفلوران | هنري شاين | 29405 | |
| كيتامين هيدروكلوريك هنري | شاين | 55853 | الكيتامين مادة خاضعة للرقابة ويجب التعامل معها وفقا للإرشادات المؤسسية |
| Lactated Ringer s | Henry Schein | 9846 | |
| الليزر ، السائق ، ومقرنة الليزر إلى الألياف | أنظمة الليزر OEM | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 ميجاوات ، 473 نانومتر ، ليزر الحالة الصلبة الذي يتم ضخه بالصمام الثنائي (خيار واحد) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| مستشعر الضوء | Thor Labs | PM100D | وحدة تحكم عداد الطاقة المدمجة مع شاشة رقمية |
| لاصقة فورية Loctite | Grainger | 5E207 | |
| كبريتات المغنيسيوم | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| مضخم القطب الكهربائي الصغير / | الأجهزة الجزيئية | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| مضخة حاقن دقيق | جهاز هارفارد | 70-4501 | حقنة |
| مزدوجةMicromanipulator | أدوات Sutter | MPC-200 / ROE-200 | |
| مجهر | أوليمبوس | BX51WI | مجهر مستقيم لعلم الفيزيولوجيا الكهربية |
| مجهر أوليمبوس | BX61VS | مجهر مسح ضوئي للشرائح epifluorescent | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| أسمنت أسنان Orthojet ، سائل | Lang Dental | 1504BLK | أسمنت |
| الأسنان الأسود Orthojet ، مسحوق | Lang Dental | 1530BLK | مسحوق معاصر ، أسود |
| بارافورمالديهايد | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| كابلات التصحيح | Thor Labs | FP200ERT | متعدد الأوضاع ، FT030 أنابيب |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| وسادة تلميع | Thor Labs | NRS913 | 9 × 13 بوصة |
| ورق تلميع | Thor Labs | LFG5P | 5 & mu ؛ م حصى |
| تلميع ورقة | Thor Labs | LFG3P | 3 & mu ؛ م حصى |
| تلميع ورقة | Thor Labs | LFG1P | 1 & mu ؛ م حصى |
| تلميع ورقة | Thor Labs | LFG03P | 0.3 & م حصى |
| كلوريد البوتاسيوم | سيجما ألدريتش | P9333 | |
| هيدروكسيد البوتاسيوم | فيشر Scientific | P5958 | |
| ميثان سولفونات البوتاسيوم | فيشر Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | هنري شاين | 24751 | |
| الإدارة الذاتية Chambers / Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| بيكربونات الصوديوم | سيجما ألدريتش | S5761 | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S7653 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما ألدريتش | 1064980500 | |
| الصوديوم L-Ascorbate | سيجما ألدريتش | A7631 | |
| الصوديوم بنتوباربيتال | هنري شاين | 24352 | |
| فوسفات الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S9638 | |
| فوسفوكرياتين الصوديوم | فيشر Scientific | P7936 | |
| بيروفات الصوديوم | سيجما-ألدريتش | P2256 | |
| مسامير آلة الفولاذ المقاوم | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm آلة برغي ، مقلاة ، فيليبس ، A2 الفولاذ المقاوم للصدأ ، عادي ، 3 مم |
| طول محول التجسيم للحلقات | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| السكروز | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| خياطة خيط | أدوات العلوم الدقيقة | 18020-50 | خيط الحرير. الحجم: 5/0 ، القطر: 0.12 مم |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
المراجع
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
